南方紅豆杉水提物通過(guò)Ras/MAPK信號(hào)通路調(diào)控HER2陽(yáng)性胃癌移植瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究

戴飛飛 謝長(zhǎng)生

南方紅豆杉水提物通過(guò)Ras/MAPK信號(hào)通路調(diào)控HER2陽(yáng)性胃癌移植瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究

戴飛飛1謝長(zhǎng)生2

目的探討南方紅豆杉水提物通過(guò)抑制Ras/MAPK信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)蛋白表達(dá)，調(diào)控裸鼠HER2陽(yáng)性胃癌移植瘤生長(zhǎng)及其機(jī)制。方法建立荷瘤裸鼠模型，將80只BALB/c裸鼠接種人表皮生長(zhǎng)因子-2（HER2）陽(yáng)性胃癌NCI-N87細(xì)胞株，并隨機(jī)分組給藥及取瘤，采用Western Blot檢測(cè)HER2、KRAS蛋白表達(dá)，RT-PCR定量檢測(cè)HER2、KRAS mRNA表達(dá)水平。結(jié)果①Western blot檢測(cè)HER2、KRAS蛋白：與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)[HER2：（1.238±0.123、1.180±0.152、1.159±0.087、0.876±0.098、0.651±0.108、0.554±0.110）比（1.482±0.101），P＜0.05或P＜0.01；KRAS：（0.768±0.040、0.680±0.019、0.821±0.170、0.716±0.023、0.630±0.049、0.739± 0.044）比（1.015±0.033），P均＜0.05]；與赫賽汀組比較，中劑量聯(lián)合組KRAS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（0.630±0.049比0.759±0.029，P＜0.05）；②RT-PCR檢測(cè)HER2、KRAS mRNA表達(dá)：與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS mRNA表達(dá)不同程度下調(diào)[HER2 mRNA：（0.916±0.026、0.783±0.061、0.846± 0.021、0.741±0.079、0.660±0.079、0.673±0.045）比（1.000±0.193），P均＜0.05；KRAS mRNA：（0.643± 0.065、0.551±0.173、0.572±0.267、0.329±0.250、0.036±0.007、0.351±0.257）比（1.001±0.132），P＜0.05或P＜0.01]；與赫賽汀組比較，中劑量聯(lián)合組KRAS mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（0.036±0.007比0.362± 0.162，P＜0.01）。結(jié)論南方紅豆杉水提物可通過(guò)Ras/MAPK信號(hào)通路部分下調(diào)HER2、KRAS蛋白及其mRNA表達(dá)水平，聯(lián)合赫賽汀可增強(qiáng)其抑制作用。

