駱駝奶對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及PPAR-γ、TNF-α mRNA的影響

周　珺，張泉龍，楊　茜，李茂星，邱建國，張汝學(xué)

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，蘭州　730050)

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駱駝奶對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及PPAR-γ、TNF-α mRNA的影響

周珺，張泉龍，楊茜，李茂星，邱建國，張汝學(xué)

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，蘭州730050)

目的研究駱駝奶(CM)對2型糖尿病大鼠體重、血糖、血脂、胰島素，PPARγ和TNF-α基因表達(dá)的影響。 方法采用高脂飼料加小劑量(30 mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，將其分為4組，即正常對照(control)組、模型(model)組、駱駝奶低劑量(CM-L)組(3.5 mg/kg·d)、駱駝奶高劑量(CM-H)組(10 mg/kg·d)，每周測定體重和血糖，第4周進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，給藥4周后斷頭處死，測定血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、胰島素水平，檢測脂肪組織PPARγ和肝臟組織TNF-α mRNA表達(dá)量。結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠體重明顯下降(P< 0.01)，空腹血糖、糖耐量0、30、60、120 min血糖，以及血清TC、TG、LDL-C含量均顯著增高(P< 0.01)，HDL-C含量下降，胰島素水平升高。CM可緩解糖尿病大鼠體重下降，降低高血糖，CM-H組在給藥第4周達(dá)到顯著降糖效果，并顯著降低糖耐量30 min血糖(P< 0.05)。CM有降低糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，降低胰島素趨勢，其中CM-H劑量組可顯著降低TG、LDL-C含量(P< 0.05)。與正常對照組比較，模型組PPARγ mRNA顯著下調(diào)(P< 0.05)，TNF-α mRNA顯著上調(diào)(P< 0.01)，CM使糖尿病大鼠的PPARγ mRNA升高，其中，CM-H組差異顯著(P< 0.05)，CM可降低其TNF-α mRNA表達(dá)量。 結(jié)論CM可緩解2型糖尿病大鼠體重下降，改善高血糖、糖耐量異常、血脂紊亂等癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PPARγ、TNF-α表達(dá)有關(guān)。

駱駝奶；2型糖尿?。谎?；血脂；PPARγ；TNF-α

2型糖尿病多表現(xiàn)為胰島素分泌不足及胰島素抵抗，現(xiàn)有最有效的降糖藥—胰島素制劑均為注射劑，使用極其不方便。研究發(fā)現(xiàn)，駱駝奶(camel milk, CM)中的胰島素含量較高，1 mL駱駝奶中含有52個微單位的胰島素，而等量牛奶的胰島素含量僅為16個微單位[1]。駱駝奶中還含有一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與胰島素蛋白家族極其相似，這種蛋白質(zhì)就是不被胃酸分解破壞的降糖活性物質(zhì)—胰島素/ 類胰島素蛋白[2]，因此這種成分被認(rèn)為是治療糖尿病的功效因子之一。駱駝奶對于糖尿病的防治具有較好的應(yīng)用前景[3]，臨床試驗(yàn)證實(shí)，患者每天飲用0.5 L駱駝奶，將使胰島素治療用量平均減少30%，有飲用駱駝奶習(xí)慣的人群患糖尿病的比率比無飲用駱駝奶習(xí)慣的人群下降0.15%～0.3%[4]。然而駱駝奶對糖脂代謝的具體效果不明，其是否參與糖脂代謝關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)。本文采用高脂飼料加小劑量STZ聯(lián)合誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，通過CM干預(yù)，研究CM對糖尿病大鼠糖脂代謝及關(guān)鍵基因的影響，探索其對2型糖尿病大鼠脂代謝紊亂的影響并探討其可能機(jī)制，為CM應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠，清潔級，♀，體重180～220 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK(甘)2012-0200】，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科【SYXK(軍)2012-0029】，普通飼料由該實(shí)驗(yàn)科自行配制，自由攝食進(jìn)水，室溫19℃～24℃。

1.1.2藥品與試劑

鏈脲佐菌素(STZ，批號S0130)購自Sigma公司；駱駝奶(camel milk, CM,批號191531-740, 規(guī)格328 g/罐)購自新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限；血糖檢測試劑盒(批號：1210121)、總膽固醇(TC)(批號：1210141)、甘油三酯(TG)(批號：1210111)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(批號：1210081)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(批號：1210091)檢測試劑盒均購自四川省邁克科技有限責(zé)任公司；胰島素(FINS)放射免疫分析試劑盒(批號：20121120)為天津九鼎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus(TakaRa，BK4606)；PrimeScriptTM RT Master Mix(TakaRa，DRR036A)；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Ti RNaseH Plus)(TakaRa，RR820A)。 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材

