除蟲脲亞慢性染毒對(duì)大鼠血液系統(tǒng)的影響

胡雄飛, 陸　丹, 熊志軍, 張麗娜

(湖南省職業(yè)病防治院毒理室，長沙　410007)

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除蟲脲亞慢性染毒對(duì)大鼠血液系統(tǒng)的影響

胡雄飛, 陸丹, 熊志軍, 張麗娜

(湖南省職業(yè)病防治院毒理室，長沙410007)

目的在研究除蟲脲對(duì)大鼠的亞慢性經(jīng)口毒性基礎(chǔ)上，初步探討染毒后對(duì)大鼠血液系統(tǒng)的影響。 方法將80只SPF級(jí)SD大鼠按體重隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。分別用含0、25、500、10000 mg/kg 除蟲脲的飼料連續(xù)喂飼染毒3個(gè)月，觀察各組大鼠的臨床表現(xiàn)、攝食量、體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器重量、臟器系數(shù)及病理組織學(xué)改變。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間，各劑量組雌、雄鼠進(jìn)食、活動(dòng)、飲水基本正常，未見明顯中毒表現(xiàn)。中、高劑量組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)和紅細(xì)胞壓積(HCT)降低，高劑量組大鼠血液平均紅細(xì)胞體積(MCV)和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)升高，并且雄鼠血清總膽紅素(TBIL)升高，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。高劑量組大鼠脾臟重量和臟器系數(shù)均增高，雌鼠肝臟重量和臟器系數(shù)均增高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高劑量組全部動(dòng)物及中劑量組部分動(dòng)物脾臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，顏色較深。病理檢查結(jié)果顯示其脾臟紅髓髓竇高度擴(kuò)張并充滿大量紅細(xì)胞,髓質(zhì)內(nèi)含鐵血黃素沉積明顯。 結(jié)論除蟲脲對(duì)大鼠血液系統(tǒng)有明顯損害，長期接觸可能會(huì)導(dǎo)致脾臟腫大、機(jī)體出現(xiàn)慢性溶血性貧血表現(xiàn)。

除蟲脲；亞慢性毒性；血液系統(tǒng)；慢性溶血性貧血

除蟲脲是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的苯甲酸基苯基脲類除蟲劑，是一類能抑制靶標(biāo)害蟲的幾丁質(zhì)合成而導(dǎo)致其死亡或不育的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑(IGRs)，被譽(yù)為第三代殺蟲劑或新型昆蟲控制劑。由于缺乏幾丁質(zhì)，幼蟲不能形成新表皮、化蛹受阻，成蟲難以羽化、產(chǎn)卵以及蟲卵不能正常發(fā)育，所以除蟲脲的殺蟲優(yōu)勢在于影響害蟲的整個(gè)世代。因其獨(dú)特的作用機(jī)制、較高的環(huán)境安全性以及廣譜高效的殺蟲活性而被廣泛使用，國內(nèi)外已有14家企業(yè)對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)品登記[1]。但目前對(duì)其毒理學(xué)研究的報(bào)道甚少，特別是亞慢性毒性研究，國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)除蟲脲原藥進(jìn)行了亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，探討其對(duì)大鼠血液系統(tǒng)的影響，為全面評(píng)價(jià)其毒性及作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要試劑

除蟲脲(98%)，類白色粉末，由國內(nèi)某農(nóng)用激素研究中心提供。

1.2動(dòng)物與分組

選用湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的SPF級(jí)健康SD大鼠【SCXK(湘)2011-0003】，4～6周齡，體重90～108 g。將80只動(dòng)物按體重隨機(jī)分成4組，每組雌雄各10只。設(shè)低、中、高三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲用純凈水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為【SYXK(湘)2014-0003】。

