正加速度暴露對大鼠腸黏膜通透性的影響*

邱杰，唐合蘭，陳英，王建昌，顏偉，楊春敏

（中國人民解放軍空軍總醫(yī)院 干部病房，北京 100142）

正加速度暴露對大鼠腸黏膜通透性的影響*

邱杰，唐合蘭，陳英，王建昌，顏偉，楊春敏

（中國人民解放軍空軍總醫(yī)院 干部病房，北京 100142）

目的分析正加速度（+Gz）暴露下大鼠外周血D-乳酸及二胺氧化酶（DAO）含量的變化，探討+Gz暴露對大鼠腸黏膜通透性的影響及機制。方法32只雄性SD大鼠隨機分成4組，每組8只，分別標記為A組（正常對照組）、B組（+5 Gz組）、C組（+10 Gz組）、D組（重復暴露組）。采用動物離心機模擬+Gz暴露，B、C組大鼠分別以+5和+10 Gz暴露5 min，D組大鼠重復暴露于+5 Gz 1.5 min，+10 Gz 2 min，+5 Gz 1.5 min，除A組外，其他各組大鼠每日暴露1次，持續(xù)5 d。實驗結(jié)束后次日麻醉大鼠，取大鼠腸黏膜標本及外周血清，鏡下觀察大鼠腸道組織病理學特點，并檢測各組大鼠血清D-乳酸及DAO水平。結(jié)果除A組外，其他各組大鼠小腸組織肉眼及光鏡下觀察均有損傷，損傷程度D組＞C組＞B組；與A組比較，其他各組大鼠血清D-乳酸及DAO水平均明顯升高（P＜0.05），血清D-乳酸水平C組低于D組（P＜0.01）；血清DAO水平B組低于C組和D組（P＜0.05）。結(jié)論+Gz暴露可增加大鼠腸道黏膜通透性，破壞大鼠腸道機械屏障，損傷程度與+Gz暴露值有關(guān)。

正加速度；腸道通透性；機械屏障；D-乳酸；二胺氧化酶

腸道是機體與外界直接發(fā)生聯(lián)系的組織之一。腸道不斷遭受各種抗原刺激物（如食物蛋白、細菌及其降解產(chǎn)物等）的損傷，所以必須具有超強的抗損傷能力及阻礙各種有害物質(zhì)進入機體的功能。腸道的這種屏障功能稱為腸道屏障［1］。腸道屏障由機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障組成。隨著對腸道屏障研究的逐漸深入，許多學者發(fā)現(xiàn)，機械屏障是腸道屏障最為重要的組成部分，其功能的正常發(fā)揮主要依賴于腸黏膜上皮細胞及細胞間緊密連接的完整性［2］，當腸道黏膜完整性受損，通透性增高時，血清中D-乳酸及二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平也明顯升高，二者是反映腸黏膜機械屏障功能的良好指標。隨著現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機的不斷發(fā)展，對戰(zhàn)斗機的機動性要求越來越高，使得飛行員在飛行過程中必須承受遠遠超出人類生理耐受力的加速度，對飛行員的身體健康造成極大威脅，據(jù)統(tǒng)計，在航空航天醫(yī)學中，消化系統(tǒng)疾病位居飛行員住院原因的前3位［3］，加速度暴露對機體的影響與防護依然是目前航空航天醫(yī)學的主要研究課題之一。本研究通過模擬正加速度（positive acceleration，+Gz）模型，檢測+Gz暴露下大鼠外周血D-乳酸及DAO水平，以探討+Gz暴露對大鼠腸黏膜機械屏障的損傷及機制，進而為飛行員腸病的防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

32只雄性SD大鼠［中國軍事科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）-2015-0004］，體重（180± 10）g。領回大鼠后適應性喂養(yǎng)1周。喂養(yǎng)條件：中央恒溫下飼養(yǎng)，溫度（23±2）℃，保持定時通風及適當濕度，食用大小鼠維持飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司），自由飲食。將大鼠隨機分成4組，分別標記為正常對照組（A組）、+5 Gz組（B組）、+10 Gz組（C組）、重復暴露組（D組）組，每組8只。

1.2試劑與儀器

動物離心機，由航天航空醫(yī)學研究所提供，動物離心機是在地面條件下模擬飛行時加速度的設備，離心機轉(zhuǎn)臂半徑1 m，采用梯形+Gz作用曲線，G值增長率一般為1 G/s，由計算機程序進行控制，可模擬出不同加速度值、增長率和作用時間。DAO試劑盒，購自南京建成科技有限公司，D-乳酸試劑盒，購自博世生物技術(shù)有限公司。臺式離心機、925低溫冰箱、分光光度儀、戊巴比妥鈉、無菌動物手術(shù)器械均由航天航空醫(yī)學研究所提供。

