過壇龍?zhí)崛∥飳毙愿螕p傷模型小鼠的保護(hù)作用研究

李承樂 羊 波 王小軍

·論著·

過壇龍?zhí)崛∥飳毙愿螕p傷模型小鼠的保護(hù)作用研究

李承樂 羊 波 王小軍

目的探討過壇龍?zhí)崛∥飳λ穆然迹–Cl4）致急性肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用。方法腹腔注射四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，將50只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、過壇龍低、高劑量組、聯(lián)苯雙酯組陽性對照，每組10只。測定小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肝組織丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，一氧化氮合酶（NOS）活性，光鏡觀察肝臟病理學(xué)改變。結(jié)果過壇龍低、高劑量組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）等較模型組均有顯著降低[ALT：（365.4±123.5）U/L、（275.1±21.9）U/L比（443.2±227.3）U/L，P＜0.05或P＜0.01；AST：（232.4±54.1）U/L、（195.9±11.8）U/L比（297.9±132.1）U/L，P＜0.05或P＜0.01；MDA：（0.416±0.024）nmol/mL、（0.415±0.052）nmol/mL比（0.426±0.042）nmol/mL，P＜0.05；NOS：（0.154±0.013）U/mg、（0.122±0.012）U/mg比（0.187±0.013）U/mg，P＜0.05或P＜0.01]。病理學(xué)檢查顯示，過壇龍?zhí)崛∥锔鲃┝拷M較模型組肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死程度減輕，其中高劑量組改善更顯著。結(jié)論過壇龍?zhí)崛∥飳毙愿螕p傷小鼠具有保護(hù)作用。

小鼠；過壇龍；四氯化碳；急性肝損傷

過壇龍，又名烏腳槍，為鐵線蕨科植物扇葉鐵線蕨Adiantum flabellulatum L的全草或根莖，為浙江省民間常用草藥。該草性寒，味微苦澀，具有清熱解毒，平肝利濕的功效[1]，民間常用于治療急性傳染性肝炎、新生兒黃疸、肺熱咳嗽、小兒高熱抽搐等癥[2]。實(shí)驗(yàn)研究表明，鐵線蕨總醇提物對福爾馬林和巴豆油誘導(dǎo)的水腫有良好的抗炎活性[3]，鐵線蕨甲醇提取物能清除自由基，有效抑制脂質(zhì)過氧化作用和提高谷胱甘肽含量[4]。脂質(zhì)過氧化（lipid peroxdation，LPO）的主要產(chǎn)物丙二醛（malonaldehyde，MDA）可嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹壞死，是肝損傷的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)擬通過現(xiàn)代藥理學(xué)手段開展過壇龍治療藥物性肝損傷的藥效學(xué)研究，為中醫(yī)藥防治藥物性肝損傷的研究、臨床用藥及進(jìn)一步開發(fā)新藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物成年健康ICR小鼠50只雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)室溫度22～23℃，環(huán)境濕度50%，自由攝食及飲水。

1.2 藥品和試劑過壇龍購自安徽亳州，由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定為過壇龍干燥全草；蒸餾水提取3次,減壓濃縮,合并濃縮液為高劑量濃度12.0g/kg，蒸餾水稀釋12倍得低劑量濃度1.0g/kg，4℃保存?zhèn)溆茫籆Cl4：（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號140803）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號20150522），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號20150523），丙二醛（MDA，批號20141021）試劑盒，一氧化氮（NO，批號20150428），一氧化氮合酶（NOS，批號20150321），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器Tissue LyserⅡ-Qiegn型勻漿機(jī)（RETSCH公司）；Sigma3K15離心機(jī)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；SpectramaxM2型酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥成年健康ICR小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，將小鼠隨機(jī)分為五組，即空白對照組、CCl4模型對照組、過壇龍?zhí)崛∥锏?、高劑量組和聯(lián)苯雙酯陽性對照組，每組10只。每天上午灌胃給藥，連續(xù)給藥7天，其中陰性對照組和模型對照組給予超純水，陽性對照組給予聯(lián)苯雙酯混懸液（0.15g/kg），供試品各劑量組給予相應(yīng)濃度的過壇龍?zhí)崛∥铮ǖ蛣┝?.0g/kg、高劑量12.0g/kg）。藥物給足9天后，除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.4% CCl4（10mL/kg）進(jìn)行造模。造模16h后，稱重取血，解剖小鼠，取肝臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)，左葉固定，右葉凍存。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 血清生化指標(biāo)檢測將小鼠血于室溫靜置20～60min后離心取血清，檢測血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）。

