劃痕損傷對(duì)大鼠大腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞N F-κB表達(dá)及繼發(fā)性死亡的影響*

黃梓雄，陳兵，聶麗容，林亨，莫偉，尹延慶，梁遠(yuǎn)生

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

劃痕損傷對(duì)大鼠大腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞N F-κB表達(dá)及繼發(fā)性死亡的影響*

黃梓雄，陳兵，聶麗容，林亨，莫偉，尹延慶，梁遠(yuǎn)生

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

目的通過體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞并制作劃痕損傷模型，觀察劃痕損傷對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞N F-κB表達(dá)及其自噬、凋亡和壞死的影響。方法體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞并制作劃痕損傷模型，應(yīng)用N F-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PD TC）干預(yù)劃痕損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。隨機(jī)分為對(duì)照組、單純損傷組、損傷+抑制組，在不同時(shí)間點(diǎn)（損傷后1、6、12、24及48 h）分別應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定磷酸化N F-κB p65蛋白的表達(dá)，Annexi n V/PI染色法檢測(cè)凋亡、壞死，W es t ern bl ot檢測(cè)自噬蛋白LC 3Ⅱ表達(dá)情況。對(duì)照組為無(wú)劃痕損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕損傷后N F-κB蛋白表達(dá)于傷后1 h開始表達(dá)增強(qiáng)，于24 h達(dá)高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。凋亡、壞死及自噬各指標(biāo)均隨時(shí)間推移有不同程度升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而經(jīng)PD TC處理后上述變化均受不同程度的抑制，與單純損傷組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論劃痕損傷后可激活腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞N F-κB表達(dá)，同時(shí)可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬、凋亡和壞死。

劃痕損傷；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；N F-κB；吡咯醛二硫氨基甲酸

大腦內(nèi)有極豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，整個(gè)人腦的微血管內(nèi)皮表面積約20 m2。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brai n m i crovascul ar endot hel i al cel l s，BM EC）是血腦屏障的最主要成分，具有特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能特征。不僅在基因、蛋白質(zhì)組水平上與其他內(nèi)皮細(xì)胞有明顯差異［1］，而且具有細(xì)胞間緊密連接、高跨內(nèi)皮阻抗、缺乏窗孔結(jié)構(gòu)、極少的胞飲小泡以及選擇性雙向跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等獨(dú)有的特征［2］，使血腦屏障成為一個(gè)限制大多數(shù)極性分子和蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的選擇性低滲透性屏障［3］。以往忽視了BM EC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用，隨著“血管神經(jīng)單元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并對(duì)腦血管疾病的深入研究，逐漸認(rèn)識(shí)到神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與BM EC的伙伴關(guān)系，BM EC可以膠質(zhì)細(xì)胞為橋梁與神經(jīng)元進(jìn)行信息交流發(fā)揮重要作用。但目前對(duì)BM EC機(jī)械性損傷的研究較少，BM EC在腦損傷后多條信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，而NF-κB所參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用還有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過制作大鼠BM EC的體外劃痕損傷模型，從而消除在體時(shí)炎癥、缺血、感染等多種因素的干擾，研究劃痕損傷對(duì)BM EC內(nèi)NF-κB表達(dá)以及自噬、凋亡、壞死的影響，探討腦損傷后BM EC繼發(fā)性死亡的機(jī)制，為治療腦損傷尋求新的治療策略。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康新生SD大鼠80只，鼠齡24 h，不限雌雄，重量5～8 g，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分批實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑胎牛血清（FBS）、DM EM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gi bco公司，PDTC、NF-κB免疫熒光試劑盒、SDS購(gòu)自Si gm a公司，F(xiàn)ITC Annexi n V Apopt osi s Det ect i on ki t凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG為Abcam公司產(chǎn)品，兔抗鼠磷酸化NF-κB p65單克隆抗體、兔抗鼠LC3B單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為Cel l Si gnal i ng公司產(chǎn) 品 ，PVDF膜 （PVDF0.22μm） 為 M i l l pore Bi ot echnol ogy公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器Therm o細(xì)胞培養(yǎng)箱，Lei ca倒置顯微鏡，Lei ca激光掃描共聚焦顯微鏡，BD流式細(xì)胞儀，Kodak X光自動(dòng)洗片機(jī)，Seri al垂直轉(zhuǎn)移電泳槽。