Vitalab ISP-21半自動生化分析儀，荷蘭Vital Scientific公司；BP210S電子天平，賽多利斯有限公司；Biofuge Stratos高速臺式冷凍離心機(jī)，德國Heraeus公司；Multiscan MK3 酶標(biāo)儀，美國Thermo Electron公司；Telstar Mini-V PCR超凈工作臺，西班牙TERRASSA-SPAIN醫(yī)療器械公司；SN-682放射免疫γ-計(jì)數(shù)器，中國科學(xué)院上海原子核研究所日環(huán)儀器廠。ABI7300定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2方法

1.2.1高脂飼料加小劑量STZ聯(lián)合誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立

高脂飼料飼養(yǎng)加小劑量STZ聯(lián)合誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型。購買的雌性Wistar大鼠在我實(shí)驗(yàn)科適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體重平均分組，一組為正常對照組(10只)，給與普通飼料，其余均飼以高脂飼料，喂養(yǎng)2個月后大鼠禁食16 h，腹腔注射STZ(30 mg/kg，i.p.)誘發(fā)2型糖尿病模型，選取空腹血糖值≥15 mmol/L大鼠納入試驗(yàn)。

造模成功后，大鼠分為正常對照組、糖尿病組、CM-L組(3.5 mg/kgd)、CM-H組(10 mg/kgd)。正常對照組及模型組每日給予等量蒸餾水，約1 mL/100g 體重。以上各組均為灌胃(i.g.)給藥，連續(xù)給藥4周，在末次給藥后大鼠禁食不禁水6 h后斷頭處死并收集軀干血，4000 r/min，4℃離心10 min，將血漿分裝于不同的離心管中-20℃保存待用。

1.2.2體重、血糖

每周測定一次空腹體重和空腹血糖，測血糖前大鼠禁食不禁水6～7 h，眼眶靜脈叢采血；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時收集血液。0.1 mol/L 肝素鈉抗凝，離心并分離血漿。用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖含量。

1.2.3葡萄糖耐量的測定

實(shí)驗(yàn)動物禁食6 h(8:30～14:30)后，腹腔一次性注射50%葡萄糖(2.5 g/kg)，測定注射 0、30、60、120 min血糖值。

1.2.4血脂、胰島素含量的測定

血漿TG用GPO-PAP法測定，TC用COD-CE-PAP法測定，HDL-C用PTA-Mg2+沉淀法測定，LDL-C用聚乙烯硫酸沉淀法測定。采用放免法測定胰島素含量。

1.2.5RT-PCR檢測脂肪組織PPAR-γ和肝臟組織TNF-αmRNA表達(dá)

TRIzol法提取總RNA，一步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。PPAR-γ(153 bp)上游引物5′ GGAGCCTAAGTTTGAGTTTGC-TGTG3′，下游引物5′ TGCAGCAGGTTGTCTTGG ATG3′；TNF-α(75 bp)上游引物5′ ATACACTGGCC CGAGGCAAC 3′，下游引物5′ CCACATCTCGGA TCATGCTTT-C3′；以β-actin(150 bp)為內(nèi)參照，上游引物5′ GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA 3′，下游引物5′ GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 3′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1大鼠體重變化

表1所示，正常組大鼠體重緩慢上升，糖尿病大鼠體重明顯下降(P<0.01)，隨病程的延長糖尿病大鼠體重呈下降趨勢，CM組大鼠體重下降緩慢，但與模型組相比，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2駱駝奶對糖尿病大鼠血糖水平的影響

與正常對照組比較，模型組和CM各組大鼠0～4周血糖值均明顯高于正常對照組(P< 0.01)，與模型組比較，CM有降低2型糖尿病大鼠血糖趨勢，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程模型組血糖逐漸升高，CM-H組在給藥第4周達(dá)到顯著降糖效果(P< 0.05)。

2.3駱駝奶對糖尿病大鼠糖耐量的影響

與正常對照組相比，糖尿病大鼠0、30、60、120 min血糖均顯著增高(P< 0.01)；CM可降低糖尿病大鼠30、60、120 min血糖，其中CM-H組可顯著降低30 min血糖值(P< 0.05)。

組別Group只數(shù)n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)0周0week1周1week2周2week3周3week4周4week正常組Controlgroup60199.70±18.68203.10±19.27208.90±18.14211.40±16.59215.20±18.39模型組Modelgroup60181.86±9.34b175.86±10.33b168.71±12.67b166.86±7.17b164.60±17.98b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.5182.88±12.82b177.00±12.12b175.57±17.46b174.57±14.09b172.67±18.79b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup610182.13±16.44b178.88±15.68b176.75±15.17b175.63±14.11b176.00±13.85b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group.

