siRNA沉默熱休克蛋白27對雌激素心血管保護作用的影響*

周琴，鄧華菲，譚玉林，曾新艷，顏復生，羅桐秀，易光輝

（1.湘南學院 病理生理學教研室，湖南 郴州 423000；2.湘南學院第一附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000；3.南華大學 心血管疾病研究所，湖南 衡陽 421001）

·論著·

siRNA沉默熱休克蛋白27對雌激素心血管保護作用的影響*

周琴1，鄧華菲1，譚玉林1，曾新艷2，顏復生2，羅桐秀1，易光輝3

（1.湘南學院 病理生理學教研室，湖南 郴州 423000；2.湘南學院第一附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000；3.南華大學 心血管疾病研究所，湖南 衡陽 421001）

目的通過基因沉默技術，研究熱休克蛋白27（HSP27）對雌激素介導的心血管保護作用的影響。方法人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）轉染HSP27 siRNA，免疫熒光法檢測siRNA轉染效率，Western blot和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測HUVEC中HSP27蛋白和mRNA表達水平；1×10-7mol/L雌二醇（E2）處理轉染HSP27 siRNA的HUVEC，24 h后采用硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)基中一氧化氮（NO）的含量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、內皮素-1（ET-1）的含量。結果HSP27 siRNA能降低HSP27蛋白和mRNA表達。1×10-7mol/L E2可促進HUVEC分泌NO，同時降低ICAM-1和ET-1水平。轉染HSP27 siRNA后，E2介導內皮細胞分泌NO和ICAM-1受到抑制。但沉默HSP27對E2抑制內皮細胞分泌ET-1無明顯影響。結論HSP27可能通過雌激素來影響內皮細胞分泌NO和ICAM-1，參與心血管的保護。

雌激素；人臍靜脈內皮細胞；熱休克蛋白27；小干擾RNA；一氧化氮；內皮素-1；細胞間黏附分子-1

Results HSP27 siRNA sequence significantly reduced the expression of HSP27 in protein and mRNA levels. E2 at the level of 1×10-7mol/L could obviously promote the secretion of NO from HUVECs，and decrease the ICAM-1 and ET-1 levels.After transfection with HSP27 siRNA，E2-mediated secretion of NO and ICAM-1 by HUVECs was inhibited.However，the level of ET-1 had no significant change.Conclusions HSP27 may influence the role of E2 on the secretion of NO and ICAM-1 in HUVECs，and protect the cardiovascular system.

動脈粥樣硬化是多種心血管疾病的發(fā)病基礎，其病變早期主要損傷血管內皮細胞。雌激素能調節(jié)內皮細胞分泌血管活性物質，維持血管張力，還能通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）促進內皮細胞增殖，調節(jié)內皮細胞功能，從而起到血管保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）具有抗動脈粥樣硬化的作用，動脈粥樣硬化斑塊較正常血管壁組織分泌HSP27減少，提示HSP27通過保護血管壁來對抗動脈粥樣硬化的發(fā)展［1-2］。雌激素在雌激素受體的參與下，可誘導多種細胞產(chǎn)生HSP27［2-3］。本研究的前期細胞實驗也證實生理濃度（1×10-9～1×10-7mol/L）的雌二醇（Estradiol，E2）能誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中HSP27表達上調，其中以1×10-7mol/L E2作用最為明顯［4］。研究表明，HSP27的血管壁保護作用與雌激素相關［5］，那么HSP27的這種抗動脈粥樣硬化作用是否是通過增強雌激素的內皮保護作用實現(xiàn)的呢？本研究采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術阻斷HUVEC內HSP27的表達，以一氧化氮NO、內皮素-1（endothelin-1，ET-1）和細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）作為觀察內皮細胞功能的指標，觀察HSP27對雌激素誘導的內皮保護作用的影響，以期從內皮細胞角度說明HSP27在對抗動脈粥樣硬化過程中與雌激素的相關性，為進一步探討雌激素保護心血管系統(tǒng)的機制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

HUVEC細胞株購于中國科學院上海細胞生物學研究所，達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青生物研究所，雌二醇購于美國 Sigma公司，Lipofectamine 2000、HSP27 siRNA、Mock RNA購于美國Invitrogen公司，兔抗人HSP27抗體購于美國Abzoom公司，HSP27、GAPDH引物購于長沙艾杰生物技術有限公司，NO檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，人ET-1酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，人ICAM-1 ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，其他相關試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