2.2.2 肝臟病理學(xué)檢測及肝臟系數(shù)測定將肝臟用4℃生理鹽水洗凈，濾紙擦干，肝臟稱重后并按肝臟重量：100g體質(zhì)量進(jìn)行肝臟系數(shù)的計(jì)算。肉眼觀察肝臟外形形態(tài)，取右小葉，10%甲醛固定，常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2.2.3 肝勻漿生化指標(biāo)檢測將凍存的肝組織，在4℃生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱取0.1g，加0.9mL生理鹽水制成10%肝組織勻漿，離心，取上清液，按試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明測定一氧化氮合酶（NOS）活性，丙二醛（MDA）和一氧化碳（NO）的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD進(jìn)行組間的兩兩比較，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 五組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化正常組小鼠肝臟形態(tài)正常，外觀紅褐色，分頁清楚，被膜光滑無出血點(diǎn)，質(zhì)地柔軟并有彈性。模型對照組小鼠肝臟體積略有腫大，小葉受損嚴(yán)重，質(zhì)地偏硬，顏色晦暗，表面有彌散性出血點(diǎn)并有花斑樣病變，各給藥組小鼠肝臟受損程度輕于模型對照組。與空白對照組相比，模型對照組的肝臟系數(shù)偏大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。過壇龍各組小鼠肝臟系數(shù)略大于空白對照組，但明顯小于模型對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠肝臟系數(shù)比較（g，x±s）

3.2 五組小鼠肝組織病理切片顯微鏡觀察空白對照組（插頁圖1-A）小鼠肝組織以中央靜脈為中心向四周放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，大小均勻，細(xì)胞核大而圓，無細(xì)胞腫脹及壞死；模型對照組（插頁圖1-B）中央靜脈和匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞大量變性壞死，較大范圍的肝細(xì)胞腫脹和細(xì)胞脂肪變性，并有炎性細(xì)胞浸潤；陽性對照組（插頁圖1-E）中央靜脈周圍灶狀肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性減輕肝細(xì)胞水腫減輕，壞死灶減少；過壇龍低（插頁圖1-C）、高（插頁圖1-D）劑量組與模型組比較，肝細(xì)胞壞死數(shù)量減少，以細(xì)胞腫脹和細(xì)胞脂肪變性為主，炎性細(xì)胞浸潤程度也顯著減輕。高劑量組與低劑量組相比，效果更顯著。

3.3 五組小鼠血清生化指標(biāo)比較與空白對照組相比，模型對照組小鼠血清ALT、AST顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組小鼠血清中ALT和AST活性明顯降低（P＜0.01）。過壇龍低、高劑量組小鼠血清ALT和AST活性也降低（P＜0.05，P＜0.01），其中，高劑量組小鼠AST低于聯(lián)苯雙酯組（P＜0.05）。見表2。

表2 血清生化指標(biāo)（U/L，x±s）

3.4 五組小鼠肝組織勻漿生化指標(biāo)比較模型對照組小鼠肝組織勻漿MDA、NO、NOS均高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01），與模型對照組比較，過壇龍?zhí)崛∥锏?、高劑量組、聯(lián)苯雙酯組MDA、NO、NOS明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其中過壇龍?zhí)崛∥锔邉┝拷MNOS明顯低于聯(lián)苯雙脂組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肝勻漿MDA、NO、NOS含量比較（x±s）

