有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合褪黑素對(duì)二型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松影響的實(shí)驗(yàn)研究

景會(huì)鋒 王小梅

延安大學(xué)體育學(xué)院，陜西 延安 716000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是常見的代謝性骨病，近年來(lái)我國(guó)OP的患病率呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)，以往研究表明，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者半數(shù)以上合并OP[1]，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。運(yùn)動(dòng)和褪黑素對(duì)于2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)的益處十分明顯，能有效改善糖尿病人的血脂代謝紊亂，降低氧化應(yīng)激損傷，有效緩解癥狀[2]；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為調(diào)控骨代謝的重要因素之一，其對(duì)骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激可顯著提高骨中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和骨量等，從而防治骨質(zhì)疏松[3]。最近研究表明，褪黑素除了參與機(jī)體生物節(jié)律、生殖、體溫、免疫功能、心血管發(fā)育等方面的調(diào)節(jié)以外，還可以通過(guò)提高抗氧化、影響降鈣素和甲狀旁腺素的分泌，參與了鈣的新陳代謝，對(duì)骨的形成、骨量的增加等方面有積極作用[4]。隨著人年齡增長(zhǎng)(尤其是女性)，血清中的褪黑素水平下降，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生幾率明顯增加[5]，且與此相關(guān)。對(duì)2型糖尿病與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者有所探討[6,7]，但鮮有從運(yùn)動(dòng)療法方面結(jié)合褪黑素對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP) 的關(guān)系做進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)用DM大鼠模型，綜合評(píng)價(jià)有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合外源性褪黑素的補(bǔ)充對(duì)T2DM患者預(yù)防OP的作用，對(duì)改善糖尿病患者的癥狀，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生有實(shí)際意義。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性SD大鼠80只(購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心)，6w，體重200～220g，動(dòng)物室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度45%～55%，每天按自然晝夜照明，光照時(shí)間12h，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠分組及DOP模型的建立：適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為8組：安靜對(duì)照組(N)、正常有氧運(yùn)動(dòng)組(E)、正常褪黑素組(M)、正常有氧運(yùn)動(dòng)褪黑素組(EM)、糖尿病對(duì)照組(D)、糖尿病有氧運(yùn)動(dòng)組(DE)、糖尿病褪黑素組(DM)、糖尿病有氧運(yùn)動(dòng)褪黑素組(DEM)，每組各10只，N組大鼠不加任何干預(yù)，D、DE、DM和DEM組大鼠一次性腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，STZ購(gòu)買于Sigma公司，現(xiàn)配現(xiàn)用，注射7 d后尾靜脈采血測(cè)試血糖濃度，血糖濃度大于16.7 mmol/L且持續(xù)3 w，為暫時(shí)成模大鼠[8]。注射STZ后，D組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第13天進(jìn)行頸部皮下注射鹽酸四環(huán)素(25 mg/kg)，作為第1次熒光標(biāo)記，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第3天進(jìn)行頸部皮下注射calcein(5 mg/kg)作為第2次熒光標(biāo)記，以在骨表面形成黃色和綠色雙熒光標(biāo)志，兩次熒光標(biāo)記間隔時(shí)間為10 d，可動(dòng)態(tài)觀察兩次注射期間骨形成的情況。末次實(shí)驗(yàn)后分離大鼠右側(cè)脛骨，用甲基丙烯酸甲酯包埋做不脫鈣骨切片，采用半自動(dòng)圖像數(shù)字化分析儀并計(jì)算出新生骨小梁面積百分比，D組大鼠脛骨上段骨小梁面積百分?jǐn)?shù)由25.71降低到14.78，提示D組大鼠伴隨骨量丟失。

1.2.2褪黑素干預(yù)：褪黑素購(gòu)買于Sigma公司，使用前溶于2%的乙醇溶液中，M組、EM組、DM組和DEM組大鼠每天灌胃40 mg/kg褪黑素，N組、E組、D 組和DE組每天灌胃等體積的2%乙醇溶液。

1.2.3運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案：E、EM、DE和DEM組大鼠采用遞增負(fù)荷的方式進(jìn)行跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng)，起始速度為10 m/min，時(shí)間為20 min，適應(yīng)性訓(xùn)練1 w后開始正式訓(xùn)練。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參考Bedford的研究加以調(diào)整，每周訓(xùn)練5 d，速度逐漸遞增由10 m/min增至20 m/min，訓(xùn)練時(shí)間遞增值為5 min/d[9]。整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程共持續(xù)6 w，EM組和DEM組大鼠灌胃給藥30 min后開始訓(xùn)練。