裸鼠；胃癌；Ras/MAPK；南方紅豆杉；曲妥珠單抗；表皮生長(zhǎng)因子受體

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)通路錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗（trastuzumab，herceptin，TM）主要通過(guò)拮抗人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）信號(hào)傳達(dá)通路而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)或通過(guò)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡[1-3]。Ras/MAPK信號(hào)通路是HER2下游重要信號(hào)通路之一，其通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄及調(diào)控繼而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝等生物學(xué)行為，引起腫瘤的產(chǎn)生及惡變[4]。藥理研究顯示，紅豆杉中的40多種有效成分具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及血管增生、抗腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立荷瘤裸鼠模型，觀察不同劑量南方紅豆杉及曲妥珠單抗單藥或聯(lián)合給藥對(duì)Ras/MAPK信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)的作用，并從蛋白及mRNA表達(dá)水平探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c裸鼠80只，4～6周齡，體質(zhì)量18～20g。上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)生物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 試劑及儀器Hylcone胎牛血清（美國(guó)Thermo公司），RPMI-1640培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），HER2抗體、KRAS抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠、抗兔二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），Marker（加拿大Fermentes公司）。蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），定量PCR儀器（美國(guó)ABI公司），Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 藥物及其制備南方紅豆杉（規(guī)格8g/包，由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)100513）。南方紅豆杉水提物的制備[6]：8g南方紅豆杉浸泡過(guò)夜，加7倍水煮沸20min后倒出藥液，再加5倍水煮20min，再將兩次藥液混勻經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸發(fā)濃縮至208mg/mL，靜置過(guò)夜后用過(guò)濾網(wǎng)清除藥渣，將剩余藥液作為高劑量母液，再按1：2和1：4體積純水稀釋出中劑量提取液104mg（生藥量）/mL，低劑量提取液52mg（生藥量）/mL，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。曲妥珠單抗（商品名：赫賽汀，Herceptin，規(guī)格440mg/瓶，上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)N3586），赫賽汀溶液配制：用20mL滅菌注射用水配制成無(wú)色至淡黃色透明液體作為母液，濃度21mg/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株NCI-N87，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立及分組給藥第1天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌NCI-N87細(xì)胞株接種于每只裸鼠右側(cè)腋窩下，待第7天觀察瘤體情況并將80只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為空白組、紅豆杉高劑量組、紅豆杉中劑量組、紅豆杉低劑量組、Herceptin聯(lián)合紅豆杉（高、中、低）劑量組，赫賽汀（Herceptin）單藥組，共8組，每組10只。同時(shí)開(kāi)始給藥灌胃，每次3mL中藥濃縮液，空白組給予與南方紅豆杉同等體積的生理鹽水灌胃，共給藥3周。接種后第28天取瘤用于瘤組織蛋白提取檢測(cè)蛋白表達(dá)及免疫組化檢測(cè)。

2.2 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)取適量瘤組織加入RIPA裂解液（含PMSF），進(jìn)行勻漿再置于冰上，并重復(fù)3次。裂解30min后進(jìn)行4℃下12 000r/min離心5min。取上清液放入-20℃水箱保存；用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，計(jì)算待測(cè)蛋白樣品濃度；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；最后用quantity one軟件測(cè)定各條帶的灰度值（A），各組的A值與相應(yīng)的β-actin的A值的比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)取出適量保存在液氮中的移植瘤組織約50mg放入2mLEP管中進(jìn)行組織總RNA提取和純化（RNeasy Mini Kit），再吸取1μL抽提的RNA在Nan odropl000上進(jìn)行RNA濃度測(cè)定，若OD260/ OD280為1.8～2.0，表明RNA樣品可以使用。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外光觀察28s、18s、5s三條條帶，以確定RNA的完整性。然后RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物合成主要由上海生工設(shè)計(jì)）。見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR各對(duì)應(yīng)引物序列

按照Power SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中各基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系：10μmol/ L primer（上下游）0.5μL，SYBR 2.5μL，滅菌雙蒸水1μL，cDNA 1μL；擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃、5min預(yù)變性，94℃、1min，退火1min，72℃、1min延伸，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)后，72℃8min終末延伸。用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，計(jì)量資料的多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Western Blot檢測(cè)各組瘤組織HER2、KRAS蛋白表達(dá)用quantity one軟件分析并與βactin灰度值比值顯示結(jié)果，與空白組比較，各給藥組HER2、KRAS蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與赫賽汀組比較，各給藥組的HER2蛋白表達(dá)不同程度上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；中劑量紅豆杉組及聯(lián)合組KRAS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組小鼠瘤組織HER2、KRAS蛋白表達(dá)量比較（x±s）

圖1 各組小鼠瘤組織HER 2、KRAS蛋白表達(dá)

3.2 RT-PCR檢測(cè)各組瘤組織HER2、KRAS mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組比較，各給藥組HER2、KRAS mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與赫賽汀組比，各給藥組可不同程度上調(diào)HER2 mRNA表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），中劑量聯(lián)合組顯著下調(diào)KRAS mRNA表達(dá)（P＜0.01）。見(jiàn)表3，圖2～3。