1.3染毒方法與劑量

根據(jù)除蟲脲對(duì)SD大鼠相關(guān)毒性資料[2]，本次實(shí)驗(yàn)雌、雄鼠各組設(shè)計(jì)劑量均為2.5、50、1000 mg/kg bw·d。按大鼠進(jìn)食量為其體重的10%比例將受試物直接混入飼料，分別用含25、500、10000 mg/kg 除蟲脲的飼料連續(xù)喂飼染毒3個(gè)月。對(duì)照組給予不加藥的清潔級(jí)基礎(chǔ)飼料。

1.4觀察及檢測指標(biāo)

(1)動(dòng)物的一般狀況、每周體重及攝食量變化。(2)染毒結(jié)束時(shí)取靜脈血，BC-5300Vet全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀和BACKMAN COULTER全自動(dòng)生化分析儀分別測定血液學(xué)指標(biāo)和血液生化學(xué)指標(biāo)。(3)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，小心分離肝、脾、腎，對(duì)其稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。(4)將分離出的所有器官和組織用福爾馬林固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下病理組織學(xué)檢查。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(V11.5)對(duì)各項(xiàng)檢測數(shù)據(jù)作單因素方差分析或t檢驗(yàn)。以評(píng)定各劑量組與對(duì)照組之間是否有明顯差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2　結(jié)果

2.1動(dòng)物的一般狀況

各劑量組雌、雄鼠在整個(gè)染毒期間攝食、活動(dòng)、飲水基本正常，未見明顯中毒表現(xiàn)。染毒期間各劑量組雌、雄鼠體重及攝食量較對(duì)照組無明顯變化(表1)。

2.2染毒劑量

根據(jù)各組雌、雄大鼠試驗(yàn)期間攝食量計(jì)算得出各組實(shí)際染毒劑量：雌性大鼠分別為0，1.7，36.0和736.0 mg/kg，雄性大鼠分別為0，1.6，32.6和658.0 mg/kg。

2.3血液學(xué)及血生化指標(biāo)

中、高劑量組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)和紅細(xì)胞壓積(HCT)降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和0.01)，并且隨著染毒劑量的增加而不斷下降；高劑量組大鼠血液平均紅細(xì)胞體積(MCV)和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高劑量組雄鼠血清總膽紅素(TBIL)明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加而不斷升高。各劑量組血小板計(jì)數(shù)(PLT)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.4白細(xì)胞及分類

各劑量組雌、雄鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)與對(duì)照組比較無顯著變化。中劑量組雄鼠中性粒細(xì)胞比例(Neu)明顯高于對(duì)照組、淋巴細(xì)胞比例(Lym)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和0.01)，但均無劑量反應(yīng)關(guān)系。各劑量組單核細(xì)胞(MON)和嗜酸性粒細(xì)胞比例與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.5臟器重量及臟器系數(shù)

高劑量組雌、雄鼠脾臟重量和臟器系數(shù)均增高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且隨著染毒劑量的增加而不斷升高。高劑量組雌鼠肝臟重量和臟器系數(shù)均增高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。各劑量組大鼠其余臟器重量及臟器系數(shù)均無明顯異常(表4)。

2.6病理組織學(xué)檢查

大體解剖發(fā)現(xiàn)，高劑量組全部雌、雄鼠及中劑量組6只雌鼠、4只雄鼠脾臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，顏色較深。普通光學(xué)顯微鏡下可見脾臟紅髓髓竇高度擴(kuò)張并充滿大量紅細(xì)胞,髓質(zhì)內(nèi)含鐵血黃素沉積明顯。其它主要臟器未見明顯病理學(xué)改變(圖1)。

劑量組(Group)染毒前(g)(Beforeadministration)第1個(gè)月(g)(Thefirstmonth)第2個(gè)月(g)(Thesecondmonth)第3個(gè)月(g)(Thethirdmonth)對(duì)照組(Controlgroup)♀♂95.7±4.3100.1±4.1210.5±9.7313.3±22.6262.1±19.9415.0±38.6288.1±25.7444.8±54.6低劑量組(Low-dosegroup)♀♂95.4±3.3100.0±3.4208.8±14.8301.2±21.8260.6±21.7422.9±33.5280.1±32.8454.9±27.3中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂95.5±4.0100.2±4.3206.8±22.3293.7±24.6264.2±16.7416.5±31.6284.6±27.2471.9±55.2高劑量組(High-dosegroup)♀♂94.9±3.299.7±3.4207.6±29.5299.4±16.7274.7±21.5415.8±44.4310.1±14.4441.0±91.8

