WDR1在便秘型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)

張春燕， 孫 剛， 張修禮， 王巍峰， 楊云生， 宋志剛， 路 平

1.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院干部消化科，北京 100048；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院胃腸病及肝病中心；3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理科；4.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院病理科

WDR1在便秘型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)

張春燕1， 孫 剛2， 張修禮2， 王巍峰2， 楊云生2， 宋志剛3， 路 平4

1.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院干部消化科，北京 100048；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院胃腸病及肝病中心；3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理科；4.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院病理科

目的 研究WDR1在便秘型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with constipation, IBS-C)患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)情況,探討腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)發(fā)病的新機(jī)制，為未來研究提供新的思路。方法 應(yīng)用Western blotting和免疫組織化學(xué)(IHC)等方法，觀察WDR1在IBS-C患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)情況。結(jié)果 WDR1在IBS-C組乙狀結(jié)腸表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 WDR1的表達(dá)異常提示IBS-C結(jié)腸黏膜可能存在黏膜細(xì)胞的骨架、結(jié)構(gòu)完整性或細(xì)胞形態(tài)與運(yùn)動(dòng)的異常。結(jié)腸不同部位IBS發(fā)病的分子機(jī)制可能并不相同。

腸易激綜合征；WDR1；細(xì)胞骨架

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是臨床上最常見的一種腸道功能紊亂性疾病,是一組包括腹痛、腹脹、以大便習(xí)慣改變?yōu)橹饕卣?，并伴大便性狀異常，持續(xù)存在或間歇發(fā)作，而又缺乏形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)異常改變等可用器質(zhì)性疾病解釋的臨床癥狀，大致可分為腹瀉型(diarrhea-predominant IBS，IBS-D)、便秘型(constipation-predominant IBS，IBS-C)、混合型(mixed IBS， IBS-M)及未分型(unsubtyped IBS，IBS-U)。

目前IBS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，以往研究提示腸道反應(yīng)性改變(包括運(yùn)動(dòng)和分泌功能異常)、腸道感染及菌群失調(diào)、內(nèi)臟高敏感性、N-腸軸功能紊亂、應(yīng)激等可能與IBS有關(guān),或參與IBS的發(fā)病機(jī)制。Dunlop等[1]研究了不同IBS亞型患者與正常人腸黏膜通透性的差別，發(fā)現(xiàn)IBS-D、IBS-C患者小腸和結(jié)腸黏膜通透性比正常人升高。結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞IBS通透性改變與IBS炎癥及黏膜屏障功能改變有關(guān)，結(jié)腸黏膜屏障是腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

WDR1 蛋白，即WD40重復(fù)包含蛋白1(WD repeat-containing protein 1)，又稱肌動(dòng)蛋白相互影響蛋白1(actin-interacting protein 1，AIP1)，最初在聽覺受損的雞內(nèi)耳中發(fā)現(xiàn)，是一種64 KD 的位于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架蛋白，在蛋白間起非常重要的作用[2]。 作為骨架蛋白，WDR1是維持細(xì)胞間緊密連接不可缺少的因子，因此，本研究應(yīng)用免疫組化(IHC)、Western blotting等方法觀察WDR1在IBS-C患者結(jié)腸黏膜中的表達(dá)情況，以正常健康人為對(duì)照組，以期對(duì)IBS發(fā)病機(jī)制的研究提供新的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 按照羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)及羅馬Ⅱ科研診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇非感染后IBS-C患者12例,男女各6例，年齡36～58歲，平均年齡(45.8±6.2)歲；健康對(duì)照組12名，男女各6名，年齡40～56歲，平均(47.8±4.5)歲。IBS-C患者及健康志愿者均獲得知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) IBS組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)及羅馬Ⅱ科研診斷標(biāo)準(zhǔn)的非感染后IBS-C患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腸道器質(zhì)性疾病及手術(shù)史者；(2)精神、神經(jīng)或其他系統(tǒng)器質(zhì)性疾病者；(3)孕婦和哺乳期婦女；(4)有消化道感染史的IBS患者，即感染后IBS (postinfectious IBS, PI-IBS )。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸息肉電切除術(shù)后復(fù)查無異常發(fā)現(xiàn)者(術(shù)后半年以上) 或因大便帶少量鮮血行結(jié)腸鏡檢查診斷為痔瘡者，無其他消化道癥狀與體征，無免疫疾病、感染病史，無近期服藥史健康志愿者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本鉗取及處理：在進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查時(shí)，分別在盲腸、乙狀結(jié)腸處直視下活檢鉗取黏膜組織(應(yīng)用統(tǒng)一型號(hào)的活檢鉗)，每部位取5塊，4塊于冰鹽水中沖洗3遍，洗去血跡，放入凍存管，立即入液氮中保存；1塊立即置于10%的甲醛溶液中固定，3 d內(nèi)予石蠟包埋，常規(guī)病理檢查。

1.3.2 結(jié)腸黏膜HE染色：各部位標(biāo)本以10%甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片，按常規(guī)進(jìn)行。病理切片的觀察由2名病理學(xué)專家完成。

