川芎嗪對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究

胡旭光，甘仲霖，張　毅

(1. 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,四川 瀘州 646000；3. 四川省成都市第三人民醫(yī)院蒲江醫(yī)院蒲江縣人民醫(yī)院，四川 蒲江 611630)

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川芎嗪對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究

胡旭光1，甘仲霖2，張毅3

(1. 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,四川 瀘州 646000；3. 四川省成都市第三人民醫(yī)院蒲江醫(yī)院蒲江縣人民醫(yī)院，四川 蒲江 611630)

[摘要]目的探討川芎嗪對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨細胞增殖與凋亡的影響及其作用機制。方法選取12只兔建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型，體外分離培養(yǎng)軟骨細胞，并分為模型組、川芎嗪低劑量組、川芎嗪中劑量組、川芎嗪高劑量組，另選取3只正常兔體外分離培養(yǎng)軟骨細胞作為正常對照組。模型組和正常對照組給予10% DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，而川芎嗪低、中、高劑量組分別給予含10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL川芎嗪注射液的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。采用流式細胞儀測定兔軟骨細胞周期及增殖指數(shù)，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，采用MTT法檢測軟骨細胞活性，采用Western-blot法檢測軟骨細胞中bax、bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況。結(jié)果模型組G0/G1期細胞所占比例及PI均明顯低于正常對照組(P均<0.05)，S期及G2/M期細胞所占比例均明顯高于正常對照組(P均<0.05)；川芎嗪中、高劑量組G0/G1期細胞所占比例、PI均顯著高于模型組和川芎嗪低劑量組(P均<0.05)，而S期及G2/M期細胞所占比例均顯著低于模型組和川芎嗪低劑量組(P均<0.05)。川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞凋亡率均明顯低于模型組(P均<0.05)，川芎嗪高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)，而川芎嗪高劑量組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞活性均顯著高于模型組(P均<0.05)，川芎嗪高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)，而川芎嗪高劑量組仍然低于正常對照組(P<0.05)。模型組軟骨細胞中bax及Caspase-3表達量均明顯高于正常對照組(P均<0.05)，bcl-2表達量顯著低于正常對照組(P<0.05)；而川芎嗪各劑量組軟骨細胞中bax及Caspase-3表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，bcl-2表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且川芎嗪高劑量組各指標改善情況均顯著優(yōu)于低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論川芎嗪能夠促進軟骨細胞的增殖，同時還能通過上調(diào)抗凋亡因子bcl-2表達，下調(diào)軟骨細胞促凋亡因子bax以及Caspase-3表達而抑制軟骨細胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞]川芎嗪；兔；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；增殖；凋亡

骨關(guān)節(jié)炎是常見的退行性變關(guān)節(jié)疾病，好發(fā)于負重關(guān)節(jié)，是中老年人常見的疾病，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增高，嚴重威脅中老年人身心健康。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)軟骨的降解是其主要變化，其中軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞，其在軟骨的形成、修復以及代謝中起著關(guān)鍵作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn),當發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎時，軟骨細胞的凋亡率增加，而軟骨細胞的凋亡也是造成骨關(guān)節(jié)炎病變的關(guān)鍵因素[2]。如何有效抑制軟骨細胞的凋亡及軟骨基質(zhì)降解成為骨關(guān)節(jié)炎當前研究的熱點。近期有研究表明，川芎嗪不僅能夠促進軟骨細胞進入增殖周期，促進軟骨細胞的增殖，同時可抑制軟骨細胞凋亡蛋白bcl-2的表達，減少軟骨細胞的凋亡[3]。本研究觀察了川芎嗪對兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及凋亡的影響，旨在為川芎嗪的臨床應用提供理論依據(jù)。

1實驗資料

1.1實驗動物普通成年新西蘭兔15只，雄性7只，雌性8只，月齡6個月，體質(zhì)量2.0～2.5(2.3±0.1)kg，西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號：SYXK(川)2013-181。

1.2實驗藥物、試劑與儀器川芎嗪注射液由北京市燕京藥業(yè)有限公司提供，國藥準字H20043160，規(guī)格：40 mg/2 mL。TUNEL成套試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶等均購于Hy-clone公司。流式細胞分析儀器及配套設備由美國BD公司提供。

1.3實驗方法

1.3.1骨關(guān)節(jié)炎模型的建立隨機選取其中12只兔，采用切斷前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶以及切除內(nèi)側(cè)半月板改良Hulth法于兔雙后膝關(guān)節(jié)建立兔骨關(guān)節(jié)炎動物模型；余3只進行假手術(shù)作為正常對照組，操作方式與上述方法相同，只是不切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板。所有動物術(shù)后均給予青霉素20萬IU肌注，1次/d，連續(xù)7 d，以防止發(fā)生感染；另外，對手術(shù)動物實施一籠一兔喂養(yǎng)，手術(shù)7 d后每天驅(qū)趕兔子來回走動，每次約30 min。