劑量組(Group)RBC(×1012/L)HGB(g/L)HCT(%)MCV(fL)RDW(%)PLT(×109/L)TBIL(μmol/L)對(duì)照組(Controlgroup)♀♂8.08±0.229.32±0.60167±4177±1046.2±1.349.1±2.957.1±1.152.7±1.412.3±0.813.2±0.4455±411395±2425.86±1.916.15±2.09低劑量組(Low-dosegroup)♀♂7.95±0.519.08±0.51163±7176±445.2±2.648.6±1.857.0±1.353.6±1.912.6±0.513.0±0.9393±345368±2545.80±2.347.24±3.08中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂7.06±0.54**8.68±0.27*152±6**169±7*42.2±2.0**46.9±2.2*59.9±3.454.0±2.012.9±1.813.6±0.6511±295329±2266.49±4.607.96±5.13高劑量組(High-dosegroup)♀♂6.54±0.40**7.53±0.29**148±6**157±4**42.1±2.1**45.0±1.6**64.5±4.8**59.9±3.0**13.8±0.8**14.7±1.1**404±367272±2635.76±1.2012.28±10.17*

注：與對(duì)照組比較，*與對(duì)照組比較P<0.05，**與對(duì)照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

劑量組(Group)WBC(×109/L)白細(xì)胞分類(%)LeukocytedifferentialcountNEULYMMONEOS對(duì)照組(Controlgroup)♀♂7.08±1.4213.41±3.2221.5±5.916.2±5.966.3±9.973.9±8.24.0±1.94.2±2.08.1±5.65.1±2.4低劑量組(Low-dosegroup)♀♂8.13±1.7814.90±4.3422.5±7.722.6±7.966.3±9.266.2±9.33.6±1.43.8±1.87.3±3.36.6±3.7中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂8.27±1.7613.46±3.1423.8±6.424.7±5.5*63.9±10.262.2±9.0**3.8±1.54.3±1.38.1±4.68.2±3.9高劑量組(High-dosegroup)♀♂10.09±6.1615.67±6.2618.0±8.419.4±3.365.9±7.869.4±4.96.1±5.43.8±2.99.6±5.26.4±4.1

注：與對(duì)照組比較，*與對(duì)照組比較P<0.05，**與對(duì)照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

劑量組(Group)肝(g)Liver(g)脾(g)Spleen(g)腎(g)Kidney(g)肝/體(%)Livercoeffcient脾/體(%)Spleencoeffcient腎/體(%)Kidneycoeffcient對(duì)照組(Controlgroup)♀♂6.47±0.509.35±1.210.46±0.080.64±0.131.74±0.142.77±0.362.40±0.142.19±0.120.17±0.020.15±0.020.65±0.050.65±0.07低劑量組(Low-dosegroup)♀♂6.53±0.5410.07±1.780.44±0.050.63±0.111.69±0.212.86±0.262.53±0.212.37±0.350.17±0.030.15±0.030.65±0.070.67±0.04中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂6.75±0.7210.58±1.270.59±0.110.75±0.151.69±0.122.97±0.392.55±0.262.40±0.110.22±0.05*0.17±0.020.64±0.050.67±0.06高劑量組(High-dosegroup)♀♂7.81±0.82**10.76±0.890.88±0.22**1.14±0.26**1.84±0.062.84±0.492.68±0.20**2.44±0.160.30±0.06**0.26±0.06**0.63±0.040.65±0.12

注：與對(duì)照組比較，*與對(duì)照組比較P<0.05，**與對(duì)照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

