高血脂骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

龔忠勤 潘明珠 盧虹玉 崔燎 劉義

1. 廣東醫(yī)學(xué)院廣東天然藥物研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023 2. 廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023 3. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增大的全身性代謝性骨骼疾病[1]。研究表明，高血脂是引起OP的一個(gè)危險(xiǎn)因子，在OP的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色[2]。目前建立高血脂性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型采用脂肪乳劑灌胃[3]，但由于脂肪乳劑的制備比較復(fù)雜，探究操作簡(jiǎn)單的高血脂性骨質(zhì)疏松模型建立方法意義重大。

P407由約70%乙烯氧化物和30%丙烯氧化物組成，是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三嵌段共聚物。因具有特殊的方向熱凝膠性質(zhì)，小劑量P407原位凝膠多被用于溫敏型藥物載體，具有毒性低，刺激性小，生物相容性好等特點(diǎn)[4,5]。近年來(lái)，高劑量P407腹腔注射已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高血脂模型的建立[6,7]。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射P407建立大鼠HLP模型，評(píng)價(jià)其骨密度，骨生物力學(xué)及骨微結(jié)構(gòu)的變化，探討HLP與OP之間的關(guān)系，為進(jìn)一步建立穩(wěn)定的高血脂骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

注射用P407生產(chǎn)于浙江八達(dá)通精細(xì)化學(xué)品有限公司(批號(hào)：130507)；低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。其他試劑為分析純。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

3月齡雌性SD大鼠20只，體重為200±20 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫條件下標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲用自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處置符合科技部《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。20只大鼠隨機(jī)分成2組，分別是對(duì)照組和高血脂組，每組10只，每周一稱重。

1.3 給藥方法

分組適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，對(duì)照組每隔3 d腹腔注射生理鹽水(1 mL/10 g)，高血脂組每隔3天腹腔注射P407(392 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行12 w心臟取血處死大鼠，收集血清和雙側(cè)股骨及第五腰椎(-80℃保存?zhèn)溆?及脛骨(70%乙醇保存?zhèn)溆?。

1.4 血清中血脂水平檢測(cè)

檢測(cè)方法按照南京建成LDL，TG，TC試劑盒提供的說(shuō)明書操作。樣品準(zhǔn)備好后采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Biotec，USA)測(cè)定，并按說(shuō)明書提供的計(jì)算方法得出血清中血脂水平。

1.5 骨密度、骨生物力學(xué)檢測(cè)

把左側(cè)股骨及腰椎粘附的肌肉剃干凈后，獨(dú)立分裝在灌有生理鹽水、無(wú)水乙醇比例為1∶1混合溶液的EP管中，送往上海生物力學(xué)研究所檢測(cè)。其中股骨和腰椎均進(jìn)行骨密度(BMD)，股骨進(jìn)行骨生物力學(xué)檢測(cè)，包括彈性載荷(EL)，最大載荷(ML)，斷裂載荷(BL)，骨剛度系數(shù)(BRC)。

1.6 Micro-CT掃描

將大鼠股骨固定于掃描管中，沿骨長(zhǎng)軸方向利用Micro-CT(vivaCT40，SCANCO，瑞士)在電壓50 kVp，電流160 μA，分辨率為2048×2048下進(jìn)行掃描。掃描完畢后選取生長(zhǎng)板下1 mm×4 mm為松質(zhì)骨重建區(qū)域，重建閾值均為125。重建完畢后可得骨組織體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，結(jié)構(gòu)指數(shù)(SMI)，連接度(Conn.D)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)等反應(yīng)骨微結(jié)構(gòu)指數(shù)及圖片。