1.3.2兔軟骨細胞的分離、分組與培養(yǎng)手術(shù)完成后第9周，采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死所有兔，無菌條件下選取雙側(cè)股骨遠端以及雙側(cè)脛骨近端處關(guān)節(jié)軟骨，放置在D-Hank’s液中清洗，然后將軟骨片剪成大小為1 mm2碎片分裝在試管中，加入0.2%膠原酶10 mL，37 ℃恒溫水浴以及磁力攪拌下消化，45 min后取上清，離心收集細胞，然后再采用膠原酶重復消化，最后將2次收集的細胞加入含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中制備成軟骨細胞懸液。將骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞隨機分為模型組、川芎嗪低劑量組、川芎嗪中劑量組、川芎嗪高劑量組，按照1×104mL-1密度接種于96孔培養(yǎng)板上，每組設定6個復孔。正常對照組、模型組給予10%DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，川芎嗪低劑量組、中劑量、高劑量組分別另加入10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL川芎嗪注射液進行培養(yǎng)。

1.4檢測指標

1.4.1細胞周期及增殖指數(shù)采用流式細胞儀測定，細胞培養(yǎng)24 h后，在胰蛋白酶消化下收集各孔細胞，1 000 r/min離心5 min,棄上清，PBS溶液洗2次，采用70%乙醇進行固定，在4 ℃環(huán)境下放置過夜。離心分離乙醇，經(jīng)PBS洗滌后將細胞重新放置在1 mL PBS中，加入10 μg/mL RNase 37 ℃孵育30 min，然后加入碘化丙啶50 μg/mL上機測定。采用Cell Quest軟件獲取軟骨細胞104個，然后再采用modFit軟件分析DNA數(shù)據(jù)，并測定細胞DNA含量，得到細胞周期3個時相(G0/G1、S、G2/M期)的軟骨細胞數(shù)，計算增殖指數(shù)(PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.4.2軟骨細胞凋亡情況將余下軟骨置入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟水化后，采用TUNEL法根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。先分別用雙蒸水和PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次，37 ℃下加入20 μg/mL蛋白酶K消化15 min，用PBS緩沖液連續(xù)沖洗3次，5 min/次，然后放入3%的H2O2甲醇中25 min，再次用PBS緩沖液連續(xù)沖洗3次，時間同上；將樣本置于37 ℃ TUNEL反應混合液中90 min，PBS緩沖液沖洗3次；置于濃度為5%的羊血清中室溫封閉20 min；37 ℃下POD孵育30 min；PBS緩沖液沖洗3次；DAB顯色，蘇木精復染，并于流水中藍化。切片中軟骨細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片光鏡下計數(shù)10個400倍視野，以平均計數(shù)100個細胞中含凋亡細胞個數(shù)作為凋亡率，即凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4.3軟骨細胞活性采用MTT法檢測。干預72 h后，在上述軟骨細胞培養(yǎng)孔中分別加入10 μL MTT，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下孵育4 h棄上清。加入Formazan溶解液100 μL，并在室溫下振蕩10 min，最后在酶標儀上檢測570 nm處光密度值(OD值)，結(jié)果取6個復孔的均值。

1.4.4bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表達情況細胞培養(yǎng)72 h后，采用Western-blot法檢測各組軟骨細胞中 bax、bcl-2蛋白表達情況：采用PBS緩沖液將經(jīng)過預冷的軟骨細胞漂洗2次，時間5 min，吸凈PBS后加入RIPA裂解液(含PMSF)，將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，分4次超聲粉碎，每次15 s，棄沉淀后將上清液加至BCA工作液中，振蕩器處理30 s，放置于37 ℃條件下30 min，利用酶標儀于570 nm波長處測定bax、bcl-2蛋白相對表達量。采用比色法檢測各組軟骨細胞中Caspase-3蛋白表達情況：參照上述方法處理軟骨細胞待檢樣品，得上清液后取50 μL置于96孔板中，加入50 μL Reaetion Buffer(×2)，再加入5 μL 濃度為4 mmol/L的Substrate，37 ℃水浴箱中孵育120 min，注意避光，采用酶標儀于450 nm波長處測定Caspase-3蛋白相對表達量。

