基于網(wǎng)狀硒化鉬和雜交鏈式反應高靈敏檢測DNA

吳志偉，帥洪磊，黃克靖

(信陽師范學院 化學化工學院，河南 信陽 464000)

0 引言

DNA電化學生物傳感器是一項新型的基因檢測技術，它具有速度快、靈敏度高、操作簡單等特點，并具有分子識別功能，在生物工程臨床基因診斷、在抗癌藥物的篩選、臨床基因診斷等方面有很大的應用前景[1-2].核苷酸序列的檢測一般要求在低生理水平進行.DNA電化學傳感器具有簡單、輕便、價格低廉以及靈敏度高而被廣泛關注[3].在生物傳感器的制備中，納米材料由于其優(yōu)良的導電性及生物相容性已經(jīng)被廣泛應用[4].MoSe2作為一種具有典型層狀結構的半導體材料，鉬原子中存在二維電子，電子與電子的相互作用有助于增強平面的搬運性能[5-6].MoSe2已被證明為一種夾心型的類石墨結構，其獨特的結構和性能使其近年來逐漸成了摩擦、太陽能電池、催化劑等領域的研究熱點之一[7-8]，但是將其應用于電化學生物傳感器還很少被報道.

雜交鏈式反應是一個無酶參與的反應過程.通過設計不同的DNA鏈，由一小段DNA鏈作為引發(fā)劑誘導DNA鏈相互雜交形成一條具有二維或三維空間結構的雙鏈DNA.由于該反應是引發(fā)劑引起的，它可以有效降低背景電流，而且，每一引發(fā)劑可以觸發(fā)一個鏈式反應形成長鏈從而使得傳感器的信號放大[9-10].

本文用簡單的水熱法合成一種由層狀硒化鉬納米片組成的網(wǎng)狀納米材料，將其修飾于玻碳電極表面后再通過電沉積固定上納米金，通過Au-S作用固定上DNA探針后，進行交鏈式后反應，通過DNA雙鏈上的親和素引入過氧化物酶(HPR)，HPR可催化H2O2+對苯二酚 (HQ)體系產(chǎn)生電化學信號，據(jù)此構建了一種新型信號放大型電化學傳感器用于特定DNA序列的超靈敏檢測.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

CHI660D電化學工作站(上海辰華，中國)，由鉑絲輔助電極、飽和甘汞參比電極(SCE)和一個工作電極GCE組成三電極系統(tǒng)；電子天平(上海菁海，中國)；超聲波清洗器(昆山，中國).掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分別為Hitachi S-4800和JEM 2100.

1.2 實驗試劑

本實驗所使用的核苷酸序列均是通過上海生物工程技術有限公司 (上海，中國) 合成的，它的堿基序列如下：

DNA探針(cDNA)：5′-TGCAGTTTCCGTCCG TAGTTTTT-SH-3′

目標DNA (tDNA)：5′-CTACGGACGGAAACTG CACCTGTATTCCCATACCCATCAT-3′

單堿基錯配DNA:5′-CTACGGACGGAAACTG CAACTGTATTCCCATA CCCATCAT-3′

三堿基錯配DNA: 5′-CTACGGACGCAAACTG CAACTGTATTCTCATA CCCATCAT-3′

完全不互補DNA: 5′-CTGCTTCCAAACCTTTAA CATAGCCGCAAGCG TTAGCTGC-3′

輔助DNA(aDNA): 5′-AGTCTAGGATTCGGCGT GGGTTAAATGATGGGTATGGGAATACAGG-3′

Bio-H1: 5′-biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAG-ACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3′

Bio-H2: 5′-biotin-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCT AGACTACTTTG -3′

不同DNA序列所用緩沖液：磷酸鹽緩沖溶液PBS1 (10 mmol/L PBS, 3 mol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, pH 7.4) 用于配制稀釋的捕獲探針 (cDNA), PBS2 (10 mmol/L PBS, 150 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2, pH7.4)用于配制稀釋的目標序列 (tDNA)、輔助序列 (aDNA)、錯配的DNA序列和電極洗液，稀釋的Bio-H1和Bio-H2序列由PBS3 (50 mmol/L PBS, 1mol/L NaCl, pH 7.4)配制.

1.3 層狀硒化鉬納米片的制備

在攪拌下，0.17 g的Se粉首先溶解在6 mL水合肼中，然后室溫下放置24 h.0.25 g的鉬酸鈉(Na2MoO4)溶在50 mL水中.隨后將Se溶液逐漸滴加到鉬酸鈉溶液中.隨后該混合液加入到一個 100 mL的消解罐中，在180 ℃下反應46 h, 冷卻到室溫.用無水乙醇和蒸餾水洗滌3次后，將得到的產(chǎn)品在60 ℃的真空干燥箱干燥12 h，得到硒化鉬納米片.