1.2.4儀器設(shè)備與觀察指標(biāo)的測(cè)定：于末次訓(xùn)練結(jié)束后，按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，仰臥位置于DXA探頭之下，固定四肢，使椎體保持豎直，雙側(cè)股骨保持水平狀態(tài)，應(yīng)用雙能X線BMD測(cè)定儀測(cè)定腰椎(L3-L6)和左右股骨BMD。BMD測(cè)試結(jié)束后，迅速分離頸總動(dòng)脈，采血4 mL，注入含乙二胺四乙酸鈉30 μL和10%抑肽酶40 μL的試管中，混勻，離心半徑12 cm，離心(3000 r/min，10 min，4℃)，分離血漿，-20℃保存，備用待測(cè)血糖、SOD(superoxide dismutase)、MDA(malonaldehyde)、GSH-Px(glutathione peroxidase)、血Ca、P、PTH(parathyroid hormone)，血糖和血Ca、P測(cè)定應(yīng)用東芝全自動(dòng)生化分析儀，SOD、MDA、GSH-Px 的測(cè)試嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司，應(yīng)用放射免疫法測(cè)定PTH，PTH放免試劑盒購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院長(zhǎng)城免疫研究所。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重的變化

表1 各組大鼠體重的變化Table 1 The change of body weight in rats of each group (g, n=10,

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表1可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠體重下降，但是無(wú)顯著性差異(P>0.05)，D組大鼠體重顯著性下降(P<0.05)；與D組比較，有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素干預(yù)后大鼠體重顯著性升高(P<0.05)，與DME和DMM組比較，運(yùn)動(dòng)和褪黑素聯(lián)合干預(yù)后大鼠體重進(jìn)一步升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠椎骨和左右股骨BMD的變化

由表2可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)，D組大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性下降(P<0.05)；與D組比較，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)，褪黑素干預(yù)后大鼠椎骨和左右股骨BMD升高，但不具有顯著性差異(P>0.05)，與DME和DMM組比較，運(yùn)動(dòng)和褪黑素聯(lián)合干預(yù)后大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠椎骨和左右股骨BMD的變化Table 2 The change of vertebral and femoral BMD in rats of each group (g/cm2,

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

2.3 各組大鼠血糖與血清總Ca、P和PTH的變化

表3 各組大鼠血糖與血清總Ca、P和PTH的變化Table 3 Changes of blood glucose, serum total Ca, P, and PTH in rats of each group

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表3可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠血糖、血PTH、血Ca和血P無(wú)顯著性變化(P>0.05)，D組大鼠血糖和血PTH顯著性升高(P<0.05)，血Ca顯著降低(P<0.05)，血P無(wú)明顯變化(P>0.05)；與D組比較，有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素干預(yù)后大鼠血糖和血PTH顯著性降低(P<0.05)，血Ca顯著升高(P<0.05)，血P無(wú)明顯變化(P>0.05)，與DE和DM組比較，運(yùn)動(dòng)和褪黑素聯(lián)合干預(yù)后大鼠血糖和血PTH顯著性降低(P<0.05)，血Ca顯著升高(P<0.05)，血P無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.4 各組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的變化

表4 各組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的變化Table 4 The changes of SOD, GSH-Px activity, and MDA content in rats of each

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表4可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，D組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與D組比較，有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素干預(yù)后大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，與DE和DM組比較，運(yùn)動(dòng)和褪黑素聯(lián)合干預(yù)后SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

以往對(duì)D2M的研究表明，病程持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，體重降低程度則越明顯，Tong等[10]研究發(fā)現(xiàn)模擬失重可明顯降低大鼠的股骨生物力學(xué)指標(biāo)值，由此表明，體重下降是發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素之一；另有部分研究則顯示BMD與體脂百分比呈正相關(guān)，單就BMD與脂肪的關(guān)系而言，目前研究尚未取得一致結(jié)果，徐君翔[11]認(rèn)為脂肪含量對(duì)BMD有顯著的影響，局部脂肪比例增加BMD下降顯著。本研究則證實(shí)，隨著D2M大鼠體重下降，體脂降低，BMD下降，有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素干預(yù)后可明顯抑制大鼠體重下降，同時(shí)BMD下降的趨勢(shì)也得到緩解。

運(yùn)動(dòng)是影響B(tài)MD的一個(gè)重要因素。運(yùn)動(dòng)方式不同對(duì)骨骼的負(fù)荷作用不同，對(duì)BMD產(chǎn)生的不同影響。適度的運(yùn)動(dòng)在增加肌肉重量、增強(qiáng)肌力的同時(shí)，BMD也可獲得不同程度的提高，有研究顯示，肌力與BMD呈正相關(guān)，肌力的增加有助于骨量的維持[12,13]。大量研究證明，體育鍛煉可增加峰值的骨量，而峰值骨量是決定是否出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀的關(guān)鍵性因素。研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制骨吸收對(duì)去卵巢大鼠股骨下端松質(zhì)骨的骨量和骨結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了良好的影響[14]。另有研究表明高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，更有利于骨的礦化[15]；同時(shí)隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，BMD值逐步增加。本研究也證實(shí)運(yùn)動(dòng)能改善BMD，運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼受到擠壓力和剪切力的直接刺激作用外，還有來(lái)自肌肉收縮對(duì)骨骼的牽拉刺激，有助于骨形成和重建，從而增加BMD；另外，運(yùn)動(dòng)還能增加胃腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和鈣的吸收，體內(nèi)維生素D濃度增高等作用來(lái)提高BMD。綜上所述，運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨產(chǎn)生的直接力學(xué)刺激有可能通過(guò)提高骨形成并抑制骨吸收，從而使得大鼠BMD顯著增加。