1.3正加速度暴露方法

本實驗采用動物離心機模擬+Gz暴露。實驗時采用特制的固定裝置承載實驗動物，將實驗動物俯面固定于離心機轉(zhuǎn)臂遠端，頭朝向離心機軸心方向，每只實驗動物專用1個固定盒。每次4只大鼠同時上機。A組大鼠不做處理，B組大鼠以+5 Gz旋轉(zhuǎn)5 min，C組大鼠以+10 Gz旋轉(zhuǎn)5 min，D組大鼠暴露于+5 Gz 1.5 min，+10 Gz 2 min，+5 Gz 1.5 min。每日暴露1次，持續(xù)5 d。

1.4標本采集與指標測定

+Gz暴露5 d后所有大鼠禁食不禁水12 h，稱重量后用3%戊巴比妥鈉按1.5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，固定大鼠，剃毛后沿大鼠腹正中線打開腹腔，手術(shù)切口約2 cm，輕輕撥開腹腔臟器，暴露腹主動脈，采集血標本4 ml，立即全血離心（4℃、3 000 r/min離心15 min），取上清液置于離心管（Eppendorf，EP）管中，置入-80℃冰箱冷凍保存，比色法檢測腸黏膜D-乳酸及DAO水平，具體操作方法嚴格參照試劑盒說明書進行。游離小腸組織，肉眼觀察小腸組織特點，在距幽門10 cm處取2 mm×10 mm的小腸組織，40 g/L的中性甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色處理后，在光學顯微鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間正態(tài)分布的計量資料比較用單因素方差分析（One-way，ANOVA），LSD進行組間均數(shù)的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1正加速度暴露前后大鼠小腸組織大致肉眼觀

正常對照組大鼠小腸黏膜呈淡紅色，表面光滑完整，無充血、水腫，無出血、糜爛（見圖1A）；+Gz暴露后的小腸組織出現(xiàn)散在出血點，+10 Gz組和重復暴露組可見條索狀出血帶，嚴重者可見大面積出血斑，伴有周圍組織彌漫性充血、水腫及明顯糜爛（見圖1B）。

圖1　正常對照組及+Gz暴露后小腸組織大致肉眼觀

2.2正加速度暴露下各組大鼠小腸黏膜光鏡下病理特征

正常對照組大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛較長，呈指狀突起，排列整齊、密集，少量淋巴細胞浸潤；+5 Gz組大鼠小腸黏膜固有層水腫，部分絨毛高度縮短，絨毛間隙增寬，排列不整齊，少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；+10 Gz組大鼠小腸黏膜固有層萎縮，絨毛間隙顯著增寬，部分絨毛融合、縮短，絨毛橫徑增寬，排列不整齊，部分上皮細胞變形、壞死，大量淋巴細胞浸潤；重復暴露組大鼠小腸黏膜絨毛萎縮、低矮，隱窩變淺，絨毛間排列雜亂，上皮細胞變性、壞死、脫落，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤?？梢?Gz暴露值越高，黏膜損傷越重，重復暴露組損傷最重。見圖2。

圖2　正加速度暴露下大鼠小腸黏膜光鏡下病理特征（HE染色×40）

2.3正加速度暴露后各組大鼠血清D-乳酸及DAO水平

各組大鼠血清D-乳酸水平比較，+5 Gz組、+10 Gz組、重復暴露組均高于正常對照組（t=6.055、5.499 和15.498，P=0.000）；+5Gz組低于+10 Gz組，但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.178，P=0.861）；+10 Gz組低于重復暴露組（t=5.372，P=0.000）。

各組大鼠血清DAO水平比較，+5 Gz組、+10 Gz組、重復暴露組均高于正常對照組（t=3.244、4.867 和7.741，P=0.000）；+5 Gz組低于+10 Gz組（t=2.429，P=0.029），+10 Gz組雖然低于重復暴露組，但差異無統(tǒng)計學意義（t=1.446，P=0.170）。可見+Gz值越高，D-乳酸及DAO的水平相對越低。見圖3和附表。

圖3　比色法測定各組大鼠血清DAO、D-乳酸水平

附表　不同正加速度暴露后實驗性大鼠血清D-乳酸及DAO的含量 （n=8±s）

附表　不同正加速度暴露后實驗性大鼠血清D-乳酸及DAO的含量 （n=8±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與+5 Gz組比較，P＜0.05；3）與+10 Gz組比較，P＜0.05

組別DAO/（u/L）正常對照組　0.31±0.98　3.56±1.21 +5 Gz組　0.69±0.151）　7.82±3.511）+10 Gz組　0.71±0.171）　12.54±4.231）2）重復暴露組　1.07±0.981）3）　15.71±4.541）F值　44.915　17.400 P值　0.000　0.000 D-乳酸/（mmol/L）