1.4 電化學傳感器的制備

玻碳電極(GCE)首先用0.5 μm、0.05 μm的α-Al2O3拋光粉打磨，用乙醇、蒸餾水超聲清洗干凈，吹干備用.取1 mg MoSe2超聲分散于3 mL水中 (即濃度為0.33 g/L).然后將8 μL該溶液滴在打磨好的GCE表面，自然晾干.將上述電極放置于0.1 % HAuCl4(含0.1 mol/L KNO3) 溶液中電沉積納米金70 s.隨后取8 μL 5.0×10-7mol/L巰基修飾的cDNA 涂滴于電極表面，室溫反應12 h.沖洗掉電極表面過量的cDNA，再將 8 μL 1 % 的牛血清白蛋白(BSA)涂滴于電極表面，反應30 min，用以除去非特異性吸附.隨后，在電極表面滴加不同濃度的tDNA，在37 ℃ 水浴中雜交反應60 min.接著，滴加8 μL 5.0×10-7mol/L 的aDNA，37 ℃ 水浴中進行雜交反應40 min.雜交后，在該電極表面滴加8 μL 0.5 μmol/L H1+ 0.5 μmol/L H2混合液 (在反應前Bio-H1和Bio-H2分別于95 ℃ 水浴中加熱5 min，再于室溫自然冷卻2 h后備用)，于室溫下進行HCR反應100 min.最后，將進行過HCR反應后的電極浸入20 g/L的avidin-HRP溶液中約40 min，通過biotin-avidin將它固定在HCR反應后的DNA鏈上.

1.5 電化學測定

循環(huán)伏安法(CV) (電壓范圍：-0.2～+0.6 V，掃速：100 mV/s，電解質(zhì)：0.1 mol/L PBS (pH 7.0) 含1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl).

交流阻抗法(EIS) (頻率：0.1～104Hz,電解質(zhì)：0.1 mol/L PBS (pH 7.0) 含5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl).

I-t法電沉積金(沉積電壓：-0.2 V，沉積時間：70 s，電解質(zhì)：0.1% HAuCl4和 0.1 mol/L KNO3).

差分脈沖伏安法(DPV) (脈沖寬度：0.02 s，脈沖周期：0.1 s，電壓范圍：-0.4～+0.2 V，電解質(zhì)：0.1 mol/L PBS (7.0) 含 1.8 mmol/L H2O2和 2 mmol/L HQ).

2 結果與討論

2.1 材料表征

如圖1A所示，合成的MoSe2由很多薄片組成，大量的MoSe2納米片交纏形成網(wǎng)狀結構，該結構使其具有大的比表面積，有利于固定上大量的探針，從而提高傳感器的檢測靈敏度.圖1B為MoSe2的TEM圖，再次證明了網(wǎng)狀的MoSe2由大量的納米片組成.

圖1 MoSe2的SEM(A)和TEM(B)圖Fig. 1 SEM (A) and TEM (B) images of MoSe2

2.2 電化學表征

圖2為不同修飾電極在含有1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L PBS溶液中的CV曲線.在裸GCE上，可以觀察到一對較矮的氧化還原峰(曲線a).當GCE上分別修飾上納米金(AuNPs)和MoSe2時，峰電流均顯著增加，說明兩者可有效提高電極的活性位點.而當AuNPs和MoSe2共同修飾到GCE上時(曲線d)，峰電流達到了最大，說明兩者的協(xié)同作用促進了電子在電極上的有效傳遞.當DNA探針進一步修飾到電極上時，峰電流明顯下降(曲線e)，這是因為電負性的DNA 磷酸骨架的引入阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子傳遞.用BSA封閉活性位點后，峰電流進一步下降(曲線f)，說明疏水性的蛋白質(zhì)阻礙了電子傳遞.目標DNA和輔助DNA的引入，進一步降低了峰電流強度.當HCR在電極表面發(fā)生時，峰電流進一步顯著降低，說明大量的電負性的DNA 磷酸骨架成功地修飾到電極表面.這些結果表明了傳感器的成功構建.

圖2 不同修飾電極在1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-中的CV圖Fig. 2 CVs of GCE (a), AuNPs/GCE (b), MoSe2/GCE (c), AuNPs/MoSe2/GCE (d), cDNA/AuNPs/MoSe2/GCE (e), BSA/cDNA/AuNPs/MoSe2/GCE (f), tDNA/BSA/cDNA/AuNPs/MoSe2/GCE (g), aDNA/tDNA/BSA/cDNA/AuNPs/MoSe2/GCE (h), HCR/aDNA/tDNA/BSA/cDNA/AuNPs/MoSe2/GCE(i) in 0.1 mol/L PBS containing 1.0 mmol/L[Fe(CN)6] 3-/4- and 0.1 mol/L KCl.