注：1. 對(duì)照組大鼠脾臟組織切片；2. 高劑量組大鼠脾臟組織切片；箭頭所指為含鐵血黃素。圖1　病理組織學(xué)檢查(HE×40)Note：1. The histological section of spleen from the rat of the control group；2. The histological section of spleen from the rat of the high dose group. The arrow point out haemosiderin.Fig.1　Pathology pictures(HE×40)

3　討論

體重是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要的非特異性指標(biāo)，可綜合反映動(dòng)物機(jī)體中毒效應(yīng)，也可反映外來化合物對(duì)機(jī)體的綜合影響[3-4]。本次研究結(jié)果顯示，各劑量組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，除蟲脲對(duì)大鼠體重增長、發(fā)育均未發(fā)生明顯影響。

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示[5]，多種農(nóng)藥(包括有機(jī)磷農(nóng)藥、有機(jī)氯農(nóng)藥、合成除蟲菊酯、氨基甲酸酯等)暴露的易感性和高暴露水平等，會(huì)使兒童患血液病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增大。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除蟲脲作為苯甲酸基苯基脲類除蟲劑，中、高劑量組大鼠血液RBC、HGB和HCT均降低，表明大鼠已出現(xiàn)貧血。紅細(xì)胞形成過程中，晚幼紅細(xì)胞脫核釋放入外周血后，變成含有RNA和少量DNA碎片的網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocytes，Ret)，這種細(xì)胞在血管內(nèi)進(jìn)一步成熟，24 ～ 36 h后變成成熟紅細(xì)胞[6]。溶血性貧血(hemolytic anemia，HA)是指紅細(xì)胞破壞速率增加(壽命縮短)，并且超過骨髓造血的代償能力而發(fā)生的一類貧血。根據(jù)HA診斷依據(jù)[7]，HA不僅出現(xiàn)血液RBC、HGB和HCT降低，一般還會(huì)伴有Ret和TBIL的升高。本次研究中高劑量組雄鼠血清TBIL明顯升高，血液WBC及其分類無明顯變化，符合HA特征。國外曾有報(bào)道，13周持續(xù)染毒除蟲脲后大鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯上升，可以作為佐證。血液MCV和RDW對(duì)不同貧血的鑒別診斷有重要參考價(jià)值。有報(bào)道顯示[8]，溶血性貧血(HA)患者M(jìn)CV與RDW均升高，屬大細(xì)胞性貧血。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組大鼠血液MCV與RDW均明顯高于對(duì)照組，考慮該貧血可能為HA。

造成紅細(xì)胞破壞過多的因素分為內(nèi)在和外在兩部分，內(nèi)在因素主要為紅細(xì)胞先天性缺陷，外在因素中很多種類，其中很重要一種就是接觸藥物[9-11]及化學(xué)品所致的溶血性貧血?？梢鹑苎载氀幕瘜W(xué)物質(zhì)主要有氧化劑類，如芳香族有機(jī)物、氧原子以及有氧化作用的銅、砷、鉛等[12]。除蟲脲從結(jié)構(gòu)上看屬于芳香族有機(jī)物，為外來化學(xué)物致HA的敏感物質(zhì)。慢性HA臨床表現(xiàn)一般為貧血、黃疸和脾大。我們也在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高劑量組雌、雄鼠脾臟重量和脾臟臟器系數(shù)均明顯增高，其脾臟重量均接近于對(duì)照組2倍?？梢酝茰y大鼠由于長期一定劑量攝入除蟲脲，導(dǎo)致機(jī)體血液紅細(xì)胞被快速破壞，當(dāng)紅細(xì)胞破壞的速度超過了骨髓造血的代償能力，致使脾臟恢復(fù)造血功能，進(jìn)一步導(dǎo)致增生性脾大。大體解剖發(fā)現(xiàn)，高劑量組全部大鼠及中劑量組部分大鼠脾臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，顏色較深。病理檢查結(jié)果顯示其脾臟紅髓髓竇高度擴(kuò)張并充滿大量紅細(xì)胞,髓質(zhì)內(nèi)含鐵血黃素沉積明顯。本次研究可見，除蟲脲對(duì)大鼠血液系統(tǒng)可造成明顯損害。

[1]劉剛.除蟲脲原藥產(chǎn)品登記企業(yè)達(dá)到14家.農(nóng)化市場十日訊,2013,(19);38-38.

