蜂巢結(jié)合針刺對變應(yīng)性鼻炎模型大鼠的治療作用研究

秦良卿，馬玉奎，薛　云，劉兆華

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐　262600；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南　250100；3. 山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南　250012)

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蜂巢結(jié)合針刺對變應(yīng)性鼻炎模型大鼠的治療作用研究

秦良卿1，馬玉奎2，薛云2，劉兆華3

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐262600；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南250100；3. 山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250012)

目的探討蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠的治療作用及其機(jī)制。方法采用卵白蛋白制備變應(yīng)性鼻炎(AR)大鼠模型，給予蜂巢結(jié)合針刺治療10d后，以行為學(xué)觀察評分、血清中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量、鼻腔分泌物量、鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)以及胸腺和脾臟系數(shù)為考察指標(biāo)，同時采用丙酸氟替卡松鼻噴霧劑為陽性對照，全面考察蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠的治療作用及其機(jī)制。結(jié)果與模型組比較，蜂巢結(jié)合針刺治療后大鼠行為學(xué)評分降低；血清中組胺、IgE、IL-4含量、鼻腔分泌物量、鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量顯著減少；血清中IFN-γ含量增多；胸腺系數(shù)升高，脾臟系數(shù)明顯降低。結(jié)論蜂巢結(jié)合針刺對AR模型大鼠具有明顯的治療作用。

針刺；蜂巢；變應(yīng)性鼻炎；大鼠

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)即過敏性鼻炎，是耳鼻喉科常見病和多發(fā)病，屬于IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，臨床的主要表現(xiàn)為陣發(fā)性噴嚏、鼻塞、鼻癢、分泌大量清水樣鼻涕等[1]。長期以來，醫(yī)學(xué)界對變應(yīng)性鼻炎的臨床治療一直停留在快速解除癥狀上，使用H1受體拮抗劑或糖皮質(zhì)激素等抗過敏藥物，但這些治療措施一方面只能暫時性緩解鼻炎癥狀，另一方面也存在諸多不良反應(yīng)。蜂巢即蜜蜂房或蜜蜂巢脾，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)菌、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用。我國民間積累了蜂巢治療鼻炎的豐富經(jīng)驗，可以有效地預(yù)防和緩解變應(yīng)性鼻炎的癥狀[2]。同樣針灸作為一種中醫(yī)治療方法已經(jīng)在變應(yīng)性鼻炎中得到應(yīng)用，并取得了一定的療效[3]。但蜂巢或針灸單用療效均有限，且以往的研究多為臨床的總結(jié)，缺乏實驗觀察及機(jī)制研究。本文采用變應(yīng)性大鼠鼻炎模型，研究了蜂巢結(jié)合針刺的治療作用，并初步探討了其作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1動物及飼養(yǎng)環(huán)境 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。飼養(yǎng)于SPF級動物房，相對濕度40%～70%，室溫20～26℃。實驗動物使用許可證號【SYXK(魯)2014-0008】。

1.1.2藥品與試劑 蜂巢(濟(jì)南養(yǎng)蜂堂蜂產(chǎn)品有限公司提供，-18℃冷凍后粉碎，過 20目篩，加入6倍體積水后98℃水浴三次，每次1 h，過濾除蠟，濃縮備用)；丙酸氟替卡松鼻噴霧劑(葛蘭素史克制藥集團(tuán)提供，批號：H20140117)；大鼠組胺、IgE、IL-4、IFN-γ試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司提供)；卵白蛋白(北京索萊寶有限公司提供，批號：326A052)；氫氧化鋁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號：20120907)。

1.1.3儀器 HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司制造)；Spectra Max I3多功能讀板機(jī)(美國MD公司制造)；ST-96W全自動洗板機(jī)(北京譽(yù)朗諾科技有限公司制造)；微量加樣器(美國艾本德公司制造)；一次性針灸針(環(huán)球牌，0.18 mm×13 mm)。