4 討論

肝細(xì)胞在肝損傷時通透性增加，ALT和AST被釋放入血，故ALT和AST水平高低可以反應(yīng)肝細(xì)胞的損傷程度和藥物治療肝損傷的效果[5-6]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性并引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死。因此，MDA含量可以反應(yīng)脂質(zhì)過氧化程度，間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度[7-8]。經(jīng)CCl4處理后，模型組小鼠血清ALT和AST，肝勻漿MDA含量明顯升高，肝臟指數(shù)也顯著增大，肝勻漿MDA含量也升高，表明模型建立成功。過壇龍?zhí)崛∥锏?、高劑量組與模型組相比，ALT和AST顯著下降，MDA顯著下降并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，提示過壇龍?zhí)崛∥锟赡芡ㄟ^提高抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，起到對肝臟的保護(hù)作用。

NO是脂溶性氣體物質(zhì)，體內(nèi)的NO由一氧化氮合成酶（NOS）以L-精氨酸為底物合成，NO在肝臟疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。研究顯示，肝損傷模型中，NOS合成增加，釋放大量NO。NO可與過氧化物結(jié)合生成過氧亞硝酸鹽化合物，是氧化損傷的重要自由基之一，也是組織損傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強(qiáng)因子[9]。與空白對照組相比，CCl4模型組小鼠肝勻漿NO水平升高，NOS表達(dá)增強(qiáng)。與模型組比較，過壇龍低高劑量組NO含量有所降低，NOS表達(dá)明顯減弱（P＜0.05），提示在CCl4所致肝損傷模型中，NOS活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的內(nèi)源性NO，過壇龍實(shí)驗(yàn)組可以通過抑制NOS活性，降低NO的產(chǎn)生而達(dá)到對肝臟的保護(hù)作用。

綜上所述，過壇龍?zhí)崛∥锟擅黠@降低CCl4所致肝損傷模型小鼠血清ALT和AST活性，減少丙二醛（MDA）和NO含量，降低NOS活性。

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（收稿：2016-06-29修回：2016-08-05）

Protective Effect of the Extract from Flabelate M aidenhair Herb on Acute Hepatic Injury in M ice

LI Chengle,YANG Bo,WANG Xiaojun.Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the protective effects of flabelate maidenhair herb extract against acute liver injury induced by carbon tetrachloride（CCl4）in mice.M ethods The mouse model of acute liver injury was induced by intraperitoneal injection of CCl4.Fifty ICR mice were random ly divided into 5 groups（n=10）：normal control group,model group,bifendate pills group,and high-dose and low-dose flabelate maidenhair herb extract groups.Serum alanine aminotransferace（ATL）and aspartate aminotransferase（AST）were determined;malonaldehyde（MDA）,nitricoxide（NO）content and nitricoxide synthase（NOS）activity in liver tissue were measured.Pathological changes of liver tissue were observed under light microscope.Results ALT,AST,MDA,NO,and NOS in lowdose and high-dose flabelate maidenhair herb groups were lower than those in model group（ALT：365.4±123.5U/L and 275.1±21.9U/L vs 443.2±227.3U/L,P＜0.05 or P＜0.01;AST：232.4±54.1U/L and 195.9±11.8U/L vs 297.9±132.1 U/L,P＜0.05 or P＜0.01;MDA：0.416±0.024 nmol/mL and 0.415±0.052 nmol/mL vs 0.426±0.042nmol/mL,P＜0.05NOS：0.154±0.013U/mg and 0.122±0.012U/mg vs 0.187±0.013U/mg,P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological examination results showed milder liver cellular swelling,degeneration and necrosis in both flabelate maidenhair herb extract groups compared with those in model group;the pathological injury had been more obviously decreased in high-dose group.Conclusion The extract from flabelate maidenhair herb has a protective effect on acute liver injury induced by CCl4 in mice.

mice;flabelate maidenhair herb;carbon tetrachloride;acute hepatic injury

浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會科研項(xiàng)目（No.2014LYZD011）

浙江省立同德醫(yī)院藥劑科（杭州310012）

李承樂，Tel：（0571）89972234；E-mail：464992768@qq.com