1.7 HE染色

樣本準(zhǔn)備遵循本課題組前期報(bào)道[8]。石蠟切片4 μm用于蘇木素-伊紅(HE)染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，再經(jīng)高濃度至低濃度酒精，最后入蒸餾水。將已入蒸餾水的切片放入蘇木素中染色數(shù)分鐘，隨后酸水及氨水中分色，數(shù)秒后用流水沖洗1 h。70%和90%酒精脫水10 min后用伊紅染色2～3 min。隨后脫水透明，樹膠封片后顯微鏡(E400，Nikon，Japan)下觀察拍照。

1.8 骨免疫組織化學(xué)

骨免疫組織化學(xué)染色按照本課題組前期報(bào)道[8]以及試劑說(shuō)明書操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重

結(jié)果如圖1所示，兩組間大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠體重變化圖Fig.1 The change of body weight of the rats

2.2 大鼠血清血脂指標(biāo)

HLP組血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平均明顯高于Cont組(P<0.01)(圖2)。結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期使用P407能使大鼠血脂紊亂，出現(xiàn)高血脂癥。

圖2 實(shí)驗(yàn)大鼠血清血脂濃度與對(duì)照組相比，** P<0.01 Fig.2 The serum concentrations of LDL, TG, and TC**P<0.01 vs Cont

2.3 股骨及腰椎骨密度

骨密度結(jié)果如圖3，經(jīng)P407處理后，HLP大鼠股骨骨密度相較于Cont組無(wú)明顯變化(P>0.05)。

圖3 實(shí)驗(yàn)大鼠股骨與腰椎骨密度 Fig.3 The BMD of the femur and the lumbar vertebrae

2.4 股骨骨生物力學(xué)指數(shù)

與Cont相比，HLP組大鼠BL和ML未見顯著性差異，但BRC與EL均明顯低于Cont組(P<0.05)(圖4)。結(jié)果說(shuō)明P407引起的HLP可降低大鼠股骨骨生物力學(xué)性能。

圖4 實(shí)驗(yàn)大鼠股骨骨生物力學(xué)指數(shù) 與對(duì)照組相比，**P<0.01 Fig.4 Bone biomechanical properties of the femur**P<0.01 vs Cont

2.5 Micro-CT掃描

在HLP組中，大鼠BV/TV，Conn.D，Tb.N，Tb.Th均明顯下降(P<0.05)，而SMI，Tb.Sp顯著上升(P<0.05)(圖5)。3D重建圖及各指數(shù)說(shuō)明注射P407后，大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退化。

2.6 脛骨HE染色

從圖6可以看出，HLP組中脛骨生長(zhǎng)板下方骨小梁少于Cont組。

2.7 免疫組織化學(xué)染色

HLP組與Cont組相比，BMP2平均光密度值顯著下降，而PPARγ升高明顯(P<0.01)，結(jié)果見圖7。P407可降低BMP2的表達(dá)，而使PPARγ表達(dá)量上升。

3 討論

HLP是由于脂肪代謝異常使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常，可表現(xiàn)為高膽固醇血癥，高三酰甘油血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。P407可以增加血液中膽固醇以及甘油三酯的濃度，引起動(dòng)物血脂紊亂，其作用機(jī)制可能是P407可阻斷脂肪酶和肝素可釋放脂蛋白脂酶，減少膽固醇向外周組織轉(zhuǎn)移，抑制甘油三酯水解，增加內(nèi)生膽固醇的合成，從而導(dǎo)致高血脂癥[9,10]。本實(shí)驗(yàn)表明，P407腹腔注射可增加大鼠血清脂質(zhì)(TC，TG，LDL)濃度，證實(shí)P407能引起大鼠血脂紊亂從而造成高血脂癥。

圖5 實(shí)驗(yàn)大鼠骨微結(jié)構(gòu)3D重建及相關(guān)指數(shù)與對(duì)照組相比，* P<0.05,** P<0.01Fig.5 3D reconstruction and the trabecular microarchitecture of the femur*P<0.05,**P<0.01 vs Cont.