1.3.3 IHC分析：石蠟切片制片：SP免疫組織化學(xué)染色，常規(guī)切片4 μm。應(yīng)用兔抗人WDR1多克隆抗體(美國(guó)Abcam 公司)1∶2 000置于濕盒中4 ℃冰箱過夜或室溫60 min，然后應(yīng)用二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)37 ℃孵育60 min；應(yīng)用蘇木素復(fù)染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察結(jié)果。 用PBS代替一抗做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果陰性。

1.3.4 染色結(jié)果分析：IHC染色判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：無著色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為中等陽性，深棕黃色為強(qiáng)陽性。每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野(200×)進(jìn)行攝片，計(jì)數(shù)IHC標(biāo)記定位準(zhǔn)確的陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例并記分，其標(biāo)準(zhǔn)為胞漿或胞核陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)<25%為(±)，25%～50%為(+)，50%～75%為(++)，>75%為(+++)，依次記為1、2、3、4分；染色強(qiáng)度弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性依次以(±)、(+)、(++)表示，記為1、2、3分；最后計(jì)算兩種記分的乘積。表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分和觀察結(jié)果評(píng)分的乘積為表達(dá)強(qiáng)度。陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)強(qiáng)度綜合得分>4分[3]。

1.3.5 Western blotting檢測(cè)：取20 μg所提取的蛋白經(jīng)過12%的分離膠分離，上樣量55 μg；一抗兔抗人WDR1抗體(效價(jià)1∶1 000)， 4 ℃過夜；二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶8 000)室溫孵育1 h。用ECL顯色試劑對(duì)膜進(jìn)行顯色，而后在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影、定影，結(jié)果分析以β-actin 蛋白表達(dá)作為參照，應(yīng)用BioRad公司提供的QuantityOne分析軟件進(jìn)行圖像分析。 測(cè)定目的顯影條帶和內(nèi)參照GAPDH(稀釋度1∶500) 的灰度值，結(jié)果以比值(樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值)表示。

2 結(jié)果

2.1 WDR1在結(jié)腸黏膜的IHC表達(dá) WDR1在正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞胞漿中呈陽性表達(dá)，顯示為深棕色顆粒，上皮基底膜、固有層細(xì)胞及小血管也有表達(dá)(見圖1)。WDR1在IBS-C組乙狀結(jié)腸IHC染色強(qiáng)度分值明顯高于健康對(duì)照組相應(yīng)部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。WDR1在IBS-C組盲腸的IHC染色強(qiáng)度分值與健康對(duì)照組相應(yīng)部位相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；WDR1在健康對(duì)照組盲腸、乙狀結(jié)腸的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。陰性對(duì)照除胞核染成藍(lán)色外，無棕黃色反應(yīng)物。

2.2 WDR1在結(jié)腸黏膜中的表達(dá) WDR1在IBS-C組乙狀結(jié)腸表達(dá)量高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；WDR1在IBS-C組盲腸的表達(dá)與健康對(duì)照組的對(duì)應(yīng)部位相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；WDR1在健康對(duì)照組盲腸、乙狀結(jié)腸的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

3 討論

不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)或不同時(shí)期的細(xì)胞常呈現(xiàn)不同的形態(tài)，這些形態(tài)改變都需要細(xì)胞骨架再塑形，肌動(dòng)蛋白在此過程中發(fā)揮著核心作用。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。肌動(dòng)蛋白的塑形由連接蛋白進(jìn)行調(diào)控，肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白(actin deploymerization fator, ADF/cofilin)是最重要的連接蛋白之一。WDR1 蛋白的主要作用是與ADF/cofilin共同調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的解聚和分離[4]，這些活動(dòng)與細(xì)胞增殖、運(yùn)輸、遷移、趨化、胞質(zhì)分裂等許多細(xì)胞生理活動(dòng)有關(guān)[5]。

Oh等[6]研究發(fā)現(xiàn)鳥類暴露于噪聲后，其耳蝸支持細(xì)胞的WDR1基因表達(dá)增強(qiáng)，肌動(dòng)蛋白肌絲翻轉(zhuǎn)加快，提示W(wǎng)DR1在修復(fù)細(xì)胞骨架完整性或增強(qiáng)細(xì)胞再生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。Adler等[2]在研究中也發(fā)現(xiàn)WDR1局限在正常鳥類螺旋器的毛細(xì)胞胞漿，支持細(xì)胞中不存在，但是聽覺遭受過度刺激后WDR1重新分布，在支持細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為WDR1與內(nèi)耳承受噪音后的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。編碼WDR1的基因位于SLC2A9下游[7]。SLC2A9及WDR1為非綜合征性唇腭裂的候補(bǔ)基因[8]。

注：結(jié)腸上皮細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)(白色箭頭所示);與健康對(duì)照組相比，*P<0.01。

圖1 WDR1在各組結(jié)腸黏膜IHC表達(dá)(200×) A：健康對(duì)照盲腸；B：健康對(duì)照乙狀結(jié)腸；C:IBS-C盲腸；D:IBS-C乙狀結(jié)腸； 圖2 WDR1的染色強(qiáng)度分值比較

