東方次睪吸蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

那璐，高俊峰，2，仇建華，李榮，邵志輝，張艷，王春仁

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

東方次睪吸蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

那璐1，高俊峰1，2，仇建華1，李榮1，邵志輝1，張艷1，王春仁1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

為了快速準(zhǔn)確地檢測(cè)鴨、犬等動(dòng)物東方次睪吸蟲(chóng)的感染情況，根據(jù)GenBank中發(fā)表的東方次睪吸蟲(chóng)ITS序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以糞便樣品中蟲(chóng)卵DNA為模板，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，經(jīng)過(guò)敏感性、特異性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，建立檢測(cè)動(dòng)物糞便中東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的方法。結(jié)果，陽(yáng)性樣品可擴(kuò)增得到260 bp的特異性條帶，華支睪吸蟲(chóng)、卷棘口吸蟲(chóng)、纖細(xì)背孔吸蟲(chóng)DNA樣品檢測(cè)均為陰性，檢測(cè)到的最低蟲(chóng)卵數(shù)為0.031 25個(gè)/克糞便，表明研究建立的PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性和靈敏性。臨床檢測(cè)87份鴨糞樣本，其中6份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為6.9%，結(jié)果顯示大慶地區(qū)鴨子存在東方次睪吸蟲(chóng)感染，所建立的方法適合于鴨子及其他家禽東方次睪吸蟲(chóng)的檢測(cè)。

東方次睪吸蟲(chóng)；PCR檢測(cè)方法；建立；應(yīng)用

東方次睪吸蟲(chóng)（Metorchis orientalis）隸屬于后睪科（Opisthorchiidae）、次睪屬（Metorchis），主要寄生于雞鴨等禽類的膽管和膽囊內(nèi)，也可寄生于犬、貓，人也有感染的報(bào)道［1-2］。該病主要流行于我國(guó)，福建、黑龍江、安徽等10多個(gè)省區(qū)有感染的報(bào)道［1-4］。動(dòng)物感染后會(huì)出現(xiàn)膽囊高度腫大，肝膽區(qū)疼痛、腹痛、腹瀉、體重減輕、消瘦、貧血等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡，給畜牧業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。

目前對(duì)該病的診斷主要是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)對(duì)蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵進(jìn)行形態(tài)鑒定來(lái)確診。在實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)蟲(chóng)卵較少或混合感染時(shí)容易造成漏檢或誤診；對(duì)解剖發(fā)現(xiàn)的成蟲(chóng)進(jìn)行鑒定雖然準(zhǔn)確，但需要剖殺動(dòng)物，還需要制作裝片才能確定。目前還未發(fā)現(xiàn)該病的免疫學(xué)診斷方法，因此我們迫切需要尋找一種快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的人意識(shí)到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在臨床診斷中的有效應(yīng)用，從細(xì)菌到病毒再到寄生蟲(chóng)，PCR秉承著其快捷、準(zhǔn)確、安全的優(yōu)點(diǎn)不斷進(jìn)步，不斷發(fā)展。因此，實(shí)驗(yàn)擬建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR方法，并進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)體

采自大慶市周邊鴨場(chǎng)糞便樣本若干份，-20℃保存；東方次睪吸蟲(chóng)DNA及對(duì)照蟲(chóng)體DNA：華支睪吸蟲(chóng)DNA、卷棘口吸蟲(chóng)DNA、纖細(xì)背孔吸蟲(chóng)DNA均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.2 主要試劑

dNTP Mixture、Ex Taq酶和DNA Marker為大連寶生物（Takara）公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、Tris堿、Tris Base、EDTA、裂解液、液氮、蛋白酶K、Tris飽和酚（4℃保存）、三氯甲烷、醋酸鈉、無(wú)水乙醇、蒸餾水、酒精等為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

將GenBank上發(fā)表的東方次睪吸蟲(chóng)ITS基因序列［5］與華支睪吸蟲(chóng)等的ITS序列進(jìn)行對(duì)比，尋找突變區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物GN1。應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為GN1 F：5’-TGT ACC CAG TGT GTG TGC CT-3’和GN1 R：5’-GCA GTG AGA CAA GCT AGA CA-3’，預(yù)測(cè)擴(kuò)增大小為260 bp。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 糞便中蟲(chóng)卵DNA的提取

參照王珍麗等［6］血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵DNA的快速提取法，進(jìn)行改良。

1.2.3 PCR進(jìn)行擴(kuò)增

以從鴨糞便中提取出的東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵（動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)成蟲(chóng)為東方次睪吸蟲(chóng)）的DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)東方次睪吸蟲(chóng)核糖體ITS部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，混入1 μL的6×Loading buffer，用移液槍混勻后加入配置好的1%瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳25 min，取出后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄下來(lái)。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

以東方次睪吸蟲(chóng)DNA、華支睪吸蟲(chóng)DNA、卷棘口吸蟲(chóng)DNA、纖細(xì)背孔吸蟲(chóng)DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。

1.2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

將感染寄生蟲(chóng)的鴨子的陽(yáng)性糞樣在顯微鏡下對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行計(jì)數(shù)，所檢的蟲(chóng)卵依次為100個(gè)、10個(gè)和1個(gè)/克糞便，同時(shí)將每克糞便1個(gè)蟲(chóng)卵提取的DNA模板倍比稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定最小蟲(chóng)卵檢出量。

1.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為保證實(shí)驗(yàn)的可靠和準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取6個(gè)陽(yáng)性樣品和6個(gè)陰性樣品，用建立的PCR方法進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè)