圖6 脛骨生長(zhǎng)板下骨小梁(HE染色，×100)Fig.6 Trabecular bone in epiphysis of the tibia (HE staining, ×100)

圖7 免疫組織化學(xué)陽(yáng)性染色及平均光密度值與對(duì)照組相比，** P<0.01Fig.7 The positive staining images of BMP2 and PPARγ and quantitative results of immunohistochemistry staining**P<0.01 vs Cont

骨密度是反應(yīng)骨量丟失及骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要指標(biāo)，主要通過雙能X線吸收測(cè)定法(dual energy X-ray absorptiometery, DXA)。由Fig.3 可知，HLP組大鼠股骨及腰椎骨密度并未出現(xiàn)顯著的變化，可能的原因是：DXA會(huì)將骨組織、骨髓、脂肪和骨外肌肉均看作礦物質(zhì)，可能引起骨密度測(cè)定出現(xiàn)不準(zhǔn)確[11]；實(shí)驗(yàn)周期不夠長(zhǎng)，注射P407的頻率不夠高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常組，股骨骨密度出現(xiàn)輕微下降，我們?cè)O(shè)想，假如延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期，股骨骨密度的變化有可能出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

研究表明，部分患者骨密度差異不明顯，骨折風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增大，如糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松，其骨生物力學(xué)和骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的下降[12]。骨生物力學(xué)是以工程力學(xué)為基礎(chǔ)，研究骨組織在外界作用下的力學(xué)特性和骨組織在受力后的生物學(xué)效應(yīng)，是對(duì)骨質(zhì)量進(jìn)行評(píng)定的一種可靠手段[13]。最大載荷表示骨斷裂前所承受的最大載荷，其值越大說(shuō)明骨試件能承受的外力沖擊越大；彈性載荷說(shuō)明骨在彈性范圍所能承受的最大載荷；斷裂載荷表示骨斷裂或者碎裂所能承受的載荷值；剛度又稱外在硬度，反應(yīng)抗變形的能力。Micro-CT可準(zhǔn)確、科學(xué)、全面反應(yīng)骨組織微觀結(jié)構(gòu)。SMI是用于評(píng)價(jià)骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，理想板狀結(jié)構(gòu)為0，理想桿狀結(jié)構(gòu)為3，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI數(shù)值增加[14]。由Fig.4 和5可知，高血脂組中，彈性載荷和剛度下降， BV/TV，Conn.D，Tb.N，Tb.Th均明顯下降，而SMI，Tb.Sp顯著上升。3D重建圖可以看出，HLP組骨微結(jié)構(gòu)退化。結(jié)果表明，高血脂可降低大鼠骨生物力學(xué)性能，惡化骨微觀結(jié)構(gòu)，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道低密度脂蛋白水平升高會(huì)增加椎骨骨折的風(fēng)險(xiǎn)[15]一致。這可能HLP可抑制骨形成[2]，促進(jìn)骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟，增加骨吸收[16]有關(guān)。

免疫組化結(jié)果顯示HLP組BMP2表達(dá)少于Cont組；BMP2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族成員，可介導(dǎo)骨形成，BMP2表達(dá)下降可使骨形成降低[17]。同時(shí)結(jié)果也顯示腹腔注射P407能增加PPARγ的表達(dá)。PPARγ大量表達(dá)于白色和棕色脂肪組織中，可調(diào)控脂肪分化特異基因，是脂肪形成的關(guān)鍵調(diào)控因子[18]。高表達(dá)PPARγ可降低人或動(dòng)物的骨量[19]。HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了P407引起的HLP可減少骨小梁數(shù)目，降低骨量。

本研究發(fā)現(xiàn)P407腹腔注射不僅能導(dǎo)致大鼠HLP，還能明顯的降低大鼠的骨生物力學(xué)性能，使骨微結(jié)構(gòu)退化，降低BMP2的表達(dá)，使骨形成下降。該動(dòng)物模型能為尋找預(yù)防高血脂骨質(zhì)疏松癥藥物提供研究平臺(tái)。