[2]Cornell University. Pesticide Management Education Program PMEP[DB/OL].http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/dienochlor-glyphosate/diflubenzuron-ext.html, 1993-9.

[3]劉英華，張靜姝，邸金茹，等. 三聚氰胺對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究[J]. 環(huán)境與健康雜志,2010,27(5):422-425.

[4]李本長，鄧?yán)?，周寧，? 噻唑膦原藥對(duì)大鼠的亞慢性毒性作用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2014,(6):49-53.

[5]張妍，朱莎，高宇，等. 農(nóng)藥暴露與兒童急性白血病關(guān)系的病例-對(duì)照研究[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2011,45(1):41-46.

[6]Gronowicz G, Swift H, Steck T L. Maturation of the reticulocyte in vitro[J]. Journal of Cell Science,1984,71(1): 177-197.

[7]李津嬰. 溶血性貧血的診斷與實(shí)驗(yàn)室檢查[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2006,20(4):66-71.

[8]盧煥興，余艷云.血液細(xì)胞學(xué)參數(shù)在貧血診斷中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,32(6):698-700.

[9]Salama A. Drug-induced immune hemolytic anemia.[J]. Expert opinion on drug safety, 2009,8:73-79.

[10]Garratty, G. Immune hemolytic anemia caused by drugs[J]. Expert opinion on drug safety, 2012,11(4):63-67.

[11]李曉晶，陳旭巖，汪波，等. 藥物導(dǎo)致溶血性貧血18例分析[J]. 中華內(nèi)科雜志,2007,46(2):146-147.

[12]付蓉. 后天獲得性溶血性貧血[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2009,(7);596-599.

Blood toxicity assessment of subchronic exposure to diflubenzuron in SD rats

HU Xiong-fei, LU Dan, XIONG Zhi-jun, ZHANG Li-na

(Hunan Prevention and Treatment Institute of Occupational Diseases, Changsha, 410007, China)

ObjectiveTo investigate the effects of diflubenzuron on the blood system in rats. MethodsA total of 80 rats were randomly divided into three diflubenzuron treated groups and one negative control group. Different doses of diflubenzuron at 0, 25, 500 and 10000 mg/kg were administered continuously for 90 days to the rats by the way of feeding. Animals were observed for clinical signs of toxicity, food consumption and body weight. Haematological parameters, clinical chemistry parameters, absolute and relative organ weights and histopathological changes were examined at the end of the study. ResultDuring the period of the study, the food and water consumption were all normal at all dose groups and no obvious toxicity symptoms appeared. For haematological parameters, the main changes were the decrease of red blood cell count(RBC), haemoglobin(HGB) and haematocrit(HCT) in the medium and high dose groups and the increase of mean corpuscular volume(MCV) and erythrocyte hemoglobin distribution width(RDW) in the high dose group(P<0.05 or 0.01). For clinical chemistry parameters, the main change was the increase of total bilirubin(TBIL) in the high dose group of male rats(P<0.05). The absolute and relative spleen weights increased obviously in the female and male rats of the high dose group(P<0.01). The absolute and relative liver weights increased obviously in the female rats of the high dose group(P<0.01). The spleens were larger, harder and darker than normal in all of the rats of high dose group and part of the rats of medium dose group. For the result of histopathology examination of spleen, the main changes were a lot of red cells in the medullary sinus and haemosiderin in the medulla. Conclusion Diflubenzuron had toxic effect on the blood system of the rats. The spleen was intumesce and chronic hemolytic anemia may be occurred for long-term exposure.

Diflubenzuron; Subchronic toxicity; Blood system; Chronic hemolytic anemia

胡雄飛(1983-)，男，主管醫(yī)師，碩士生，從事毒理學(xué)研究。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0077-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.012

2016-02-01