釀酒酵母組蛋白H3K14乙?；瘜?duì)H3K4三甲基化的影響

史晨霞，薛濤濤，趙秀娟，周 媛，梁 棟，崔向軍

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) a.數(shù)理與生物工程學(xué)院;b.生物工程與技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

0 引言

在細(xì)胞里，DNA核心組蛋白有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：折疊區(qū)和氨基末端(N末端)結(jié)構(gòu)域.N末端結(jié)構(gòu)域上的氨基酸位點(diǎn)常發(fā)生多種共價(jià)修飾，比如乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等[1].這些組蛋白修飾是在多種組蛋白修飾酶催化下形成的，比如催化釀酒酵母H3K4me3(組蛋白H3第四位賴氨酸(K)的三甲基化)的甲基化酶Set1，以及催化H3K14Ac(Ac：乙?；?修飾的乙?；窯cn5[2].不同種類的組蛋白修飾對(duì)于基因的表達(dá)發(fā)揮著相異的作用.組蛋白乙酰化通常情況下促進(jìn)基因表達(dá)，它也可與抑制基因表達(dá)有關(guān)[3].組蛋白甲基化的生物學(xué)作用依賴于修飾的位點(diǎn)和種類，或促進(jìn)基因表達(dá)，或抑制基因表達(dá)[4].越來(lái)越多的證據(jù)表明多種修飾之間存在關(guān)聯(lián)關(guān)系和因果關(guān)系.例如，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域分別發(fā)現(xiàn)H3K4me3/H3K27me3組合以及H3K4me1/H3K27Ac組合[5].H3S10磷酸化可以促進(jìn)由Gcn5催化的H3K4乙?；痆6]；H4R3甲基化有利于P300 (組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶) 催化H4K8和H4K12的乙酰化[7].另外，H2BK123單泛素化可以借助相關(guān)酶蛋白調(diào)節(jié)H3K4和K79甲基化;H4K16和H4K12位點(diǎn)突變會(huì)影響H3K56的乙酰化，但H4組蛋白的其他位點(diǎn)不能產(chǎn)生與此相同的作用[8].

為了研究釀酒酵母組蛋白修飾之間的因果組合關(guān)系，課題小組分別以LIU等和POKHOLOK等建立的修飾數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)[9-10]，通過(guò)對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中芯片探針和基因的篩選、酵母轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定、篩選的修飾數(shù)據(jù)的校驗(yàn)、建立修飾相關(guān)群體和構(gòu)建組蛋白修飾網(wǎng)絡(luò)等一系列理論方法，研究了修飾之間的因果關(guān)系[11-12].本研究通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酵母中的這一修飾因果關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 釀酒酵母BY4741 和包含質(zhì)粒H3K14A(賴氨酸K突變?yōu)楸彼酇)的大腸桿菌由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院戴俊彪博士饋贈(zèng)，該質(zhì)粒含有釀酒酵母H3K14位點(diǎn)突變的H3編碼序列.選擇釀酒酵母BY4741為目的菌株，是因?yàn)長(zhǎng)IU等在該菌株的基礎(chǔ)上完成了CHIP-chip實(shí)驗(yàn)，從而得到前期理論工作使用的相關(guān)組蛋白修飾數(shù)據(jù).

酵母組蛋白H3基因(HHT1和HHT2)和H4基因(HHF1和HHF2)在細(xì)胞中分別有2個(gè)拷貝，HHT1和HHF1位于II號(hào)染色體，HHT2和HHF2位于XIV號(hào)染色體.使用的BY4741菌株已經(jīng)將II號(hào)染色體的HHT1和HHF1基因敲除，但XIV號(hào)染色體的HHT2和HHF2保留.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 BciVI酶，New England Biolabs公司；高保真Taq酶，TaKaRa公司；內(nèi)參抗體(αtubulin和H3抗體)和H3K4me3抗體(兔源)，abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔)，GE healthcare公司；Ura Minus Media Droupout，北京泛基諾科技有限公司；PVDF膜，Millipore公司；質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司；引物，江蘇金唯智生物技術(shù)公司合成.其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖;SC-Ura固體培養(yǎng)基：0.67%YNB, 2%葡萄糖，2%瓊脂，0.13 % Ura Minus Media Droupout.