1.2方法

1.2.1腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化及鑒定

參照文獻(xiàn)［4］的方法并加以改良進(jìn)行體外原代培養(yǎng)及純化SD大鼠大腦皮層BM EC：取24 h內(nèi)新生SD大鼠75%的酒精浸泡消毒，在無(wú)菌冷凍條件下取大腦皮質(zhì)，剝離腦膜及血管血塊，將腦皮質(zhì)置于DM EM培養(yǎng)液中剪碎成1 m m3的小塊，移入15 m l離心管，加入DM EM至2 m l，加0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）2 m l，37℃消化10～20 m i n，持續(xù)震搖。加入終濃度為10%的胎牛血清終止消化，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清。加含胎牛血清的DM EM洗滌2次，吸管輕輕吹打，棄去經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過篩的濾液，用DM EM液反復(fù)沖洗下濾網(wǎng)上的組織。經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過篩并收集濾液，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液。加入0.1%Ⅱ型膠原酶1～2 m l（用量據(jù)組織多少而定），37℃水浴震蕩消化15～25 m i n，加入含血清培養(yǎng)基終止消化后，吹打使混勻，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液。加完全培養(yǎng)基后輕輕吹打使其混勻，接種于已鋪有明膠的培養(yǎng)皿上，靜置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)液。之后每隔2～3 d更換培養(yǎng)液，約7～10 d見細(xì)胞融合鋪滿時(shí)即可進(jìn)行純化傳代。純化傳代：選取培養(yǎng)至近融合狀態(tài)的細(xì)胞，吸棄原培養(yǎng)基，予37℃預(yù)熱的DM EM液清洗2遍，加入1∶1的0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化液，置培養(yǎng)箱中37℃消化1～2m i n。在相差顯微鏡下觀察，見大部分細(xì)胞收縮變圓、間隙增大時(shí)，即刻加入1～2 m l完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞脫壁，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清。加完全培養(yǎng)基，混勻后按照1∶2接種于2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，孵育4 h取出，吸去未貼壁的細(xì)胞并更換完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞重新生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，重復(fù)上述操作處理2～3次，便可得到純度較高的大鼠BM EC。鑒定：將已純化好的細(xì)胞消化傳代接種于放有細(xì)胞培養(yǎng)專用蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合狀態(tài)時(shí)，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入固定液固定5～15 m i n，吸除固定液，用洗滌液洗3次，每次3～5 m i n，滴加免疫染色封閉液至充分蓋住樣品，室溫封閉1 h，吸去免疫染色封閉液，滴加1 m l兔抗大鼠第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體（抗體用一抗稀釋液稀釋，1∶100），用一抗稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照，37℃孵育1 h或4℃孵育過夜。吸出一抗，洗滌液洗3次，每次5～10 m i n，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 1 m l（二抗稀釋液稀釋，1∶100），室溫孵育1 h。吸出二抗，洗滌液洗滌2次，每次5～10 m i n；加入細(xì)胞核染色液（PI）使充分蓋住樣品，室溫染色5 m i n左右，吸除細(xì)胞核染色液，用洗滌液洗滌3次，每次3～5 m i n；加適量抗熒光淬滅封片液并用蓋玻片封片，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。胞漿中第Ⅷ因子相關(guān)抗原的染色為綠色熒光，細(xì)胞核的PI染色為紅色熒光。高倍鏡下各取5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)，求其平均值，檢測(cè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度。