HUVEC貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM雙抗培養(yǎng)基中，將細胞靜置在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每2～3天更換培養(yǎng)基，使用胰蛋白酶對生長融合的細胞進行消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。實驗分為5組：①對照組：使用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)孵育；②MOCK組：轉染Mock RNA（對基因無RNA干擾作用的雙鏈RNA）；③E2組：加入1×10-7mol/L E2（E2用DMEM溶解稀釋）處理細胞；④HSP27 siRNA組：細胞轉染HSP27 siRNA；⑤HSP27 siRNA+E2組：1×10-7mol/L E2與轉染HSP27 siRNA的細胞共同孵育。各組作用時間為24 h。

1.3HSP27 siRNA的設計合成

經(jīng)篩靶驗證，確定后續(xù)干擾實驗所用的HSP27 siRNA模板如下：正向引物5'-ACGGUCAAGACCAA GGAUGdTdT-3'；反向引物5'-CAUCCUUGGUCUUG ACCGUdTdT-3'。對基因無RNA干擾作用的Mock RNA序列為：正向引物5'-UUCUCCGAACGUGUCA CGUdTdT-3'；反向引物5'-ACGUGACACGUUCGGA GAAdTdT-3'。以上siRNA均由美國Invitrogen公司設計合成。

1.4細胞轉染

轉染前24 h消化細胞，將細胞傳代于6孔板，第2天按 Lipofectamine 2000轉染試劑說明書配制RNA-Lipofectamine 2000混合液，按照濃度梯度加入Cy3熒光標記的siRNA，在室溫下放置15 min。吸去6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗1次，加入配制好的轉染混合液和培養(yǎng)基，再將細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，倒置熒光顯微鏡觀察，只有成功轉染的細胞才能看到Cy3紅色熒光。

1.5轉染細胞鑒定

轉染48 h后提取細胞總蛋白和RNA，分別用Western blot和逆轉錄 -聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測HSP27蛋白和mRNA的表達。

1.5.1Western blot檢測細胞內HSP27蛋白表達收集并裂解上述培養(yǎng)24 h HUVEC，提取蛋白并測定濃度［用二喹啉甲酸法定量蛋白］。以等量蛋白上樣進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳。電泳結束后轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，按抗體說明書稀釋后加入兔抗人HSP27一抗，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1︰5 000稀釋），4℃孵育2 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液洗滌后顯色，膠片曝光，Lab Works 3.0軟件分析結果，以標準濃度的β-actin作內參照。

1.5.2RT-PCR檢測細胞內HSP27 mRNA水平細胞總RNA按Trizol試劑盒說明書提取。取總RNA 2μg，逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，再取逆轉錄產(chǎn)物1.0μl進行HSP27和GAPDH的PCR循環(huán)，引物序列見表1。PCR循環(huán)條件為：94℃預變性5 min，95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。反應完成后，在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行積分吸光度測定和分析。

1.6硝酸還原酶法檢測NO水平

將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，細胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，加入新鮮無血清培養(yǎng)液和各種處理因素繼續(xù)培養(yǎng)，相應時間后收集細胞培養(yǎng)液，離心取上清液，硝酸還原酶法檢測NO水平，按照NO檢測試劑盒說明書操作，分光光度計于550 nm處檢測。

1.7ELISA法檢測ICAM-1及ET-1水平

表1PCR引物序列及反應條件

細胞處理完后，收集培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測ICAM-1及ET-1含量，具體步驟參照ELISA檢測試劑盒說明書，每個樣本復3孔，待反應結束后，酶標儀450 nm處測吸光度值，重復測3次，取平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.8統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析及SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞轉染鑒定

HUVEC轉染24 h后，用熒光倒置顯微鏡鑒定轉染效率。結果顯示，內皮細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光，表明大部分細胞已成功轉染siRNA。見圖1。

2.2HUVEC中HSP27 mRNA及蛋白表達

空白對照、Mock RNA轉染和HSP27 siRNA轉染3個實驗組培養(yǎng)48 h后，分別采用RT-PCR法和Western blot法檢測HSP27 mRNA和蛋白的表達水平，進一步檢測轉染效率。HSP27 mRNA水平比較發(fā)現(xiàn)，HSP27 siRNA轉染能降低內皮細胞中HSP27 mRNA表達水平（見圖2）。RNA干擾對HSP27蛋白的影響與HSP27 mRNA表達的改變相似（見圖3）。