1.2 方法

1.2.1 H3K14突變菌株的構(gòu)建 在敲除HHT1和HHF1基因的釀酒酵母BY4741菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建H3K14位點(diǎn)突變菌株(BY4741-H3A14).使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒；BciVI酶酶切質(zhì)粒，15 μL體系：Plasmid DNA 6μL、NEB buffer4 (10×) 1.5 μL、 BciVI (10 000u/mL) 0.2 μL、 無(wú)菌水7.3 μL，37 ℃水浴過(guò)夜酶切.該酶在質(zhì)粒有4個(gè)酶切位點(diǎn)，四段酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為4071 bp、2575 bp、1527 bp、613 bp，其中有效片段(含有突變位點(diǎn))長(zhǎng)度為4071 bp.

質(zhì)粒酶切后，針對(duì)有效片段轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞；通過(guò)Ura缺陷平板篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞；在平板上隨機(jī)挑取8個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR，初步判斷所鑒定菌落是否轉(zhuǎn)化成功.圍繞目的基因(Ura)設(shè)計(jì)引物，上游引物為:5'-GGAGCCATTTGTTAATATACCGTCTCATC-3'下游引物為：5'-CTGTGCTCCTTCCTTCGTTC-3'.反應(yīng)條件為：Taq酶 0.1 μL、10×Buffer 1 μL、dNTP 1 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、Triton×100 0.5 μL、加無(wú)菌水至10 μL.反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min[13].

菌落PCR之后提取酵母基因組，針對(duì)轉(zhuǎn)化片段進(jìn)行左臂和右臂的PCR驗(yàn)證(在PCR驗(yàn)證時(shí)需做陰性對(duì)照，反應(yīng)程序及條件和陽(yáng)性對(duì)照相同).左臂驗(yàn)證PCR所需引物序列如下，上游引物為：5'-GGAGCCATTTGTTAATATACCGTCTCATC-3'，下游引物為：5'-CTGTGCTCCTTCCTTCGTTC-3'；陰性對(duì)照引物如下，上游引物為：5'-GGAGCCATTTGTTAATATACCGTCTCATC-3'，下游引物為：5'-GAATCCGTCGAAGCATACTTA-3'.右臂驗(yàn)證PCR所需引物如下，上游引物為：5'-GAATTTGATACATAAGGCTC GCTCTAG-3'，下游引物為：5'- GAGGTCGCTC TTATTGACCACACC-3'；陰性對(duì)照引物如下，上游引物為：5'- GAATTTGATACATAAGGCTCGCTCTAG-3'，下游引物為：5'-GCCAAGAGAAAGACTGTTACTTCTTTG-3'[11].左臂右臂PCR反應(yīng)條件均為：Taq酶0.1 μL、10×Buffer 1 μL、dNTP 1 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、基因組模板1 μL、加無(wú)菌水至10 μL.反應(yīng)程序同為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.

驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功后， PCR擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的HHT1基因片段.引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成.上游引物為5'-GCCTGGCTTGTATCTGTG-3'；下游引物為5'-GGTCATTTAGCGTTCATT-3'.反應(yīng)條件為：Taq酶 0.3 μL、10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上游引物 2 μL、下游引物 2 μL、基因組模板5 μL、加無(wú)菌水至50 μL.反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s、共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，測(cè)序該目的序列.

1.2.2 H3K4me3的Western Blot檢測(cè) 制備酵母總蛋白樣品.收集OD600值0.5～1.0對(duì)數(shù)期酵母細(xì)胞，用無(wú)菌水洗一遍；用500 μL～1 mL 0.1 mol/L NaOH室溫處理8 min，12 000 r/min離心30 s，去上清；沉淀用1× sample buffer 重懸；100 ℃煮5～10 min，13 000 r/min離心3 min；上清點(diǎn)樣；15%的聚丙烯酰胺凝膠分離組蛋白，恒壓80 V跑濃縮膠約40 min，120 V跑分離膠約2 h.切膠之后，恒流300 mA 1.5 h轉(zhuǎn)PVDF膜；5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉，室溫30 min；將H3K4me3抗體以1∶2000的比例加入到含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST室溫洗膜，每次10 min，重復(fù)3次；二抗以1∶2000的比例加入到含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫孵育1 h；用GE公司的Image Quant LAS4000凝膠成像系統(tǒng)顯影.