1.2方法

1.2.1大鼠變應(yīng)性鼻炎模型的建立[4]

每只大鼠腹腔注射抗原佐劑混懸液1 mL(含卵白蛋白0.3 mg，氫氧化鋁30 mg)進(jìn)行致敏，隔日1次，共7次。末次致敏后第2天進(jìn)行激發(fā)，每只大鼠給予5%卵白蛋白生理鹽水溶液滴鼻(50 μL/側(cè))，同時超聲霧化吸入1%卵白蛋白溶液5 min，每天1次，連續(xù)7 d。正常組大鼠以相同的操作方法于相同的時間給予等容積的生理鹽水。

1.2.2行為學(xué)觀察評分[5]

末次激發(fā)后采用癥狀評分判斷大鼠是否造模成功，給藥結(jié)束評分判斷干預(yù)效果。記分方法為噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，≥11個為3分；鼻癢：輕度瘙癢1～2次為1分，劇烈瘙癢抓鼻四周為2分；流涕：流至鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。疊加總分5分以上為造模成功。

1.2.3動物分組及給藥

選取造模成功大鼠30只，按行為學(xué)觀察評分均衡地分為3組，分別為模型組、丙酸氟替卡松鼻噴霧劑陽性對照組和蜂巢結(jié)合針刺組。陽性對照組給予丙酸氟替卡松鼻噴霧劑，每只鼻孔每次噴入約50 μg，每日1次，連續(xù)10 d；蜂巢結(jié)合針刺組每日灌胃給予蜂巢水提溶液1 mL/100g，每次灌胃后針刺迎香、肺俞、合谷和足三里，針刺深度約為1 cm，針柄接脈沖電療儀，采用疏密波，頻率2～100 Hz，電流強(qiáng)度1～2 mA，每次10 min，每日1次，連續(xù)10 d[6]。另取10只正常大鼠為正常組，正常組和模型組不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.2.4大鼠血清中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量測定

實驗結(jié)束后腹主動脈采血，分離血清，按照試劑盒說明應(yīng)用雙抗體夾心法(ELISA法)測定標(biāo)本中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量。用純化的大鼠相應(yīng)抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加組胺、IgE、IFN-γ、IL-4，再與HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗滌后加底物TMB顯色。HRP酶可催化TMB轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，樣品中的待測成分含量決定了顏色的深淺。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定樣本的OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算組胺、IgE、IFN-γ、IL-4的濃度。

1.2.5大鼠鼻腔分泌物、嗜酸細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)測定

將濾紙剪成2 cm×0.2 cm的形狀，末次給藥后反復(fù)吸取鼻腔內(nèi)液體，采用減重法記錄鼻腔分泌物重量。將大鼠1%戊巴比妥鈉麻醉后采血測試1.2.4項下指標(biāo)，處死后沿鼻中線剪開鼻腔，暴露鼻中隔及兩側(cè)鼻腔，將鼻中隔中段剪下，剝離雙側(cè)粘膜固定于甲醛溶液中。一側(cè)HE染色后在高倍光學(xué)顯微鏡下計算任意10個視野中嗜酸細(xì)胞(EOS)數(shù)；另一側(cè)甲苯胺藍(lán)染色，同法計數(shù)肥大細(xì)胞數(shù)。

1.2.6大鼠胸腺和脾臟系數(shù)測定

實驗結(jié)束后取大鼠胸腺和脾臟稱重，計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100，單位為 g/100 g體重)。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠行為學(xué)影響

末次激發(fā)后，30只造模大鼠癥狀評分均大于5分，說明造模成功。與模型組比較，給予蜂巢結(jié)合針刺后大鼠的行為學(xué)評分明顯減輕，與模型組比較有顯著性差異(P﹤0.01)，丙酸氟替卡松鼻噴霧劑組大鼠行為學(xué)評分亦有明顯減輕，與蜂巢結(jié)合針刺組比較無顯著性差異(P> 0.05)，說明蜂巢結(jié)合針刺療效與丙酸氟替卡松鼻噴霧劑相當(dāng)(圖1)。