2結(jié)果

2.1各組軟骨細胞周期及PI情況模型組G0/G1期細胞所占比例及PI均明顯低于正常對照組(P均<0.05)，S期及G2/M期細胞所占比例均明顯高于正常對照組(P均<0.05)；川芎嗪中、高劑量組G0/G1期細胞所占比例、PI均顯著高于模型組和川芎嗪低劑量組(P均<0.05)，而S期及G2/M期細胞所占比例均顯著低于模型組和川芎嗪低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組軟骨細胞周期及PI情況

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與川芎嗪低劑量組比較，P<0.05。

2.2各組軟骨細胞凋亡情況正常對照組、模型組及川芎嗪低、中、高劑量組軟骨細胞凋亡率分別為(7.42±2.68)%，(30.64±4.55)%，(27.65±4.28)%，(19.75±3.67)%，(8.12±0.63)%，川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞凋亡率均明顯低于模型組(P均<0.05)，川芎嗪高劑量組低于低劑量組(P<0.05)，而川芎嗪高劑量組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3各組軟骨細胞活性正常對照組、模型組及川芎嗪低、中、高劑量組軟骨細胞活性分別為0.59±0.04，0.36±0.05，0.38±0.06，0.43±0.04，0.47±0.06。川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞活性均高于模型組(P均<0.05)，川芎嗪高劑量組高于低劑量組(P<0.05)，而川芎嗪高劑量組仍然低于正常對照組(P<0.05)。

2.4各組軟骨細胞中bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表達情況模型組軟骨細胞中bax及Caspase-3表達量均高于正常對照組(P<0.05)，bcl-2表達量低于正常對照組(P<0.05)；而川芎嗪各劑量組軟骨細胞中bax及Caspase-3 表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，bcl-2表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且川芎嗪高劑量組各指標改善情況均優(yōu)于低劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組軟骨細胞中bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表達情況

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與川芎嗪低劑量組比較，P<0.05。

3討論

目前關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究中，軟骨的受損是公認的病理學特征。雖然軟骨細胞僅占軟骨組織總體積的1%～5%，細胞外基質(zhì)占90%以上，但軟骨細胞屬于多功能細胞，其不僅能夠有效合成和分泌基質(zhì)，同時對控制細胞外基質(zhì)的分布也具有重要作用[4]。在骨關(guān)節(jié)炎中，軟骨細胞數(shù)量隨著骨關(guān)節(jié)炎炎癥程度的加重呈現(xiàn)下降的趨勢，而基質(zhì)異常鈣化以及細胞數(shù)量的變化與軟骨纖維化的增加頻率呈一致性，說明細胞結(jié)構(gòu)減少在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[5-6]。

細胞凋亡屬于正常的生理過程，是由基因調(diào)控損傷細胞或非需要細胞的程序性死亡過程，但是若細胞出現(xiàn)過度凋亡則為病理所致。如果軟骨細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，則會導致軟骨細胞數(shù)量減少，從而使軟骨基質(zhì)的合成以及分泌減少，嚴重時會引起維持軟骨基質(zhì)合成以及降解酶系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，最終造成關(guān)節(jié)軟骨退變[7-8]。bax和bcl-2、Caspase-3均為粒細胞凋亡調(diào)控因子，其中bcl-2基因家族屬于細胞凋亡的主要調(diào)控基因，其不僅在細胞凋亡中處于調(diào)控機制的終末端，而且在維持細胞數(shù)量以及細胞生理性分化發(fā)育的動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2的過量表達會形成bcl-2同源二聚體，可有效抑制細胞的凋亡，因此上調(diào)bcl-2是對軟骨細胞的保護，以防止其凋亡[9-10]。而bax和bcl-2屬于一對正負調(diào)節(jié)因子，當兩者比值呈現(xiàn)升高的趨勢，則將會促使Caspase介導的線粒體凋亡途徑激活，最終導致細胞的凋亡，而bax的過度表達，不僅可以與bcl-2形成異源二聚體，拮抗bcl-2抑制凋亡的作用，同時也會形成bax同源二聚體，促進細胞色素C的釋放，最終導致Caspase的細胞凋亡。Caspase-3屬于CPP32亞家族中重要成員，其通常以無活性的酶原形式存在于細胞質(zhì)中，其在凋亡信號的刺激下，很容易經(jīng)過蛋白水解酶的作用激活為活化形式，不僅能夠降解多種蛋白底物，而且Caspase-3異常高表達對加快軟骨細胞凋亡、誘導并加重組織損傷起著重要作用[11]。