2 結(jié)果和分析

2.1 突變菌株的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

菌落PCR擴(kuò)增基因片段后，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，得到與預(yù)期片段(700 bp)大小相符的單一擴(kuò)增條帶，見圖1.8個(gè)菌落轉(zhuǎn)化成功.

圖1 對(duì)菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳

對(duì)轉(zhuǎn)化成功的菌落進(jìn)行基因組提取，對(duì)其轉(zhuǎn)化片段的左臂和右臂進(jìn)行PCR驗(yàn)證，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，見圖2，得到與預(yù)期片段(左臂為700 bp，右臂為896 bp,陰性對(duì)照均無(wú)條帶)相符的條帶.泳道1、3、5、7 顯示了左臂驗(yàn)證條帶，泳道2、4、6、8為左臂驗(yàn)證陰性對(duì)照； 泳道9、11、13、15顯示了右臂驗(yàn)證條帶，泳道10、12、14、16為右臂驗(yàn)證陰性對(duì)照.

PCR擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的HHT1基因片段之后，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，得到與預(yù)期片段(399 bp)大小相符的單一擴(kuò)增條帶(圖3).

圖2 對(duì)基因組PCR的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 含有突變位點(diǎn)的HHT1基因片段的瓊脂糖凝膠電泳

蘇州金唯智生物科技有限公司將該序列擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果表明，H3基因中編碼第14位賴氨酸的堿基(AAG)突變?yōu)榫幋a丙氨酸的堿基(GCT).構(gòu)建的釀酒酵母H3K14位點(diǎn)突變堿基序列與預(yù)期相符.

2.2 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

圖4為釀酒酵母對(duì)照菌株BY4741和變體菌株BY4741-H3A14的總蛋白.結(jié)果顯示兩種菌株在組蛋白H3(分子量15.38 kDa)對(duì)應(yīng)位置約15KDa處四個(gè)泳道均有明顯蛋白印跡.

圖4 釀酒酵母總蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖5 對(duì)照菌株釀酒酵母BY4741和變體菌株BY4741-H3A14的αtubulin、H3和H3K4me3修飾的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Detection results of αtubulin, H3 and H3K4me3 byWestern blotfor control strains S. cerevisiae BY4741 and mutant strains BY4741-H3K14A

為了避免Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，進(jìn)行了內(nèi)參αtubulin和H3抗體檢測(cè).圖5為對(duì)照菌株釀酒酵母BY4741和變體菌株BY4741-H3A14的αtubulin、H3和H3K4me3修飾的Western blot檢測(cè)結(jié)果.在釀酒酵母BY4741和突變菌株BY4741-H3A14均能檢測(cè)到αtubulin和組蛋白H3的表達(dá)，而對(duì)于H3K4me3修飾的檢測(cè)結(jié)果卻剛好相反，BY4741對(duì)照菌株含有H3K4me3修飾，而變體菌株BY4741-H3A14中未檢測(cè)到該修飾.結(jié)果表明釀酒酵母H3K14Ac確實(shí)能夠影響H3K4me3，它們之間存在因果關(guān)聯(lián)關(guān)系.

3 結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建酵母組蛋白氨基酸變體驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)顯示的兩種修飾之間的因果關(guān)聯(lián)關(guān)系.這一研究工作也為之后驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)顯示的其他修飾之間的因果關(guān)系提供了有價(jià)值的參考.同時(shí)，之前構(gòu)建的修飾關(guān)系網(wǎng)絡(luò)也為研究修飾之間的因果關(guān)系提供了線索，使得相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究目標(biāo)明確.此類研究使得對(duì)于組蛋白密碼產(chǎn)生了比較深刻的認(rèn)識(shí).哪些組蛋白修飾之間的因果關(guān)聯(lián)關(guān)系具有與氨基酸密碼子類似的普適性，是進(jìn)一步比較關(guān)注的問(wèn)題.