圖1　熒光顯微鏡鑒定siRNA轉染效率 （×20）

2.3HSP27 siRNA對雌激素介導的HUVEC分泌NO、ET-1和ICAM-1的影響

采用硝酸還原酶法和ELISA法檢測HUVEC分泌NO、ET-1和ICAM-1的水平。1×10-7mol/L E2可明顯促進內皮細胞分泌NO（與對照組比較，P= 0.006），同時降低ICAM-1和ET-1水平（與對照組比較，P=0.000和0.023）。HSP27 siRNA+E2組與對照組培養(yǎng)基中NO含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.447），但與E2組比較NO分泌明顯減少（P=0.000），說明沉默HSP27可抑制E2對內皮細胞分泌NO的調節(jié)作用。HSP27 siRNA+E2組與HSP27 siRNA組的NO水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.189），也提示E2對內皮細胞分泌NO的調節(jié)作用與HSP27有關。值得注意的是單獨沉默HSP27，內皮細胞分泌NO相對對照組明顯減少（P=0.003），說明HSP27對內皮細胞分泌NO可能有直接作用。見表2。

圖2HUVEC中HSP27 mRNA表達

圖3HUVEC中HSP27蛋白表達水平

HSP27 siRNA+E2組內皮細胞分泌ICAM-1水平相對對照組明顯降低（P=0.024），與E2組比較卻顯著升高（P=0.010），與HSP27 siRNA組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.052），提示HSP27 siRNA可明顯干擾E2介導內皮細胞分泌ICAM-1。另外，HSP27 siRNA組與對照組比較ICAM-1水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.118），提示HSP27 siRNA對內皮細胞分泌ICAM-1沒有直接影響。

HSP27 siRNA+E2組內皮細胞分泌ET-1較對照組明顯降低（P=0.028），與E2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.056），說明沉默HSP27對E2抑制內皮細胞分泌ET-1無明顯影響。

表2siRNA沉默HSP27基因對E2誘導HUVEC分泌NO、ICAM-1、ET-1的影響 （n=8±s）

表2siRNA沉默HSP27基因對E2誘導HUVEC分泌NO、ICAM-1、ET-1的影響 （n=8±s）

組別ET-1/ （pg/ml）對照組　71.6±8.2　1 021.9±114.5　448.5±45.2 MOCK組　79.7±9.1　968.9±89.5　422.0±65.6 E2組　98.8±9.8　677.4±72.7　333.2±51.1 HSP27 siRNA組　58.3±8.0　901.6±78.0　425.6±59.8 HSP27 siRNA+E2組　67.0±7.6　803.4±81.8　357.5±54.2 F值　22.341　16.814　5.498 P值　0.000　0.000　0.002 NO/ （μmol/L）ICAM-1/ （pg/ml）

3　討論

近年來，心腦血管疾病一直高居威脅人類健康的疾病榜首，維持血管內皮細胞的完整性和防止內皮功能障礙是阻礙心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。NO、ET-1和ICAM-1都由內皮細胞合成、分泌。其中NO、ET-1作用于血管平滑肌細胞，調節(jié)平滑肌細胞增殖和血管活性。ICAM-1則可調節(jié)細胞間的黏附作用。此外，NO、ET-1和ICAM-1都屬于炎癥介質，NO和ET-1分泌失衡，ICAM-1表達增多，可導致內皮細胞損傷，促進動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展。雌激素可抑制內皮細胞表達ICAM-1，以及單核細胞趨化蛋白，減少單核細胞的黏附和遷移，同時還能通過激活PI3K/Akt途徑來調節(jié)NO、前列腺素I2和ET-1的表達［6］，調節(jié)血管活性，起到血管保護作用，是一種冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的保護因素。然而，隨機臨床試驗，如婦女健康研究和心臟與雌激素/黃體酮替代治療研究顯示，激素替代療法對血管益處少，絕經(jīng)后激素治療甚至導致乳腺和子宮的不良事件［7-8］。盡管如此，最近仍有臨床試驗支持卵巢類固醇激素在血管系統(tǒng)中的有利影響的觀點［9］。這可能與雌激素開始替代治療的時間［10］、劑量以及給藥途徑［11］有關。激素替代療法的不穩(wěn)定性使人們開始將雌激素防治心血管疾病作用的研究轉向新的方向。