川芎是血中之氣藥，具有祛風止痛、活血行氣、開郁燥濕等功效。其中川芎嗪是川芎中單體提取物，其化學名為四甲基吡嗪，屬酰胺類生物堿。其不僅能夠減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中IL-1β的含量，同時還能對軟骨基質(zhì)中MMP-13產(chǎn)生抑制作用，促進TIMP-1的合成，最終延緩軟骨細胞退變形成[12]。李應池等[13]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠通過對軟骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白表達的作用，促進軟骨細胞bcl-2蛋白的表達，最終達到調(diào)節(jié)軟骨細胞周期的作用。

本研究結(jié)果表明，川芎嗪能夠有效促進細胞增殖，且隨著川芎嗪濃度的增加，軟骨細胞PI指數(shù)也逐漸升高。川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞凋亡率均明顯低于模型組，川芎嗪高劑量組低于低劑量組，而川芎嗪高劑量組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；川芎嗪中、高劑量組軟骨細胞活性均高于模型組，川芎嗪高劑量組高于低劑量組，而川芎嗪高劑量組仍然低于正常對照組。模型組軟骨細胞中bax及Caspase-3表達量均高于正常對照組，bcl-2表達量低于正常對照組；而川芎嗪各劑量組軟骨細胞中bax及Caspase-3 表達量均明顯低于模型組，bcl-2表達量均明顯高于模型組，且川芎嗪高劑量組各指標改善情況均優(yōu)于低劑量組。提示川芎嗪可促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的增殖，同時還能通過上調(diào)抗凋亡因子bcl-2表達，下調(diào)軟骨細胞促凋亡因子bax以及Caspase-3表達抑制軟骨細胞的凋亡。但是由于兔軟骨細胞與人軟骨細胞的生物學特性存在一定的差異，因此還有待進一步選取人軟骨細胞(如外傷后截肢的軟骨細胞進行培養(yǎng))進行深入研究。

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[作者簡介]胡旭光，男，主治醫(yī)師，主要從事骨傷科疾病的臨床診斷與治療。 [通信作者]甘仲霖，E-mail:511254989@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.008

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)22-2418-04

[收稿日期]2015-10-10

Effects and mechanism of Ligustrazine on the proliferation and apoptosis of chondrocytes in rabbits

HU Xuguang1, GAN Zhonglin2, ZHANG Yi3

(1. Chinese Medical Hospital of Xinan Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China; 2. Public Medical College of Xinan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China; 3. The Third Hospital of Chengdu， Pujiang Hospital， The People’s Hospital of Pujiang County, Pujiang 611630, Sichuan, China)

Abstract:Objective It is to discuss the effects of Ligustrazine on proliferation and apoptosis of chondrocytes in rabbits with osteoarthritis, and to study the mechanism of action of ligustrazine. Methods 12 rabbits were selected to establish the animal model of osteoarthritis, and the chondrocytes were cultured in vitro,which were randomly divided into model group, low, medium and high dose of ligustrazine groups.Another 3 normal rabbits were select to get their chondrocytes as normal control group which were cultured in vitro. Model group and control group were cultured by 10% DMEM culture liquid, and low, medium and high dose of ligustrazine groups were cultured by the culture liquid containing 10 μg/mL, 20 μg/mL and 30 μg/mL ligustrazine injection.The proliferation index and cell stage were detected by flow cytometry, apoptosis was detected by TUNEL method, activity of chondrocytes were detected by MTT method, the expression of bax, bcl-2 and Caspase-3 in the cells was detected by Western blot method. Results The G0/G1 stage and PI levels in the ligustrazine groups of every dose and the model group were lower than those in the normal control group (P<0.05), while the G2/M stage and the S stage levels were higher than those in the normal control group (P<0.05), and the G0/G1 stage and PI levels in the high dose ligustrazine group were significantly higher than those in the low and middle ligustrazine groups (P<0.05), while the levels of G2/M stage and the S stage were significantly lower than those in the low and middle ligustrazine groups (P<0.05).The apoptosis rate of chondrocytes in ligustrazine group was significantly lower than that in model group (P<0.05), but significantly lower than that in control group (P<0.05).The expressions of Bax and Caspase-3 in the model group were significantly higher than those in control group,which of bcl-2 was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expressions of Bax and Caspase-3 in the low dose, medium dose and high dose ligustrazine groups were significantly lower than those in the model group, and the expressions of bcl-2 were significantly higher than those in the model and low dose group (P<0.05). Conclusion Ligustrazine can effectively promote the proliferation of cartilage cells, but also through upward-regulation of anti apoptotic factor bcl-2 expression, down-regulation the expressions of Pro apoptotic factor Bax and Caspase-3 to inhibit the apoptosis of chondrocytes.

Key words:ligustrazine;rabbits;osteoarthritis;chondrocytes;proliferation;apoptosis