Fig 1 Immunohistochemical analysis of WDR1 expression in the colon mucosa A: caecum in healthy control group; B:sigmoid colon in healthy control group; C: cecum in IBS-C group; D: sigmoid colon in IBS-C group; Fig 2 Comparison of WDR1 staining intensity score

注：泳道1～3為健康對(duì)照組，泳道4～6為IBS-C組;與健康對(duì)照組相比,*P<0.05。

圖3 WDR1在兩組結(jié)腸黏膜的表達(dá) A：盲腸WDR1的表達(dá)；B：乙狀結(jié)腸WDR1 的表達(dá)；C：兩組WDR1/GAPDH比較

Fig 3 Detection of WDR1 expression in colon mucosa between two groups A: WDR1 expression in caecum; B: WDR1 expression in sigmoid colon; C: comparison of WDR1/GAPDH between two groups

很多研究[9-11]證實(shí)SLC2A9與尿酸濃度及痛風(fēng)有關(guān)，作為促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白基因家族成員對(duì)維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)尤為重要?；蚺c環(huán)境相互作用提示 SLC2A9與WDR1相互影響。研究[12]發(fā)現(xiàn)，IBS患者與糖代謝有關(guān)的酶表達(dá)失衡有關(guān)。WDR1表達(dá)異常，也會(huì)影響SLC2A9的表達(dá)，進(jìn)一步提示IBS患者可能與代謝相關(guān)。

WDR1在結(jié)腸黏膜的表達(dá)情況還未見報(bào)道，本研究通過IHC發(fā)現(xiàn)WDR1蛋白在正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)。IBS-C結(jié)腸黏膜也呈陽性表達(dá)IHC染色強(qiáng)度分值可見在IBS-C組乙狀結(jié)腸黏膜上皮胞漿表達(dá)量高于健康對(duì)照組，并通過Western blotting 檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證WDR1在結(jié)腸黏膜的存在，且正常結(jié)腸黏膜與IBS-C結(jié)腸黏膜存在差異改變。WDR1在IBS-C盲腸與健康對(duì)照組對(duì)應(yīng)部位相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IBS-C組乙狀結(jié)腸可能存在影響細(xì)胞骨架及細(xì)胞生理活動(dòng)的因素，使WDR1表達(dá)增高以促進(jìn)細(xì)胞骨架修復(fù)或增強(qiáng)細(xì)胞再生。IBS-C患者僅乙狀結(jié)腸黏膜WDR1出現(xiàn)高表達(dá)，可能提示乙狀結(jié)腸黏膜分子異常對(duì)IBS-C的發(fā)病更為重要。

WDR1的研究相對(duì)較少，尤其在結(jié)腸疾病發(fā)病機(jī)制中的作用還未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)WDR1在IBS-C乙狀結(jié)腸表達(dá)升高，提示W(wǎng)DR1在功能性腸病，尤其在IBS-C的發(fā)病中可能起作用，WDR1如何參與IBS-C的發(fā)病，為何僅在乙狀結(jié)腸發(fā)生異常？其升高是IBS-C發(fā)病的原因還是結(jié)果？許多的疑問需要更多的研究去解答。

WDR1表達(dá)異?？赡苡绊懠?xì)胞的骨架、結(jié)構(gòu)完整性或細(xì)胞的形態(tài)與運(yùn)動(dòng)等。WDR1在同組不同部位表達(dá)情況有時(shí)也不一致。由此可見，結(jié)腸的不同部位可能存在不同影響IBS發(fā)病的分子機(jī)制。

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(責(zé)任編輯：李 健)

The expression of WDR1 in colonic mucosa of the irritable bowel syndrome with constipation

ZHANG Chunyan1, SUN Gang2, ZHANG Xiuli2, WANG Weifeng2, YANG Yunsheng2, SONG Zhigang3, LU Ping4

1.Department of Geriatric Gastroenterology, Chinese PLA Navy General Hospital, Beijing 100048; 2.Department of Gastroenterology and Hepatology, Chinese PLA General Hospital; 3.Department of Pathology, Chinese PLA General Hospital; 4.Department of Pathology, Chinese PLA Navy General Hospital, China

Objective To investigate the expression of WD repeat-containing protein 1 (WDR1) in colonic mucosa of the irritable bowel syndrome with constipation (IBS-C), and to provide new clues to further research on the mechisms of irritable bowel syndrome (IBS). Methods The expression of WDR1 in colonic mucosa of the IBS-C was detected by Western blotting and immunohistochemical (IHC). Results WDR1 was higher in sigmoid colon of IBS-C than that in the control group, there was statistical significance (P<0.01). Conclusion The abnormal expression of WDR1 may influence colonic cystoskeleton, cellularity, cellular morphology and cellular movement. The different parts of the colon may have different pathogenesis of IBS.

Irritable bowel syndrome; WD repeat-containing protein 1; Cystoskeleton

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.017

張春燕，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：功能性胃腸病的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：xchun3@sohu.com

楊云生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：消化內(nèi)鏡新技術(shù)研究，功能性胃腸病臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：yangys@163bj.com

R574

A

1006-5709(2016)03-0299-04

2015-02-12