3　討論

飛行員在高空飛行時，產(chǎn)生的向心加速度方向是由座艙底部到座艙蓋，同時飛行員也會受到與加速度方向相反的慣性離心力作用，其方向由頭端指向足，航空醫(yī)學中稱此為+Gz［4］。近年來，國內(nèi)外學者多數(shù)利用離心機模擬加速度暴露進行相關(guān)實驗研究［5-7］。與以往研究一樣，本研究采用的動物離心機由計算機程序控制，操作準確，方便，可重復。目前已有大量研究證實+Gz暴露可引起記憶力減退、心肌缺血、胃潰瘍、炎癥性腸病等［8-10］，對全身各組織系統(tǒng)均有不同程度影響，但關(guān)于腸道屏障方面的研究較少。本研究主要從腸道屏障方面探討+Gz暴露引起腸道損傷的相關(guān)因素，并設置多種+Gz值，以比較不同程度+Gz暴露對大鼠腸道屏障的影響，為進一步加強飛行員胃腸病防護提供新的啟示。

近年來，人們對于腸道的研究已不僅僅局限于腸道的消化吸收功能，隨著對全身炎癥反應綜合征、炎癥性腸病、腸源性感染等疾病的進一步認識，腸道的屏障功能越來越受到重視［11-12］。腸道屏障包括機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障，前3者屬于腸黏膜非特異性免疫屏障，后者為腸黏膜的特異性免疫屏障，腸道機械屏障由腸黏膜上皮細胞、上皮細胞側(cè)面的細胞連接、上皮基膜及上皮表面的菌膜組成，可防止腸腔的大分子物質(zhì)向腸壁滲透、腸壁固有層的物質(zhì)進入腸腔，是腸道屏障的結(jié)構(gòu)基礎。腸黏膜通透性是反映腸道黏膜機械屏障受損的重要指標，研究證實，炎癥、創(chuàng)傷、休克、大出血等應激性刺激導致腸道黏膜出現(xiàn)形態(tài)學變化之前，腸黏膜通透性已經(jīng)增高［13］。

血清D-乳酸及DAO水平可較好地反映腸黏膜通透性及機械屏障受損程度。D-乳酸是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，腸道內(nèi)多種細菌均可產(chǎn)生，如克雷伯桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬等。通常情況下，哺乳動物組織不能或僅能緩慢代謝D-乳酸，因為D-乳酸只有在D-乳酸脫氫酶的作用下才能被降解，而哺乳類動物體內(nèi)只有L-乳酸脫氫酶，不具備將其快速降解的酶系統(tǒng)［14］。當腸道受到各種刺激導致機械屏障受損時，腸道黏膜通透性增高，腸道內(nèi)細菌產(chǎn)生的D-乳酸可透過腸道進入血液循環(huán)，故檢測體循環(huán)中D-乳酸水平，可反映腸道通透性變化及機械屏障損傷程度。DAO是存在于腸黏膜上層絨毛胞漿中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，其活性與腸黏膜絨毛高度及腸黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)。DAO主要存在于小腸黏膜上層絨毛中，在其他組織中含量很少，其含量變化主要源自腸黏膜壞死細胞脫落，DAO釋放增加，DAO通過腸道細胞間隙進入淋巴管、血管，使腸黏膜DAO活性降低，體循環(huán)中DAO含量升高，故檢測外周血DAO活性亦可反映小腸黏膜上皮損傷程度，是評價腸道機械屏障較為理想的指標［15-17］。

本實驗中筆者觀察到+Gz暴露后大鼠腸道充血，甚至出現(xiàn)散在出血點，小腸上皮細胞變性、壞死、脫落于腸腔，腸絨毛出現(xiàn)不同程度形態(tài)學改變，使細胞間緊密連接破壞，細胞間隙增大，腸道通透性增強，腸道機械屏障受損，腸道中D-乳酸及DAO通過受損腸壁釋放入血，造成外周血中D-乳酸及DAO水平明顯升高，實驗中筆者還觀察到隨+Gz值的增大，血清D-乳酸及DAO水平也隨之升高，說明機械屏障損傷程度與+Gz暴露值有關(guān)。腸道屏障受損，使腸道自我保護能力下降，同時腸道內(nèi)各種細菌及毒素通過腸壁釋放入血，造成機體內(nèi)環(huán)境紊亂，從而引起消化系統(tǒng)乃至全身各系統(tǒng)疾病，影響飛行員飛行質(zhì)量。