注：** P﹤0.01, vs模型組。圖1　蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠行為學(xué)的影響±s，n=10)Note：** P﹤0.01, vs model group.Fig.1　The effects of acupuncture combined with honeycomb on behavior of AR rats ±s，n=10)

2.2蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠血清中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量的影響

與模型組比較，給予蜂巢結(jié)合針刺或丙酸氟替卡松鼻噴霧劑后大鼠血清中組胺、IgE和IL-4含量明顯減少，IFN-γ含量明顯增多，與模型組比較均有顯著性差異(P﹤0.01)；蜂巢結(jié)合針刺組與丙酸氟替卡松鼻噴霧劑組比較，以上指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明蜂巢結(jié)合針刺和丙酸氟替卡松鼻噴霧劑對變應(yīng)性鼻炎均有較好的治療效果，兩者效果相當(dāng)(表2)。

2.3蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠鼻腔分泌物、嗜酸細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠鼻腔分泌物和鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)。與模型組比較，給予蜂巢結(jié)合針刺后大鼠鼻腔分泌物和鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P﹤0.01)；丙酸氟替卡松鼻噴霧劑組大鼠以上指標(biāo)亦顯著減少(P﹤0.01)，但與蜂巢結(jié)合針刺組比較無顯著性差異(P>0.05)，說明蜂巢結(jié)合針刺療效與丙酸氟替卡松鼻噴霧劑相當(dāng)(圖3)。

注：** P﹤0.01, vs模型組; ## P﹤0.01, vs正常組。圖2　蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠血清中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量的影響Note：** P﹤0.01, vs model group; ## P﹤0.01, vs normal group.Fig.2　The effects of acupuncture combined with honeycomb on the content of histamine, IgE,

注：** P﹤0.01, vs模型組; ## P﹤0.01, vs正常組。圖3　蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠鼻腔分泌物、嗜酸細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)的影響±s，n=10)Note：** P﹤0.01, vs model group; ## P﹤0.01, vs normal group.Fig.3　The effects of acupuncture combined with honeycomb on the weight of nosal secretions and the number of acidophils and mast cells ±s，n=10)

2.4蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠胸腺和脾臟系數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠胸腺系數(shù)明顯降低，而脾臟系數(shù)明顯升高(P﹤0.05)，提示卵白蛋白致敏可降低大鼠胸腺系數(shù)和升高脾臟系數(shù)；與模型組比較，給予蜂巢結(jié)合針刺后大鼠胸腺系數(shù)明顯升高，脾臟系數(shù)明顯降低(P﹤0.05)；其升高胸腺系數(shù)和降低脾臟系數(shù)程度與丙酸氟替卡松鼻噴霧劑組基本一致，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖4)。

注：*P﹤0.05, vs模型組; # P﹤0.05, vs正常組。圖4　蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠胸腺和脾臟系數(shù)的影響±s，n=10)Note：*P﹤0.05, vs model group; # P﹤0.05, vs normal group.Fig.4　The effects of acupuncture combined with honeycomb on the index of spleen and thymus of AR rats ±s，n=10)

3　討論

變應(yīng)性鼻炎是以鼻粘膜變應(yīng)性驗證為主要特征，是由多種免疫活性細(xì)胞和多種細(xì)胞因子共同參與的IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)性疾病。在其發(fā)病過程中，T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞作用最為明顯。從免疫學(xué)的角度看，體內(nèi)外環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致Th1和Th2細(xì)胞因子免疫反應(yīng)失衡是引起變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的關(guān)鍵因素。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，IFN-γ通過抑制嗜酸性細(xì)胞在氣道上的浸潤在AR中起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[7]。 Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-15等細(xì)胞因子。其中IL-4是最重要的特征性細(xì)胞因子，可以刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并合成IgE抗體，IgE抗體可特異性與肥大細(xì)胞交聯(lián)，引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺等炎性介質(zhì)，同時大量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤鼻粘膜，從而引起陣發(fā)性噴嚏、鼻塞、鼻癢、分泌大量清水樣鼻涕等臨床癥狀[8]。