1.2.2體外培養(yǎng)腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立參考文獻(xiàn)［5-6］損傷模型的方法加以改良。將經(jīng)2次傳代純化滿意的BM EC傳代種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿。將預(yù)先設(shè)計(jì)好的標(biāo)準(zhǔn)模板（其上劃有縱、橫平行線，間距均為4 m m）置于培養(yǎng)板底部，吸除培養(yǎng)液，PBS液輕柔洗滌2遍，無(wú)菌環(huán)境直視下使用20μl微量移液器，t i p頭嚴(yán)格按模板線條用力均勻地制成縱、橫劃痕損傷，劃痕寬度約1 m m。確保實(shí)驗(yàn)所用的BM EC損傷范圍和程度一致。

1.2.3PD TC干預(yù)劃痕損傷后BM EC的實(shí)驗(yàn)分組處理BM EC經(jīng)傳代純化滿意后，傳代種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿融合后，隨機(jī)平均分成對(duì)照組、單純損傷組、損傷+抑制組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。分組處理前先吸除培養(yǎng)板中的原培養(yǎng)液并用PBS液輕柔沖洗2遍。對(duì)照組加入含10μl PBS液、10%FBS的DM EM培養(yǎng)液3 m l；單純損傷組按1.2.2方法建立劃痕損傷模型，然后加入與對(duì)照組相同的培養(yǎng)液；損傷+抑制組同單純損傷組建立損傷模型，然后加入含PDTC 10μl、10%FBS的DM EM培養(yǎng)液3m l（PDTC的終濃度為20μm ol/L）。各組分別于處理后1、6、12、24及48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)磷酸化N F-κB P65蛋白的表達(dá)棄去培養(yǎng)液，用冷PBS洗2遍，固定液固定30 m i n，洗滌2遍，滴加免疫染色封閉液，室溫封閉1 h，吸去封閉液后滴加一抗（1∶100稀釋的兔抗鼠磷酸化的NF-κB p65單克隆抗體）濕化盒中4℃孵育過夜。洗滌2遍，加二抗（1∶100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG），37℃避光孵育1 h，洗滌2遍，激光共聚焦顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用0.01 m ol/L PBS代替一抗。以細(xì)胞核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無(wú)綠色熒光為陰性細(xì)胞。利用Lei ca Conf ocal圖像分析軟件對(duì)熒光結(jié)果進(jìn)行圖像分析，得出各組陽(yáng)性細(xì)胞不同熒光強(qiáng)度值，從而得出各組中不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化NF-κB P65蛋白表達(dá)的程度。

1.2.5Annexi n V/PI apopt os i s ki t檢測(cè)凋亡及壞死收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管中，用0.25%不含EDTA胰酶消化細(xì)胞至細(xì)胞可以被移液管或槍頭輕輕吹打下來(lái)時(shí)，終止消化。將細(xì)胞吹打下來(lái)，細(xì)胞懸液移至上述收集細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管內(nèi)混勻，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液后冷PBS液洗滌細(xì)胞2次。用500μl Bi ndi ng Buf f er懸浮細(xì)胞，滴加5μl Annexi n V-FITC并輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育15m i n。滴加5μl PI后輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育5 m i n。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，每個(gè)樣本均獲取10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.6W es t ern bl ot檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白LC 3Ⅱ表達(dá)情況于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，分裝，保存于-80℃冰箱中。等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用封閉液室溫下?lián)u動(dòng)封閉1h，一抗（抗LC3 1∶1 000）4℃過夜，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔1∶5 000）室溫1 h。以上步驟操作后均用TBST緩沖液洗膜（15 m i n×3次），ECL顯色，X光片曝光，X光自動(dòng)洗片機(jī)洗片顯影。膠片掃描、拍照，采用Im age J軟件采集結(jié)果圖像，取檢測(cè)蛋白與內(nèi)參灰度值的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同處理組、不同時(shí)間點(diǎn)的組內(nèi)比較用單因素方差分析，多重比較用LSD檢驗(yàn)法或SNK檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)SD大鼠BM EC形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下見分離的腦微血管段長(zhǎng)短不等、形態(tài)各異，呈單支或多支狀（見附圖A）。經(jīng)膠原酶消化后，微血管管壁不清，但壁上BM EC清晰可見。培養(yǎng)24 h后，見微血管片段大部分已貼壁，BM EC從貼壁的微血管段周圍爬出，細(xì)胞多呈短梭形或多角形，排列不規(guī)則，核淡，胞膜明顯。培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞分裂增殖形成散在細(xì)胞群落，呈旋渦狀生長(zhǎng)。7～9 d細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、多角形，融合成片，排列緊密，互不重疊，形成致密的單層細(xì)胞，呈典型的“鋪路石”征象。初種的傳代細(xì)胞呈明亮的圓球形，懸浮于培養(yǎng)液中，4 h后大部分貼壁，細(xì)胞呈扁平狀，24 h后胞體變大。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，BM EC多呈三角形、長(zhǎng)梭形，約7～9 d，BM EC增殖成單層片狀（見附圖B）。免疫細(xì)胞熒光染色后，鏡下所有的細(xì)胞核呈紅色熒光，含第Ⅷ因子相關(guān)抗原的細(xì)胞漿呈綠色熒光，標(biāo)記為陽(yáng)性細(xì)胞（見附圖C）。以隨機(jī)5個(gè)不同視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例為細(xì)胞的純度，本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的BM EC純度約90%。將細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%匯合狀態(tài)時(shí)，便可進(jìn)行劃痕（見附圖D）和藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