血清Ca、P測(cè)定是可間接反應(yīng)骨代謝情況[16]。已有研究表明，糖尿病大鼠長(zhǎng)期的高血糖會(huì)引起Ca、P攝入減少而丟失增加，血Ca降低，PTH分泌增加，動(dòng)員大量骨Ca入血，致使骨質(zhì)疏松[17]，也有臨床證據(jù)表明長(zhǎng)期高血糖環(huán)境不利于骨膠原交聯(lián)[18]。另外，Balint等指出高血糖毒性作用可以成骨細(xì)胞抑制對(duì)Ca的攝取，可能與糖尿病發(fā)生時(shí)骨結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。在 T1DM患者中BMD值是降低的，對(duì)T2DM患者的大量研究表明，BMD值可以正常，降低或升高。本研究則證實(shí)，D2M大鼠血糖和PTH水平顯著升高的同時(shí)，伴隨血Ca顯著降低，椎骨和左右股骨BMD均顯著性下降，這或許是由于D2M大鼠長(zhǎng)期的高血糖能夠降低血Ca水平，而低血Ca進(jìn)而影響骨礦化，使得血PTH反饋升高，并且與血糖升高水平成正相關(guān)，從而降低BMD。因此，可以認(rèn)為糖尿病通過(guò)高血糖引起的低血Ca、高PTH降低BMD，形成骨質(zhì)疏松。

褪黑素主要由松果體合成與分泌，近年來(lái)眾多實(shí)驗(yàn)證明，褪黑素對(duì)于骨的重建過(guò)程具有重要作用，一方面能促進(jìn)骨的發(fā)生，另一方面能防止骨的退化。外源性褪黑素促進(jìn)了多種前成骨細(xì)胞系以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步分化，在骨的發(fā)生中有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)成骨過(guò)程。褪黑素在鈣新陳代謝方面的作用最初由Csaba等研究發(fā)現(xiàn)，這個(gè)作用由褪黑素通過(guò)影響降鈣素與PTH的分泌介導(dǎo)的。本研究也證實(shí)褪黑素干預(yù)后，血糖和血清PTH降低，血鈣升高，同時(shí)伴隨BMD的增加。

大量研究表明，當(dāng)DM患者血糖水平升高時(shí)，會(huì)使氧化應(yīng)激水平增高，從而促進(jìn)DOP的發(fā)生與發(fā)展，這點(diǎn)提示控制血糖可能是防治DOP的一個(gè)非常重要途徑[19]。氧化應(yīng)激主要通過(guò)耗竭抗氧化物質(zhì)、激活破骨細(xì)胞、抑制成骨細(xì)胞及骨形成來(lái)影響骨代謝。血清中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量一直被認(rèn)為是反映氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)[20]，本研究表明，T2DM大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性降低和MDA含量升高，抗氧化應(yīng)激能力減弱，骨代謝過(guò)程紊亂。以往研究表明，運(yùn)動(dòng)特別是有氧運(yùn)動(dòng)可以提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激的能力[21]，褪黑素是一種非酶類抗氧化物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用[22]，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)6w的有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素治療后，血清中SOD和GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯下降，從而減少氧化應(yīng)激損傷。規(guī)律運(yùn)動(dòng)能夠穩(wěn)定控制血糖水平已被諸多研究所證實(shí)。但是不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)血糖影響的報(bào)道不多，且尚有爭(zhēng)議。大量資料表明, 對(duì)于改善糖和胰島素抵抗代謝, 有氧運(yùn)動(dòng)能夠加快骨骼肌對(duì)糖的攝取，從而有效降低血糖。本研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)和褪黑素干預(yù)后大鼠血糖顯著性降低，血Ca顯著性升高，同時(shí)血PTH水平降低，且聯(lián)合干預(yù)后大鼠后效果更好。近年研究[23]證實(shí)，高糖抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化，導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能下降，Orifuji等發(fā)現(xiàn)3w的有氧運(yùn)動(dòng)可降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的水平，與本研究的結(jié)果相一致。

綜上所述，糖尿病持續(xù)高血糖使血Ca下降，PTH反饋性升高和清除自由基能力減弱，引起B(yǎng)MD下降，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生；有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合褪黑素共同干預(yù)可以明顯改善糖代謝的同時(shí)還可以提高抗氧化應(yīng)激能力，降低高糖氧化應(yīng)激對(duì)骨骼代謝的影響，有效控制體重和BMD下降，緩解骨質(zhì)疏松，可以為臨床上糖尿病引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的非藥物治療新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。