組別Group只數(shù)n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)空腹血糖(mmol/L)FBG(mmol/L)0周0week1周1week2周2week3周3week4周4week正常組Controlgroup605.51±0.596.21±0.866.23±1.126.30±0.896.37±0.98模型組Modelgroup6019.76±5.43b20.79±4.45b23.64±3.74b24.39±6.51b25.30±5.19b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.519.23±4.91b20.41±4.68b22.82±5.06b22.09±4.00b21.29±5.90b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup61018.33±5.50b19.49±5.02b18.66±6.49b18.31±6.40b18.45±6.01bc

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

組別Group只數(shù)n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)0min0min30min30min60min60min120min120min正常組Controlgroup605.08±0.3613.82±0.588.91±0.967.27±0.88模型組Modelgroup6022.08±2.24b29.57±2.51b28.22±4.82b24.21±2.97b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.522.28±0.73b27.00±2.76b25.67±5.19b22.78±3.63b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup61019.93±1.06b26.43±1.52bc24.50±4.01b20.42±3.53b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

組別Group只數(shù)n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)總膽固醇TC甘油三酯TG高密度脂蛋白-膽固醇HDL-C低密度脂蛋白-膽固醇LDL-C正常組Controlgroup601.74±0.182.49±1.012.16±0.580.36±0.15模型組Modelgroup604.68±1.43b10.19±3.27b1.71±0.321.23±0.45b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.54.26±1.58b9.56±3.66b1.82±0.341.07±0.39b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup6104.02±1.12b7.11±2.97bc1.76±0.370.75±0.33bc

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

2.4駱駝奶對糖尿病大鼠血脂水平的影響

表4結(jié)果可見：與正常組相比，模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量顯著增高(P< 0.01)，HDL-C含量下降。CM-H組可顯著降低TG、LDL-C含量(P< 0.05)。

2.5駱駝奶對糖尿病大鼠胰島素水平的影響

圖1結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組胰島素水平升高，CM可降低糖尿病大鼠的胰島素水平，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。

圖1　駱駝奶對胰島素水平的影響Fig.1　Effects of camel milk on insulin ±s)

組別Group只數(shù)n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)PPARγmRNATNF-αmRNA正常組Controlgroup601.000±0.0001.000±0.000模型組Modelgroup600.821±0.158a1.893±0.661b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.50.909±0.1921.675±0.362b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup6101.083±0.137c1.618±0.489b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

2.6RT-PCR檢測脂肪組織PPAR-γmRNA和肝臟組織TNF-αmRNA表達(dá)

由表5可見，與正常對照組相比較，糖尿病大鼠PPARγ mRNA顯著下調(diào)(P< 0.05)，TNF-α mRNA均顯著上調(diào)(P< 0.01)。CM-H顯著升高糖尿病大鼠的PPARγ mRNA(P< 0.05)，同時降低糖尿病大鼠的TNF-α mRNA表達(dá)量，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3　討論

2型糖尿病常伴隨胰島素抵抗的發(fā)生，胰島素敏感性降低，導(dǎo)致胰島素相對缺乏，機(jī)體內(nèi)分泌代謝嚴(yán)重紊亂，導(dǎo)致體重的明顯下降。脂肪正常代謝途徑受阻，脂代謝紊亂。而機(jī)體內(nèi)脂蛋白脂酶活力減弱，以及某些代謝關(guān)鍵基因的變化，導(dǎo)致游離TC、TG、LDL-C濃度增高，HDL-C濃度減低，肝臟對游離脂肪酸的攝取超過肝細(xì)胞處置的能力，導(dǎo)致甘油三酯的堆積[5-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，糖尿病大鼠血糖水平升高，糖耐量受損，TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，胰島素水平升高。這與相關(guān)研究報道一致[8-9]。

研究認(rèn)為，食物蛋白通過增強(qiáng)飽腹感幫助機(jī)體降低脂肪量，間接改善機(jī)體代謝健康，同時乳制品蛋白質(zhì)派生的支鏈氨基酸(BCAAs)的合成代謝促進(jìn)骨骼肌生長和功能發(fā)揮，而BCAAs又可促進(jìn)肌肉蛋白合成，以及骨骼肌代謝的功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)，駱駝奶中的胰島素含量較高，1 mL駱駝乳中含有的胰島素是等量牛奶的3.25倍[1]。駱駝奶中還含有一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與胰島素蛋白家族極其相似，這種蛋白質(zhì)就是不被胃酸分解破壞的降糖活性物質(zhì)—胰島素/類胰島素蛋白[2]，因此這種成分被認(rèn)為是治療糖尿病的功效因子之一。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CM可有效改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝，緩解糖尿病大鼠體重的明顯下降，使體重狀況與正常組接近，不同程度的改善糖尿病大鼠的高血糖、高胰島素和糖耐量異常狀態(tài)，降低TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平。

