HBV相關性肝細胞癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)差異分析

楊可立　關玉娟　楊湛　肖艷華　李劍萍　張霞意　吳丹丹

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·論著·

HBV相關性肝細胞癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)差異分析

楊可立關玉娟楊湛肖艷華李劍萍張霞意吳丹丹

510060,廣州市第八人民醫(yī)院肝二科

【摘要】目的分析慢性乙型肝炎相關性肝細胞癌(HCC)患者肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)差異。方法利用Taqman real-time PCR檢測27例肝細胞癌患者肝癌切除術后石蠟包埋肝癌組織和癌旁組織PDCD1基因(PDCD1)拷貝數(shù)。結果肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)之間無顯著差異(P>0.05)；肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)與術前AFP水平無顯著相關性(P>0.05)；肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)與腫瘤組織惡性程度無顯著相關性(P>0.05)。結論PD1在腫瘤免疫逃逸反應中起作用，但肝癌組織及癌旁組織中其基因PDCD1的拷貝數(shù)變異并不是影響慢性乙型肝炎相關性肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的因素。

【主題詞】PD-1；PDCD1；肝細胞癌；基因;變異

Fund program: Guangzhou Medical and Health Science and Technology Project(20131A011072)

程序化死亡分子 (programmed death gene1，PD-1) 是B7/CD28 免疫球蛋白超基因家族重要成員，已被證實通過抑制T 細胞的活化和增殖來負調(diào)控免疫應答，并在調(diào)節(jié)免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PD-1 具有 PD-L1 及 PD-L2 兩個受體，均屬于 B7 家族成員，并參與腫瘤逃逸過程。研究發(fā)現(xiàn) PD-L1 可通 過 PD-1依賴和非依賴機制促進腫瘤特異性T 細胞的凋亡，通過 PD-1 依賴機制抑制T細胞增殖并促進患者體內(nèi)腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸反應[1]。在肝癌的研究中，國內(nèi)賀蘭湘等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤局部表達可溶性受體 sPD-1 分子能阻斷 PD-1/PD-L1 通路，可拮抗小鼠肝癌細胞 H22 通過 PD-L1 對 T 細胞的抑制作用，并顯著抑制 H22 腫瘤生長。有研究表明慢性HBV感染者PD-1的基因PDCD1(programmed cell death 1)拷貝數(shù)及其mRNA表達在肝癌組、重肝組、攜帶組等不同臨床表現(xiàn)的人群中的分布存在差異, PD-1基因多拷貝可能是HBV感染者發(fā)生肝癌的高危因素[3-4]。因此，本研究針對肝癌組織及癌旁組織PDCD1的基因拷貝數(shù)進行研究，分析肝癌腫瘤組織與癌旁組織PDCD1的基因拷貝數(shù)是否存在差異。

1對象與方法

1.1病例選擇研究對象來自2013年12月至2015年3月在廣州市第八人民醫(yī)院肝癌切除患者的石蠟包埋病理標本，病理診斷均為肝細胞癌，共32例，其中女性5例、男性26例，平均年齡49.4±9.6歲，全部病例HBsAg(+)，排除HIV、HCV感染，排除酒精相關性肝病及自身免疫性肝病。入院病例均未曾接受介入、射頻、化療、靶向治療等其他肝癌治療。

1.2試劑和儀器PDCDl基因Taqman拷貝數(shù)檢測試劑盒，內(nèi)參RNase P基因拷貝數(shù)檢測試劑盒，上述試劑盒均購自美國應用生物系統(tǒng)公司。QiagenDNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司。Applied biosystem 7500為美國 Applied biosystem公司產(chǎn)品。NanoDrop 2000為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1肝癌組織及癌旁組織DNA提取:HBsAg陽性的肝細胞癌患者手術切除肝癌及癌旁組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色。取10 μm厚切片8～10張，對照HE切片分別選取肝癌組織和癌旁組織，盡量避開腫瘤壞死、出血區(qū)域等。使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 進口檢測試劑盒提取組織基因組DNA。使用NanoDrop 2000確定DNA濃度，將提取的DNA稀釋至20～50 mg/L。

1.3.2使用Taqman real-time PCR測定基因拷貝數(shù):按照Taqman copy number assay RT-PCR配制反應體系，體系包括：2×TaqMan? Genotyping Master Mix 10 μl，20×TaqMan? Copy Number Assay(PDCD1基因引物)1 μl，20×TaqMan? Copy Number Reference Assay (RNase P) 1 μl，Nuclease-free water 4 μl，gDNA (5 ng/ μl) 4 μl，總反應體系20 μl。反應程序如下：95 ℃10 min后進行PCR循環(huán)，循環(huán)條件：95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，共40循環(huán)。使用Applied biosystem 7500 PCR儀進行以上反應，每個樣本重復3次。以RNase P為內(nèi)參，計算目的基因的相對拷貝數(shù)。將實驗所得Ct值導出，并導入copycaller軟件進行分析，得到樣本的目的基因相對拷貝數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。用獨立樣本的t檢驗比較肝癌組織與癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)差異，以及分析不同拷貝數(shù)病例的AFP水平差異和腫瘤組織惡性度差異。并采用spearman進行肝癌組織和癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)與術前AFP、腫瘤惡性程度相關性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.132例肝癌組織及癌旁組織PDCD1拷貝數(shù)檢測5例由于擴增失敗未能檢測成功。在27例肝癌組織中PDCD1基因拷貝數(shù)為1的占11.1%，拷貝數(shù)為2的占66.7%，拷貝數(shù)為3的占14.8%，拷貝數(shù)為4的占3.7%，拷貝數(shù)>4的占3.7%；癌旁組織中1個拷貝數(shù)的0例，2個拷貝數(shù)的占59.3%，3個拷貝數(shù)占33.3%，4個拷貝數(shù)占7.4%，>4個拷貝數(shù)的0例(表1)，但兩組間PDCD1基因拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.531，P>0.05)。