附圖　腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

2.2免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)磷酸化N F-κB p65蛋白表達(dá)

損傷后1 h各組磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)量?jī)蓛杀容^差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)NF-κB表達(dá)量逐漸增加，以24 h時(shí)改變最顯著，單純損傷組從6 h始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），48 h與24 h比較變化不明顯。損傷+抑制組于加入NF-κB抑制劑PDTC后，24 h始增加，6 h始NF-κB蛋白的表達(dá)較單純損傷組有所減少，與單純損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3凋亡及壞死情況

1 h單純損傷組與損傷+抑制組凋亡程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，損傷組細(xì)胞凋亡程度相應(yīng)增大。自6 h始單純損傷組與損傷+抑制組比較，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單純損傷組的凋亡程度總體大于損傷+抑制組，凋亡的峰值出現(xiàn)在24 h（見表2）。對(duì)照組在細(xì)胞正常代謝狀態(tài)下壞死不明顯，與抑制組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。損傷后細(xì)胞壞死明顯，單純損傷組及損傷+抑制組細(xì)胞壞死程度自1 h始即與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而單純損傷組與損傷+抑制組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，損傷+抑制組壞死程度總體低于單純損傷組，自6 h始兩組間壞死程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24 h壞死達(dá)高峰（見表3）。

表1　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化N F-κB p65熒光值比較 （n=3，±s）

表1　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化N F-κB p65熒光值比較 （n=3，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與單純損傷組比較，P＜0.05

組別4 8 h對(duì)照組　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 1 ± 0 . 0 3 　1 . 0 5 ± 0 . 0 5 　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 2 ± 0 . 0 5單純損傷組　1 . 5 2 ± 0 . 0 41）　2 . 6 4 ± 0 . 0 61）　3 . 6 4 ± 0 . 1 61）　6 . 0 2 ± 0 . 1 21）　6 . 0 3 ± 0 . 1 01）損傷+抑制組　1 . 5 2 ± 0 . 0 21）　1 . 5 3 ± 0 . 0 31）2）　1 . 5 2 ± 0 . 0 51）2）　4 . 4 5 ± 0 . 0 21）2）　3 . 6 2 ± 0 . 0 21）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表2　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡百分率的比較 （n=3，±s）

表2　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡百分率的比較 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對(duì)照組　1 0 . 7 0 ± 0 . 1 71）　1 0 . 5 7 ± 0 . 7 11）　1 0 . 4 3 ± 0 . 7 01）　1 1 . 2 7 ± 1 . 1 01）　1 1 . 6 0 ± 0 . 5 31）單純損傷組　1 2 . 3 7 ± 0 . 3 52）　1 3 . 7 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 5 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 5 62）　1 6 . 2 3 ± 0 . 5 72）損傷+抑制組　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 12）　1 2 . 7 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 8 0 ± 1 . 1 11）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 3 61）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 8 11）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