PPARγ在糖脂代謝中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的PPARγ表達(dá)在mRNA水平上明顯低于正常大鼠。作為成脂過程的轉(zhuǎn)錄因子，糖尿病大鼠胰島素效應(yīng)組織PPARγ的表達(dá)降低，可通過影響前脂細(xì)胞分化和成熟脂細(xì)胞功能參與胰島素抵抗的形成[11]，而CM可通過升高PPARγ mRNA表達(dá)量增加胰島素敏感性。TNF-α是一種主要由炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與細(xì)胞凋亡和免疫有關(guān)。近年來，TNF-α在IR相關(guān)疾病中的作用越來越受到重視[12]。有研究報道表明，TNF-α可加速脂肪細(xì)胞的脂解，促使游離脂肪酸(FFA)從細(xì)胞溢出，參與肥胖及胰島素抵抗的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病TNF-α mRNA均顯著上調(diào)，說明其肝臟胰島素抵抗和炎癥損傷的程度較高。CM具有降低TNF-α mRNA表達(dá)的趨勢，提示CM可通過調(diào)節(jié)TNF-α mRNA表達(dá)作用改善糖脂代謝紊亂。

綜上所述，CM可改善糖尿病大鼠的糖脂代謝異常狀態(tài)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)糖脂代謝相關(guān)基因PPARγ，TNF-α的改變有關(guān)。

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Effects of camel milk on glycolipid metabolism and PPARγ、TNFα mRNA expression in rats of type 2 diabetes mellitus

ZHOU Jun, ZHANG Quan-long, YANG Qian, LI Mao-xing, QIU Jian-guo, ZHANG Ruxue

(Key laboratory of the prevention and cure for the plateau environment damage, PLA; Clinical Pharmacy Key Discipline of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050 , China)

ObjectiveTo investigate the effects of camel milk on body weight, blood glucose, lipid, insulin and PPAR-γ、TNF-α mRNA expressions in type 2 diabetes rats. MethodsType 2 diabetes was induced by high fat diet and small dose of STZ(i.g. 30 mg/kg), rats were divided into four groups, normal control(control) group, diabetes model(model) group, camel-low dose(CM-L) group(3.5 mg/kg·d), camel-high dose(CM-H) group(10 mg/kg·d). Body weight and fasting blood glucose were measured every week. Glucose tolerance test(OGTT) was conducted at 4th week. After 4 weeks administration, animals were decapitated, plasma lipid(TC、TG、HDL-C、LDL-C), insulin were assayed. The expression of PPAR-γ and TNF-α mRNA were measured using RT-PCR method. ResultsCompared with control group, the weight of model group lowered significantly(P< 0.01), FBG and blood glucose at 0、30、60、120 min of OGTT, as well as the TC, TG, LDL-C concentrations increased(P< 0.01), while HDL-C content reduced, and insulin level was higher than control rats. Compared with model group, body weight increased and blood glucose decreased in CM group, CM-H reduced the fasting glucose levels in 4th week and decreased the 30min glucose level significantly(P< 0.05). CM lowered the TC, TG, LDL-C, insulin and increased HDL-C concentration, and it is significantly in CM-H(P<0.05). There is a marked decrease in PPARγ mRNA expression(P< 0.05) and a significant increase in TNF-α mRNA expression(P< 0.01)in diabetes rats. Compared with model rats, PPARγ mRNA expression was ascended by CM administration, and it is notably in CM-H group(P< 0.05), while the TNF-α mRNA expression of diabetes rats was lower, but there is no significant. ConclusionsCM can improve the lowered body weight, hyperglycosemia, abnormal glucose tolerance and dyslipidemia in type 2 diabetes. The mechanism of these maybe associated with the regulation of PPARγ and TNF-α mRNA.

Camel milk；Type 2 diabetes mellitus；Blood glucose；Blood lipid；PPARγ；TNF-α

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173620;30772773)。

周珺(1986-)，女，藥師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究工作。

張汝學(xué)(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，教授。E-mail:zhoujunh@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0025-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.004

2016-02-23