采集黑龍江省大慶周邊個(gè)體養(yǎng)殖的鴨糞樣87份，應(yīng)用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)糞樣中東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵檢測(cè)。選擇檢測(cè)出的陰陽(yáng)鴨子各2只進(jìn)行剖檢，以確定建立方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳觀察后，得出結(jié)果，從圖1可看出，只有東方次睪吸蟲(chóng)在260 bp位置出現(xiàn)一條與預(yù)計(jì)片段大小相符的條帶，而華支睪吸蟲(chóng)、卷棘口吸蟲(chóng)、纖細(xì)背孔吸蟲(chóng)和陰性對(duì)照組均未擴(kuò)增出目的條帶，表明該方法具有較好的特異性。

圖1 PCR特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR specific detection

2.2 敏感性實(shí)驗(yàn)

以100個(gè)、10個(gè)和1個(gè)蟲(chóng)卵DNA按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀釋后DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果隨著DNA濃度的降低，目的條帶的亮度也越來(lái)越弱，在稀釋到1∶32之后，特異性條帶消失（圖2）。即確定每克糞便中含有0.031 25個(gè)蟲(chóng)卵時(shí)為PCR檢測(cè)的最小劑量，表明該方法具有良好的敏感性。

圖2 PCR敏感性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of PCR sensitive detection

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取的6份陽(yáng)性和陰性樣品，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示陽(yáng)性樣品在260 bp的位置處出現(xiàn)了目的條帶，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們將實(shí)驗(yàn)重復(fù)幾次，最終得到的結(jié)果一致，證明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 臨床樣品的檢測(cè)

用建立的PCR診斷方法對(duì)大慶市周邊禽場(chǎng)的鴨子糞便進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)提取87份糞便DNA，進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，6份經(jīng)PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)陽(yáng)性條帶（圖3），感染率為6.9%。剖殺的2只陽(yáng)性鴨子均在肝臟中檢出東方次睪吸蟲(chóng)，而2只陰性鴨子沒(méi)有檢出蟲(chóng)體。

圖3 部分樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The results of sample detection

3 討論

寄生蟲(chóng)的準(zhǔn)確分類和鑒定是從事一切寄生蟲(chóng)學(xué)和寄生蟲(chóng)病學(xué)研究的基礎(chǔ)。由于一些寄生蟲(chóng)有著十分相近的形態(tài)和發(fā)育史，給傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類和鑒定帶了一定的困難，阻礙了一些科研工作的順利進(jìn)行。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于病毒、真菌、細(xì)菌等各個(gè)領(lǐng)域［7-8］。寄生蟲(chóng)學(xué)的研究也不例外，目前應(yīng)用也較多，特別是用于檢驗(yàn)動(dòng)物糞便中蟲(chóng)卵。如人蛔蟲(chóng)卵、熊貓蛔蟲(chóng)卵、犬細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)卵和日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的檢測(cè)等［6，9-11］，然而對(duì)于東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。

研究中，通過(guò)網(wǎng)上已有的東方次睪吸蟲(chóng)的基因序列，在其基因的變異區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用來(lái)鑒別與東方次睪吸蟲(chóng)形態(tài)極為相近的一些吸蟲(chóng)。研究使用的樣品為來(lái)自糞便中的蟲(chóng)卵，所以糞便中蟲(chóng)卵DNA的成功提取為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。提取糞便中蟲(chóng)卵的DNA方法有多種，其中一種方法是用商品試劑盒提取，雖效果很好，但成本較高。試驗(yàn)所用的方法為改良的有機(jī)溶劑提取法，不僅可以提取出較多量的DNA，同時(shí)可以濃縮出較為純凈的DNA。能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，同時(shí)具有簡(jiǎn)單、方便、價(jià)格便宜和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)成功地建立了檢測(cè)家禽糞便中東方次睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR方法，該方法與已知的陰陽(yáng)樣品符合率為100%，具有快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，臨床樣本檢測(cè)顯示大慶地區(qū)鴨子存在東方次睪吸蟲(chóng)感染。

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Establishment and App lication of PCR M ethods of Meotrchis orientalis

Na Lu1，Gao Junfeng1，2，Qiu Jianhua1，Li Rong1，Shao Zhihui1，Zhang Yan1，W ang Chunren1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science）

To establish a method for detecting Meotrchis orientalis，two specific primers were synthesized according to the sequence of ITS rDNA of M.orientalis on the GenBank to amplify the DNA in the eggs by optimizing PCR conditions，then evaluating sensitivity，specificity and repeatability.Finally，a method of detect ing M.orientalis was set up.The results showed that the obtained specific band was 260 bp，and under the same constraint，PCR assay was negative to Clonorchis sinensis，Echinostoma revolutum，Notocotylus attenuatus，Echinostoma revolutum DNA.The method’s minimum detect limit was 0.031 25 eggs DNA per gram feces.Among 87 clinical samples there were six positive samples，so the positive rate was 6.9%.The results indicated that there was M.orientalis in the poultry farm in Daqing city.The PCR method had high sensitivity and specificity，which could be used to diagnose M.orientalis in ducks and other poultry.

Metorchis orientalis；PCR method；establishment；application

S856.5

A

1002-2090（2016）03-0043-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.009

2015-03-28

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2014C033）；家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（SKLVEB2014KFKT006）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410223001）。

那璐（1988-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

王春仁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chunrenwang@sohu.com。