HSP27是一種重要的分子伴侶，具有抗炎、抗氧化應激以及抑制細胞凋亡等作用。有研究表明，HSP27能保護血管壁，動脈粥樣硬化患者血清HSP27水平較正常人低［1-2］，增加血清HSP27水平既能減少新動脈粥樣硬化病變的形成，又可增強斑塊的穩(wěn)定性［12］。HSP27 siRNA能明顯抑制纖溶酶誘導的血管平滑肌細胞凋亡。有動物實驗指出，動脈粥樣硬化早期過表達HSP27可明顯減小病變區(qū)域，但只發(fā)生在雌性鼠，性別比較差異有統(tǒng)計學意義［13］。然而，慢性動脈粥樣硬化持續(xù)過表達HSP27，可明顯減少膽固醇蓄積，從而減少泡沫細胞數(shù)量，使病變區(qū)域縮?。?4］，并且與性別無關［15］。這說明HSP27可能對慢性動脈損傷有潛在的保護作用，性別比較差異無統(tǒng)計學意義。此外，HSP27還可減少纖溶酶誘導的血管平滑肌細胞凋亡，有利于防治不穩(wěn)定斑塊破裂［16］。有研究表明，HSP27重組體（recombinant HSP27，rHSP27）能降低血清膽固醇［17］和清道夫受體-A （scavenger receptor-A，SR-A）［18］水平，使泡沫細胞形成減少，提示rHSP27可作為治療動脈粥樣硬化的新靶點。SEIBERT等［12］也認為HSP27是動脈粥樣硬化的生物學標志和治療靶點。

雌激素可誘導多種細胞表達HSP27，其相互作用與ER有關［2-3］。其中作用于血管壁的主要是ERβ，ERβ激活可上調HSP27表達，并促進雌激素的血管保護作用，同時對女性生殖系統(tǒng)沒有影響［19］。雌激素可誘導HSP27短暫磷酸化［20］。磷酸化的HSP27可通過穩(wěn)定內皮細胞和平滑肌細胞肌動蛋白細胞骨架來防止血管病變［21］。而動脈粥樣硬化的危險因素——低密度脂蛋白可使血管平滑肌細胞中HSP27去磷酸化［22］。雌激素還可促進巨噬細胞分泌釋放HSP27［5，15］，并通過與SR-A的相互作用抑制膽固醇的攝?。?3］。有動物實驗證實HSP27的動脈保護作用與雌激素有關［5］。本實驗研究siRNA阻斷HSP27基因表達對E2介導的內皮保護作用的影響，結果顯示，E2可促進HUVEC分泌NO，同時降低ICAM-1和ET-1水平，這與國內外的一些研究一致。HUVEC轉染HSP27 siRNA后，E2明顯抑制內皮細胞分泌NO和ICAM-1。但沉默HSP27基因后內皮細胞分泌ET-1水平?jīng)]有明顯改變。由此推測HSP27可能通過雌激素來調節(jié)內皮細胞分泌NO和ICAM-1，參與心血管的保護，從而對抗動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。至于HSP27是否參與雌激素對其他心血管的保護，以及HSP27與雌激素之間的具體作用機制，仍需要進一步的研究。

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（申海菊 編輯）

Influence of siRNA-mediated HSP27 knockdown on estrogen-mediated cardiovascular protection*

Qin Zhou1，Hua-fei Deng1，Yu-lin Tan1，Xin-yan Zeng2，F(xiàn)u-sheng Yan2，Tong-xiu Luo1，Guang-hui Yi3
（1.Department of Pathophysiology，Xiangnan University，Chenzhou，Hunan 423000，China；2.The First Affiliated Hospital，Xiangnan University，Chenzhou，Hunan 423000，China；3.Institute of Cardiovascular Diseases，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China）

Objective To investigate the influence of HSP27 on the cardiovascular protection of estrogen by gene silencing technique.Methods HSP27 siRNA was transfected to human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.The transfection efficiency was assessed by immunofluorescence technique.The expressions of HSP27 mRNA and protein in HUVECs were determined by RT-PCR and Western blot，respectively.HUVECs transfected with HSP27 siRNA were incubated with 1×10-7mol/L estradiol（E2）for 24 hours.The level of nitric oxide（NO）in medium was determined by nitrite/nitrate colorimetric method，and the levels of intercellularadhesion molecule-1（ICAM-1）and endothelin-1（ET-1）in the supernatant were determined by ELISA.

R363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.001

1005-8982（2016）09-0001-06

2015-07-01
*

國家自然科學基金（No：81270360）；湖南省科技廳科技計劃重點項目（2014FJ2012）；湖南省教育廳項目（No：11C1179）；湖南省郴州市科技局項目（No：［2011］29）；湖南省重點建設學科（No：2011-76）

易光輝，E-mail：ghyi6108@163.com