經(jīng)分析，+Gz暴露造成腸黏膜機械屏障的損傷可能有以下幾個原因：①腸黏膜缺血、缺氧損傷。+Gz應激狀態(tài)下機體血液重新分配，同時個體受到慣性離心力作用，導致組織及血液的移位，腸道血流減少，有效循環(huán)不足。此外，實驗和臨床研究都證明，體循環(huán)灌流恢復以后，胃腸道等內(nèi)臟器官仍處于低灌流狀態(tài)［18］，即胃腸道是最早發(fā)生缺血，卻又最晚得到恢復的器官。一系列的血流動力學改變加重腸黏膜缺血，引起腸上皮細胞內(nèi)氧供量減少，氧耗量增加，當超過上皮細胞的代償能力時，細胞內(nèi)出現(xiàn)厭氧代謝、酸中毒，并激活黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生過量氧自由基，損傷腸上皮細胞，破壞腸道黏膜［19］。②腸源性內(nèi)毒素血癥。楊加玲等［20］研究證實，過度訓練后的大鼠腸黏膜出現(xiàn)內(nèi)毒素易位。同樣，高水平的+Gz刺激下，腸道受到缺血、缺氧、感染等打擊，腸黏膜通透性提高，腸道細菌大量繁殖，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，穿透受損腸壁進入血液循環(huán)，形成腸源性內(nèi)毒素血癥［21］。內(nèi)毒素一方面可刺激單核-巨噬細胞系統(tǒng)，直接引起腸黏膜水腫、糜爛、潰瘍和出血；另一方面，內(nèi)毒素還是炎癥級聯(lián)反應最重要的觸發(fā)劑，可引起腫瘤壞死因子、血小板活化因子及白介素等多種炎癥介質(zhì)和細胞因子釋放，造成多種組織和器官損害，形成惡性循環(huán)，提高腸壁通透性，進一步促使腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生［22］。③腸黏膜營養(yǎng)障礙。腸黏膜營養(yǎng)障礙可影響腸道上皮細胞的增生，造成腸黏膜萎縮。研究證實，谷氨酰胺能明顯改善腸道血流量及腸上皮黏液層的功能，并可增強腸道免疫［23］。飛行員在應激狀態(tài)下，對谷氨酰胺利用量增加，造成機體谷氨酰胺的相對缺乏，使腸道絨毛上皮脫落，絨毛高度降低，黏膜萎縮，隱窩變淺，毛細血管充血［24］，腸黏膜通透性提高，機械屏障遭到破壞。

綜上所述，筆者認為，+Gz暴露可破壞腸黏膜機械屏障，并且破壞程度與+Gz暴露值有關(guān)。針對+Gz暴露引起的腸道屏障功能障礙，飛行訓練時飛行員可采取一定的預防性措施，比如給予一定營養(yǎng)支持，以增強腸道屏障功能，減輕飛行過程中加速度暴露對飛行員身體健康造成的損害。但對同一加速度刺激下，不同時間D-乳酸及DAO水平的變化尚不清楚，將在以后的研究中繼續(xù)探索。

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（申海菊 編輯）

Effects of positive acceleration exposure on intestinal permeability in rats*

Jie Qiu，He-lan Tang，Ying Chen，Jian-chang Wang，Wei Yan，Chun-min Yang （Cadres Ward，General Hospital of Air Force of Chinese PLA，Beijing 100142，China）

Objective To explore the effect of positive acceleration（+Gz）on mechanical barrier of intestinal mucosa in rats and its mechanism.Methods Thirty two male SD rats were randomly divided into 4 groups，i.e.group A（control group），group B（+5 Gz value group），group C（+10 Gz value group）and group D （repeated exposure group）with 8 in each group.The animal centrifuge was used to simulate the exposure of acceleration.+5 Gz value group and+10 Gz value group were continuously exposed to the respective value for 5 min；repeated exposure group was continuously exposed to+5 Gz value for 1.5 min，+10 Gz value for 2 min and+5 Gz value for 1.5 min.The three groups were exposed to the respective acceleration for 5 d.Intestinal mucosa tissue and blood samples were taken on the next day after experiment.Intestinal mucosal injury was observed under light microscope.Blood samples were used to examine the level of D-lactate and diamine oxidase（DAO）.Results Except for the group A，intestinal mucosal injury was observed in the other three groups，it was the most serious in the group D，followed by the groups C and B.Compared with the group A，the blood content of D-lactate and DAO significantly increased in the other three groups（P＜0.05）.The level of D-lactate in the group C was significantly lower than that in the group D（P＜0.01）.The level of DAO in the group B was significantly lower than that in the groups C and D（P＜0.05）.Conclusions Positive acceleration exposure can cause intestinal injury in rats.The changes of the content of D-lactate and DAO in blood suggest that positive acceleration exposure can weaken the function of mechanical barrier of intestinalmucosa in rats.

positive acceleration；intestinal permeability；mechanical barrier；D-lactate；diamine oxidase

R852.21

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.002

1005-8982（2016）09-0007-05

2015-11-26
*

全軍十二五后勤科研計劃基金（No：AKJ11J004）

楊春敏，E-mail：chunmyang9816@163.com；Tel：15611161269