DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)等位基因的功能研究

王志超，沈黎，劉得水，李丹，吳桐2，，趙阿勐，崔光成.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾　6006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾　6006

DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)等位基因的功能研究

王志超1，沈黎1，劉得水1，李丹1，吳桐2，1，趙阿勐1，崔光成1
1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161006

目的為鑒定兒童發(fā)展性閱讀障礙發(fā)病相關(guān)易感基因DYX1C1的rs3743205位點(diǎn)-3C/T不同等位基因?qū)蛘{(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法本研究構(gòu)建含DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)-3C/T不同等位基因的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞并測(cè)定其瞬時(shí)表達(dá)螢光素酶活性。結(jié)果體外轉(zhuǎn)染增殖期原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，含等位基因-3T重組質(zhì)粒的報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)活性高于含等位基因-3C重組質(zhì)粒，并均低于PGL3-control Plasmid。結(jié)論位于DYX1C1基因5'調(diào)控區(qū)的rs3743205位點(diǎn)-3T等位基因可能參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，-3C等位基因可能是兒童發(fā)展性閱讀障礙的易感基因。

兒童發(fā)展性閱讀障礙；DYX1C1基因；rs3743205位點(diǎn)；轉(zhuǎn)錄活性

［Abstract］Objective To identify the effect of children developmental dyslexia invasion susceptibility gene DYX1C1 rs3743205 site-3C/T different gene alleles on transcription activity in gene control region.Methods The luciferase reporter gene recombinant plasmid containing DYX1C1 gene rs3743205 site-3C/T different gene alleles was structured，and the nerve cells were primarily cultured transfection in vitro and the transcient expression of luciferase activity was measured. Results The nerve cells were primarily cultured in transfection in vitro multiplication period，the expression activity of luciferase containing gene alleles-3T recombinant plasmid reporter gene is higher than that of the recombinant plasmid containing gene alleles-3C，and both were lower than that of PGL3-control plasmid.Conclusion The rs3743205 site-3T gene alleles in the gene alleles gene 5'control region may participate in the gene transcriptional control，and-3C gene alleles may be the susceptibility genes of children developmental dyslexia.

［Key words］Children developmental dyslexia；DYX1C1 gene；Rs3743205 site；Transcription activity

發(fā)展性閱讀障礙（Developmental Dyslexia）是在兒童學(xué)齡期普遍出現(xiàn)的一種學(xué)習(xí)障礙，部分兒童雖然擁有正常智力、情感以及相應(yīng)的教育及社會(huì)文化機(jī)會(huì)，但在閱讀方面會(huì)出現(xiàn)特殊學(xué)習(xí)困難狀態(tài)［1］。兒童發(fā)展性閱讀障礙是一種神經(jīng)認(rèn)知缺陷，家族聚集研究以及雙生子研究發(fā)現(xiàn)語言障礙具有明顯的家族聚集性［2］。兒童發(fā)展性閱讀障礙的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)DYX1C1基因的rs3743205位點(diǎn)的基因多態(tài)與發(fā)展性閱讀障礙相關(guān)［3］，但是DYX1C1基因多態(tài)性的對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能影響尚不清楚。為進(jìn)一步證實(shí)和解釋其遺傳關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，本課題以期通過體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞含DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)不同等位基因的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒并測(cè)定其瞬時(shí)表達(dá)螢光素酶活性，探討位于DYX1C1基因5'調(diào)控區(qū)rs3743205位點(diǎn)-3C/T等位基因?qū)?bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。

1　材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，購買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部。經(jīng)雌雄合籠獲得子代新生24h 的SD乳鼠。

1.2試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；滅活胎牛血清（Hyclone）；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；pGL3-Luciferase reporter vectors（Promega公司），pRL-TK vector（Promega公司），anti-NeuN（Millipore公司）。

1.3儀器

二氧化碳孵箱（Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）；倒置顯微鏡 （Olympus）；TD-20/20 Luminometer （Turner Design）。

2　方法

2.1原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞及鑒定

新生24 h SD乳鼠，消毒，斷頸剝離大腦皮質(zhì)，冷PBS溶液中剪碎，離心棄上清，胰蛋白酶消化15min，中間震蕩兩次。加入不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，過濾，離心棄上清。重新加入培養(yǎng)基，吹打混勻，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后吸棄全部種植培養(yǎng)液，換成含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。接種第3天，在培養(yǎng)皿中加入阿糖胞苷，48 h后更換含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d半量換液1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用免疫熒光標(biāo)記NeuN，鑒定神經(jīng)細(xì)胞。

2.2分組

按照不同的處理分為陽性對(duì)照組 （PGL3-control plasmid）、陰性對(duì)照組 （PGL3-Basic plasmid）、DYX1C1基因pGL3-C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，DYX1C1基因pGL3-T重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，共4組，同時(shí)設(shè)三組平行對(duì)照。

2.3轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d，接種1×105個(gè)細(xì)胞至24孔板中。細(xì)胞密度長(zhǎng)至60%～70%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋重組質(zhì)粒DNA及內(nèi)參照質(zhì)粒pRLTK，輕輕混勻，室溫放置。稀釋轉(zhuǎn)染工作液，室溫放置20～30min。輕輕混勻轉(zhuǎn)染工作液，逐滴加入培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)液輕輕混勻，置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h后裂解。