2.3 條件的優(yōu)化

如圖3A和B所示，分別對雜交鏈式反應的時間和avidin-HRP的固定時間進行了優(yōu)化.在圖3A中，在30～100 min范圍內(nèi)，隨著HCR反應時間的延長，峰電流逐漸增大，進一步延長反應時間，峰電流基本不變.因此，選擇HCR的時間為100 min.在圖3B中，隨著avidin-HRP的固定時間的延長，峰電流隨之增大，并在40 min時達到了最大，因此選擇avidin-HRP的固定時間為40 min.

傳感器的檢測體系為基于HRP催化H2O2氧化底物+對苯二酚 (HQ)，因為HRP酶要在適當?shù)膒H范圍才有良好的活性，所以底液的pH會影響傳感器的檢測靈敏度.對pH的影響進行優(yōu)化，結果表明，當PBS的pH值為7.0時，催化電流最大，因此選擇pH7.0的PBS為檢測底液.兩個底物H2O2和HQ也會影響檢測信號的強弱.因此對它們的濃度進行了優(yōu)化.結果發(fā)現(xiàn)，當HQ的濃度為2 mmol/L時，峰電流隨H2O2濃度的增大而增大，并于1.8 mmol/L時達到最大值.而當H2O2的濃度為1.8 mmol/L時，峰電流隨著HQ濃度的增大而增大，并在2 mmol/L時達到最大值.因此選擇的檢測底液為2 mmol/L HQ和1.8 mmol/L H2O2的混合液.

圖3 雜交鏈式反應的時間(A)和avidin-HRP的固定時間(B)的優(yōu)化Fig. 3 The effects of HCR time (A) and reaction time of avidin-HRP (B) on the peak currents

2.4 HCR的信號放大作用

在本文中，引入HCR用于放大檢測信號，提高檢測靈敏度.從圖4中可以看出，當反應液中只添加 Bio-H2(b)和裸GCE(a)時峰電流信號很小，說明沒有發(fā)生鏈式雜交反應.而當反應液中同時添加Bio-H1和Bio-H2(d)時，峰電流信號顯著增強達到最大，說明只有同時存在引發(fā)鏈(aDNA)、Bio-H1和Bio-H2時，才會發(fā)生雜交鏈式反應，從而顯著提高傳感器的檢測靈敏度.

圖4 差分脈沖伏安曲線.空白 (a)，Bio-H2 (b)， Bio-H1 (c)， Bio-H1 + Bio-H2(d)Fig. 4 DPVs of blank (a), Bio-H2 (b), Bio-H1 (c) and Bio-H1 + Bio-H2(d)

2.5 線性范圍及檢出限

在優(yōu)化條件下，將傳感器分別與不同濃度的目標DNA進行反應，并檢測其峰電流，結果如圖5所示.

隨著目標DNA濃度的增大，峰電流信號逐漸增大.峰電流強度與目標 DNA濃度的負對數(shù)(-lgc) 在1.0×10-10～1.0×10-14mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關系，其線性方程為I(μA) = 3.03 lgc- 48.76，線性相關系數(shù)為0.996.根據(jù)信噪比3σ(σ為空白溶液相對標準偏差，n= 9)，計算得到該方法的檢出限為8.0×10-15mol/L.

圖5 傳感器與不同濃度的目標DNA反應后的DPV曲線Fig. 5 DPVs of the developed sensor after reaction with different tDNAs a～i:0, 1.0×10-14, 5.0×10-14,1.0×10-13, 5.0×10-13, 1.0×10-12, 5.0×10-12, 1.0×10-11, 1.0×10-10 mol/L.The inset is the calibration plots for tDNA with the proposed DNA biosensor.

2.6 選擇性

為了考察傳感器的選擇性，將其與具有不同堿基序列的DNA進行，再檢測其DPV信號.如圖6所示，當傳感器分別與完全錯配序列(曲線b)、三堿基錯配(曲線c)、單堿基錯配(曲線d)反應后，其DPV信號都比較小，而當其與完全錯配的DNA反應后，其峰電流顯著增加，說明該傳感器對完全互補、單堿基錯配、三堿基錯配以及完全錯配的目標DNA序列具有很好的選擇識別能力.

圖6 DNA傳感器與不同的DNA反應Fig. 6 The effects of different DNA sequences on the peak currents(a) blank sulotion; (b)1.0×10-9 mol/L noncomplementary sequence; (c)1.0×10-9 mol/L three-based mismatch sequence ; (d)1.0×10-9 mol/L one-based mismatch sequence (e)1.0×10-11 mol/L complementary sequence .

3 結論

本實驗將網(wǎng)狀的MoSe2與HCR相結合，構建了一種新型的電化學生物傳感器，用于特定DNA序列的超靈敏檢測.由于MoSe2大的比表面積和好的導電性能以及HCR的信號放大作用，所構建的傳感器體現(xiàn)出寬的線性范圍(1.0×10-10～1.0×10-14mol/L)和低的檢出限(8.0×10-15mol/L).此外，該傳感器具有很好的選擇性，能區(qū)分單堿基錯配和三堿基錯配的DNA 序列，在DNA損傷研究和藥物分析等領域有著較好的應用潛力.