對于過敏性鼻炎的治療主要以抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素、過敏反應(yīng)介質(zhì)阻斷劑、白三烯受體拮抗劑和免疫調(diào)節(jié)劑為主，這些藥物能夠快速緩解AR癥狀，但這些藥物尤其是糖皮質(zhì)激素類具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，對于化藥有禁忌癥的患者或慢性期需要長久性治療的患者，化藥并不合適。而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥卻可以彌補(bǔ)化藥的不足，對于改善過敏體質(zhì)防止復(fù)發(fā)具有重要意義。已有研究表明[2, 6]，針刺和蜂巢治療AR均具有一定的效果，但兩者單用療效有限，短時間內(nèi)改善AR的療效不如化學(xué)藥物，但兩者均沒有任何不良反應(yīng)。本文嘗試將蜂巢和針刺結(jié)合起來，用于治療AR，觀察是否能起到更好的療效，是否能夠替代化藥用于AR。本實驗采用了卵白蛋白制備AR大鼠模型，給予蜂巢結(jié)合針刺治療10 d后，以行為學(xué)觀察評分、血清中組胺、IgE、IFN-γ、IL-4含量、鼻腔分泌物量、鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)以及胸腺和脾臟系數(shù)為考察指標(biāo)，同時采用丙酸氟替卡松鼻噴霧劑為陽性對照，全面考察蜂巢結(jié)合針刺對AR大鼠的治療作用及其機(jī)制。實驗結(jié)果表明，與模型組比較，蜂巢結(jié)合針刺治療后大鼠行為學(xué)評分降低；血清中組胺、IgE、IL-4含量、鼻腔分泌物量、鼻粘膜中嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量顯著減少；血清中IFN-γ含量增多；胸腺系數(shù)升高，脾臟系數(shù)明顯降低。本實驗結(jié)果充分證明，蜂巢結(jié)合針刺對AR具有明顯的療效，其改善程度與丙酸氟替卡松鼻噴霧劑基本一致，臨床上完全可以替代糖皮質(zhì)激素類藥物用于AR的治療。

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Effects of acupuncture combined with honeycomb on allergic rhinitis rat model

QIN Liang-qing1, MA Yu-kui2, XUE Yun2, LIU Zhao-hua3

(1. People’s Hospital of Linqu County, Shandong Linqu 262600, China; 2. Shandong Pharmaceutical Academy,Jinan 250100, China; 3.School of pharmaceutical sciences Shandong university, Jinan 250012, China)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of acupuncture combined with honeycomb on allergic rhinitis(AR)rat model. Methods AR rat model was induced by ovalbumin(OVA). AR rats were treated with acupuncture combined with honeycomb for ten days. Fluticasone propionate nasal spray was selected as positive control in the text. Behavior analysis were observed and the content of histamine, IgE, IFN-γand IL-4 in serum, the weight of nosal draingage and the number of eosinophils and mast cells, the index of spleen and thymus were detected to evaluate the effects of acupuncture combined with honeycomb on AR rats. Results Compared with model group, acupuncture combined with honeycomb treatment groups displayed markedly lower behavior scores, histamine, IgE and IFN-γ in serum, the weight of nosal draingage and the number of eosinophils and mast cells, the index of spleen as well as higher IL-4 in serum and index of thymus. Conclusion Acupuncture combined with honeycomb displayed significant effects on AR rat model.

Acupuncture; Honeycomb; Allergic rhinitis; Rat

山東省自然科學(xué)基金項目(2012HM056)。

秦良卿(1973-)，男，主治醫(yī)師，本科， 研究方向：耳鼻喉疾病研究。

馬玉奎 (1975-)，男，副主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評價。 E-mail：yukuima@sina.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0058-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.009

2016-02-01