2.4轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的裂解

按 Dual-Luciferase Reporter Assay System提供的Protocol進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因的體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

2.5測(cè)定熒光素酶活性

在TD-20/20Luminometer螢光分析儀上測(cè)定。

2.6統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞

新生大鼠海馬細(xì)胞種后6～12 h，大部分細(xì)胞可貼壁，呈圓形或橢圓形，個(gè)別細(xì)胞開始伸出1～2個(gè)突起。培養(yǎng)3 d后胞體明顯增大，呈椎體形，有突起并形成稀疏網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)5～7 d后，細(xì)胞的突起進(jìn)一步變長(zhǎng)和復(fù)雜度增多，并形成相對(duì)密集神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，免疫熒光標(biāo)記NeuN鑒定神經(jīng)細(xì)胞（見圖1）。

圖1　免疫熒光標(biāo)記NEUN鑒定原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)

3.2含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因DNA片段的螢光素酶報(bào)告基因活性

螢光素酶報(bào)告基因活性結(jié)果顯示，陽性對(duì)照pGL3-control plasmid及含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重組質(zhì)粒的報(bào)告基因活性明顯高于陰性對(duì)照pGL3-basic plasmid（P＜0.05）；含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重組質(zhì)粒的報(bào)告基因活性低于陽性對(duì)照pGL3-control plasmid（P＜0.05）；含T等位基因的重組質(zhì)粒的報(bào)告基因活性明顯高于含C等位基因的重組質(zhì)粒的活性（P＜0.05）（見圖2）。

圖2　DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染增殖期原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞螢光素酶報(bào)告基因活性結(jié)果（n=6，±s）。

4　討論

兒童一旦出現(xiàn)發(fā)展性閱讀障礙，其行為、認(rèn)知、情感、社會(huì)適應(yīng)等方面都會(huì)受到影響，嚴(yán)重阻礙兒童知識(shí)的獲得和能力的提高，給家庭及社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。本課題組前期通過對(duì)兒童發(fā)展性閱讀障礙患者進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DYX1C1基因的rs3743205位點(diǎn)的基因多態(tài)與發(fā)展性閱讀障礙相關(guān)［3］。DYX1C1是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的閱讀障礙的易感基因，定位在第15號(hào)常染色體短臂 （15q21）［4-5］，DYX1C1基因表達(dá)的蛋白質(zhì)位于大腦皮層的神經(jīng)元與白質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，子宮內(nèi)RNA干擾抑制DYX1C1表達(dá)的大鼠可發(fā)生聽力加工與空間學(xué)習(xí)障礙［6］。DYX1C1基因-3C/T多態(tài)性位點(diǎn)位于DYX1C1基因啟動(dòng)子區(qū)，而啟動(dòng)子近側(cè)區(qū)域包含了控制轉(zhuǎn)錄起始的元件，因此該區(qū)域的基因多態(tài)性可以影響基因的轉(zhuǎn)錄功能，從而調(diào)節(jié)DYX1C1基因的表達(dá)［7］。本研究為進(jìn)一步證實(shí)和解釋DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)不同等位基因遺傳關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，通過體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞含DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)不同等位基因，探究DYX1C1基因rs3743205位點(diǎn)等位基因的功能研究。

為更接近神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)及去除不同細(xì)胞混雜因素影響，因此本次實(shí)驗(yàn)單獨(dú)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）是一種表達(dá)在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)細(xì)胞胞核特異性表達(dá)的蛋白之一［8］，其免疫反應(yīng)性陽性提示原代培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，含TT等位基因的重組質(zhì)粒的報(bào)告基因表達(dá)活性明顯高于含CC等位基因的重組質(zhì)粒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DYX1C1基因-3C/T位點(diǎn)在原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的作用，-3TT種基因型可能存在較強(qiáng)的啟動(dòng)子功能，并且-3C等位基因可能是兒童發(fā)展性閱讀障礙的易感基因。

綜述所述，本次研究在基因多態(tài)性全基因組關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)上，證實(shí)了DYX1C1基因啟動(dòng)子區(qū)-3C/T位點(diǎn)的功能。發(fā)現(xiàn)TT基因型對(duì)DYX1C1基因啟動(dòng)子活性有所增強(qiáng)，但是這種單個(gè)核苷酸變異影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的原因尚不清楚，有待今后進(jìn)一步研究不同等位核酸序列與核蛋白結(jié)合的能力。此項(xiàng)研究結(jié)果說明了探究?jī)和l(fā)展性閱讀障礙的易感基因結(jié)構(gòu)功能，為其易感人群作出早期預(yù)防與干預(yù)甚至心理行為矯治提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)具有相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)意義。

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Function Research on DYX1C1 Gene rs3743205 Site Gene Alleles

WANG Zhi-chao1，SHEN Li1，LIU De-shui1，LI Dan2，WU Tong1，ZHAO A-meng1，CUI Guang-cheng1
1.Qiqihara Medical College，Qigihar，Heilongjiang Province，161006 China；2.Qiqihara First Hospital，Qigihar，Heilongjiang Province，161006 China

R749.94 R179

A

1672-5654（2016）05（a）-0046-03

［項(xiàng)目編號(hào)］黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號(hào): 12541912）。

2016-02-18）