2.4自噬情況

在1 h，單純損傷組、損傷+抑制組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。損傷后6 h始單純損傷組與損傷+抑制組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），24 h達(dá)高峰。見表4。

表3　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)壞死情況比較 （n=3，±s）

表3　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)壞死情況比較 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對(duì)照組　1 . 5 0 ± 0 . 2 01）　1 . 4 7 ± 0 . 3 11）　1 . 5 3 ± 0 . 5 6 　1 . 5 6 ± 0 . 3 51）　1 . 6 0 ± 0 . 5 31）單純損傷組　1 2 . 3 0 ± 0 . 3 02）　1 3 . 8 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 6 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 4 62）　1 6 . 2 7 ± 0 . 5 12）損傷+抑制組　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 82）　1 2 . 8 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 7 7 ± 1 . 1 21）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 2 61）2）　1 3 . 8 3 ± 0 . 1 51）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表4　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)LC 3 I I表達(dá)與內(nèi)參蛋白表達(dá)比值 （n=3，±s）

表4　各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)LC 3 I I表達(dá)與內(nèi)參蛋白表達(dá)比值 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對(duì)照組　0 . 1 4 ± 0 . 0 21）　0 . 1 6 ± 0 . 0 11）　0 . 1 7 ± 0 . 0 1 　0 . 1 9 ± 0 . 0 11）　0 . 2 0 ± 0 . 0 11）單純損傷組　0 . 2 4 ± 0 . 0 22）　0 . 5 5 ± 0 . 0 22）　0 . 7 7 ± 0 . 0 92）　1 . 2 1 ± 0 . 0 42）　1 . 1 8 ± 0 . 0 42）損傷+抑制組　0 . 2 5 ± 0 . 0 32）　0 . 2 5 ± 0 . 0 21）2）　0 . 2 6 ± 0 . 0 3 　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

3　討論

既往忽視了BM EC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用，隨著“血管神經(jīng)單元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并對(duì)腦血管疾病的深入研究，逐漸認(rèn)識(shí)到神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與BM EC的伙伴關(guān)系，BM EC可以膠質(zhì)細(xì)胞為橋梁與神經(jīng)元進(jìn)行信息交流，發(fā)揮著重要作用。對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后早期BM EC的超微結(jié)構(gòu)觀察可見線粒體等超微結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列病理改變，甚至部分血管可見內(nèi)皮斷裂，內(nèi)皮細(xì)胞消失［7-8］。應(yīng)用中藥通絡(luò)救腦注射液作用于BM EC后收集到的條件培養(yǎng)液中神經(jīng)元的生存活性明顯提高［10］。所以BM EC在腦損傷后的生存和死亡將直接影響到神經(jīng)細(xì)胞的生存。