表1　肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)

2.2對肝癌組織PDCD1基因拷貝數(shù)與術前AFP水平進行spearman相關性分析得出相關系數(shù)為-0.08，P為0.691，無顯著相關性；拷貝數(shù)為2的病例與其他拷貝數(shù)病例的AFP水平差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.451,P>0.05)。癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)與術前AFP相關系數(shù)為0.169，P為0.399，無顯著相關性；拷貝數(shù)為2的病例與其他拷貝數(shù)病例的AFP水平亦差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.271,P>0.05)。

2.3肝癌組織PDCD1基因拷貝數(shù)與肝癌組織腫瘤分化程度二者相關系數(shù)-0.262(表2)，P為0.187，無顯著相關性；拷貝數(shù)為2的病例與其他拷貝數(shù)病例的肝癌組織病理惡性度分級差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.293,P>0.05)。癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)與肝癌組織病理惡性程度(見表1)相關系數(shù)為-0.149，P為0.457，無顯著相關性；拷貝數(shù)為2的病例與其他拷貝數(shù)病例的肝癌組織病理惡性度分級亦差異無統(tǒng)計學意義(t=0.524,P>0.05)。

表2　肝癌組織及癌旁組織PDCD1基因拷貝數(shù)分布與腫瘤分化程度

3討論

在控制腫瘤細胞的生長、擴散和復發(fā)過程中，T細胞介導的免疫應答有著重要的作用。T細胞的活化需要雙信號作用，第一信號來自抗原肽-MHC復合物與T細胞表面受體(TCR)結合。第二信號來自抗原呈遞細胞(APC)上協(xié)同刺激分子與T細胞表面上相應受體的結合[5]。協(xié)同刺激分子影響T細胞發(fā)育、活化、增殖、起效、凋亡的各個階段[6]。缺少協(xié)同刺激分子提供的第二信號，會導致T細胞不能充分活化，使效應T細胞被誘導呈無能狀態(tài)或凋亡，進而使得腫瘤逃脫機體的免疫監(jiān)控。

近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤免疫逃逸反應中，PD-1/PD-L1 通路可抑制腫瘤特異性T細胞的活化，下調(diào)T細胞的腫瘤免疫反應。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 通路在肝細胞癌中也有T細胞抑制作用。PD-l的基因PDCD1位于人類基因組2q37.3，位于已發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)區(qū)域。研究表明，CNVs可通過基因的數(shù)量效應及結構變化對基因的表達產(chǎn)生影響，從而影響疾病的易感性和進展[7-8]。研究PD-1的基因CNVs是從宿主的遺傳背景探討慢性HBV感染相關性HCC的發(fā)病原因的新的探索。目前研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者PDCD1的基因拷貝數(shù)分布及其mRNA表達與慢乙肝組有差異。但本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織與癌旁組織的PDCD1基因拷貝數(shù)無顯著差異，同時其拷貝數(shù)與AFP水平及腫瘤分化程度無顯著相關性。進一步分析發(fā)現(xiàn)不同PDCD1的基因拷貝數(shù)病例間的AFP水平和腫瘤分化程度均無顯著差異。表明PDCD1的基因的拷貝數(shù)在肝癌組織及癌旁組織中的變異并不影響腫瘤分化程度。

既往研究表明肝癌患者PDCD1的基因拷貝數(shù)分布與非肝癌患者有差異，推測PDCD1的基因拷貝數(shù)變異是影響肝癌發(fā)生的因素之一。而通過本研究發(fā)現(xiàn)其拷貝數(shù)變異與腫瘤的分化無明顯相關，推測與HCC的預后相關性不大。同時PD-1的配體PD-L1在肝癌組織中的變化情況有待進一步研究?，F(xiàn)已在進行抗PD-1抗體治療HCC的臨床研究，因此明確PD-1/PD-L1通路在個體中是否存在差異及其差異的原因更有利于完善該免疫治療方案，同時也可以為篩查HCC好發(fā)人群提供新的標志物。

4參考文獻

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通信作者：楊可立，Email：conco@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.007

基金項目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20131A011072)

(收稿日期：2016-04-18)

Analysis of PDCD1 gene copy number differences between hepatocellular carcinoma tissues and paracancerous tissues of patients with HBV-related HCC

YangKeli,GuanYujuan,YangZhan,XiaoYanhua,LiJianping,ZhangXiayi,WuDandan

Guangzhou8thPeople’sHospital,Guangzhou510060,ChinaCorrespondingauthor:YangKeli,Email：conco@163.com

【Abstract】ObjectiveTo analyze the differences in the PDCD1 gene copy number of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues in patients with hepatocellular carcinoma(HCC)after HBV infection. MethodsAnalysis PDCD1 gene copy number of 27 paraffin embedded specimens of hepatocellular carcinoma tissues and para carcinoma tissues of patients with hepatocellular carcinoma after resection by Taqman real-time PCR. ResultsThe gene copy number of PDCD1 of hepatocellular carcinoma tissue and paracancerous tissue had no significant difference (P>0.05); the gene copy number of PDCD1 and preoperative AFP levels of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues had no significant correlation (P>0.05).Gene copy number of PDCD1 of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues had no significant correlation with tissue tumor malignant degree (P>0.05). ConclusionsPD-1 plays a role in the escape response of tumor immunity, but the PDCD1 gene copy number variation of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues is not a factor in carcinogenesis and development of hepatocellular carcinoma.

【Key words】PD-1;PDCD1; Hepatocellular carcinoma;Gene;Variation