NF-κB以非活化形式廣泛存在于靜止期細(xì)胞的胞質(zhì)中，多以蛋白二聚體與其特異性抑制蛋白IκB（i nhi bi t or κB，IκB）形成三聚體。當(dāng)細(xì)胞受到刺激，IκB發(fā)生磷酸化而失活，暴露出活性的p50-p65；或因p105的C-端磷酸化降解從而形成活性的p50-p65復(fù)合體。p50-p65轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與目標(biāo)基因增強(qiáng)子的GGGRNNYY-CL序列結(jié)合，從而啟動(dòng)或調(diào)節(jié)早期反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等［10-14］。而抗氧化劑PDTC可特異性阻斷NF-κB的傳導(dǎo)通路［15］。細(xì)胞的繼發(fā)性死亡形式有3種：包括自噬、凋亡和壞死。腦損傷后NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)BM EC繼發(fā)性死亡的影響逐漸成為研究熱點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，損傷后BM EC內(nèi)的NF-κB被激活，具有活性的磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)量隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，損傷后12 h至24 h增加較快，于24 h達(dá)峰值，但48 h與24 h比較變化不明顯。而且損傷后體外培養(yǎng)的 BM EC內(nèi)NF-κB表達(dá)有一定的時(shí)間依賴性，與在體顱腦損傷后NF-κB的表達(dá)水平［16］基本一致。與此同時(shí)，損傷后BM EC的自噬、凋亡及壞死的相關(guān)指標(biāo)也有不同程度的增加。而在損傷后加入NF-κB抑制劑PDTC后，磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)量較單純損傷組有所減少；相應(yīng)地，BM EC的自噬、凋亡及壞死的相關(guān)指標(biāo)也較單純損傷組有不同程度的減少。推測(cè)劃痕損傷可能通過激活NF-κB表達(dá)進(jìn)而引發(fā)下游反應(yīng)，從而引起B(yǎng)M ECs的自噬、凋亡及壞死。劃痕損傷后1 h至12 h自噬和凋亡指標(biāo)明顯增加，而壞死于12 h后明顯增加，于24 h各項(xiàng)指標(biāo)幾乎達(dá)到峰值。推測(cè)，激活NF-κB通路后，早期BM EC以凋亡和自噬這種自我保護(hù)形式為主，至晚期細(xì)胞炎癥因子大量表達(dá)，或凋亡、自噬過分表達(dá)，則以壞死為主。提示合理使用NF-κB抑制藥物（如PDTC）可以有效緩解腦損傷后BM EC各種死亡的程度，保持血腦屏障的完整性，穩(wěn)定腦組織內(nèi)環(huán)境，從而改善顱腦損傷的預(yù)后。與此同時(shí)，應(yīng)用PDTC抑制NF-κB信號(hào)通路后，BM EC的凋亡、自噬及壞死進(jìn)程并未被徹底阻斷，可能是PDTC不能完全阻斷NF-κB信號(hào)通路的活化，亦不能完全排除NF-κB通路通過其他機(jī)制參與BM EC死亡而不能被PDTC所抑制的情況。凋亡、自噬及壞死是多通路、多環(huán)節(jié)、緊密聯(lián)系并互相影響的復(fù)雜體系［17-19］，關(guān)于調(diào)節(jié)BM EC凋亡、自噬和壞死的更深一步機(jī)制以及細(xì)胞信號(hào)通路之間的交叉作用需要進(jìn)一步深入研究。

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（申海菊編輯）

Effects of scratching damage on NF-κB expression in brain microvascular endothelial cells and secondary death of rats*

Zi-xiong Huang，Bing Chen，Li-rong Nie，Heng Lin，Wei Mo，Yan-qing Yin，Yuan-sheng Liang
（The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong 524001，China）

Objective To culture brain microvascular endothelial cells（BMECs）of SD ratsin vitroand construct a model of scratching injury，so as to observe the effect of scratching injury on NF-κB expression as well as autophagy，apoptosis and necrosis of of BMECs.Methods BMECs of SD rats were culturedin vitroand scratching injury was implemented，then the cells were treated with pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），an NF-κB inhibitor.The cells were randomly devided into control group，simple-injury group and injury-inhibition group.At 1，6，12，24 and 48 hours after injury，NF-κB p65 expression was measured using immunofluorescent cytochemistry assay，apoptosis and necrosis of the cells were determined by Annexin V/PI staining，and expression of autophagy-related protein LC3 II was determined by Western blot.An uninjured group of BMECs was set as control.Results After scratching injury，NF-κB expression of the BMECs was enhanced from 1 h after injury，and peaked at 24 h，significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.Indicators for apoptosis，necrosis and autophagy all increased to different extents as time went on，and they showed significant differences from those of the control group（P＜0.05）；while PDTC treatment following injury significantly inhibited these changes（P＜0.05）.Conclusions Scratching damage activates NF-κB expression of BMECs and causes autophagy，apoptosis and necrosis of BMECs.

scratching damage；BMEC；NF-κB；PDTC

R 651.15

A

1005-8982（2016）05-0011-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.003

2015-10-21
*

2012年廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年科研基金（No：Qk1308）；2013年廣東醫(yī)學(xué)院青年科研基金（No：XQ1315）；2014年度湛江市非資助科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No：湛科［2014］27號(hào)2014B101）

陳兵，E-m ai l：ChenBabee0@yeah.net