4 討論

南方紅豆杉Taxus chinensis var.Mairei為紅豆杉屬的常綠針葉植物，其又被稱(chēng)作“紫杉”。藥理研究[7]顯示，紅豆杉提取物可促進(jìn)白介素1、2，腫瘤壞死因子，干擾素等細(xì)胞因子的合成；激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)抗體和補(bǔ)體而明顯提高免疫功能。

實(shí)驗(yàn)研究[8]發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗對(duì)HER2高表達(dá)的NCI-N87胃癌細(xì)胞具有抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用并且可顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性。HER2是具有受體酪氨酸激酶（RTK）活性的原癌基因，是細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、組織分化的重要介質(zhì)[9]。膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)（Ras/ MAPK）途徑是廣泛存在于細(xì)胞中的一條關(guān)鍵性調(diào)控細(xì)胞生存與凋亡的傳導(dǎo)通路。其主要作用機(jī)制：在細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)下，HER2/neu與其他EGF受體形成二聚體，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），使其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，最終影響核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[10]。KRAS是Ras家族成員之一，研究表明，胃癌組織KRAS蛋白表達(dá)率高于癌旁組織，且與腫瘤組織的浸潤(rùn)、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示KRAS蛋白過(guò)表達(dá)在胃癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與空白對(duì)照組比較，各用藥組HER2蛋白表達(dá)下調(diào)，提示紅豆杉水提物及赫賽汀通過(guò)降低HER2蛋白在胃癌細(xì)胞表面的表達(dá)，繼而抑制HER2蛋白與其他受體酪氨酸激酶形成異源二聚體，干擾自身磷酸化從而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的持續(xù)激活。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與空白組比較，各給藥組KRAS表達(dá)可不同程度下調(diào)，顯示南方紅豆杉水提物及曲妥珠單抗通過(guò)使Sos無(wú)法激活Ras功能性活化蛋白表皮生長(zhǎng)因子受體HER2的活性，從而抑制KRAS活化，繼而無(wú)法激活其下游相關(guān)效應(yīng)因子來(lái)阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)通路最終抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉水提物作用于人HER2陽(yáng)性人NCI-N87胃癌細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤后，總體上HER2、KRAS蛋白表達(dá)較空白組可有不同程度下調(diào)。表明經(jīng)南方紅豆杉水提物干預(yù)，可下調(diào)HER2、KRAS蛋白（EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK）傳導(dǎo)通路上的表達(dá)，使信號(hào)通路受阻而抑制HER2陽(yáng)性人NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中Western blot與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致，但兩種檢測(cè)方法顯示南方紅豆杉水提物作用于HER2、KRAS蛋白的最有效濃度存在一定的差異性，這可能與不同劑量藥物對(duì)Ras/MAPK信號(hào)通路上不同位點(diǎn)調(diào)控的程度不同相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南方紅豆杉水提物可部分下調(diào)HER2、KRAS蛋白及其mRNA及表達(dá)水平，聯(lián)合赫賽汀可增強(qiáng)其抑制作用。

表3 各組小鼠瘤組織HER2、KRAS蛋白表達(dá)量比較（x±s）

圖2 HER 2范圍擴(kuò)增溶解曲線

圖3 HRAS范圍擴(kuò)增溶解曲線

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（收稿：2016-07-13修回：2016-08-05）

Taxus Chinensis Water Extract Inhibited the Growth of HER2-positive Gastric Cancer through Regulating Ras/MAPK Signaling Pathway

DAI Feifei1,XIE Changsheng2.1 ICU,Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of taxus chinensis water extract on human epidermal growth receptor 2（HER2）-positive gastric cancer via regulating Ras/MAPK pathway related proteins.M ethods Nude mouse model bearing HER2-positive gastric cancer was established by inoculating NCI-N87 tumor strain.Eighty BALB/c mice were randomized into high-,middle-,low-dose taxus chinensis groups,high-,middle-,low-dose taxus chinensis+herceptin groups,and herceptin group and given the corresponding drugs.Mice were killed by cervical dislocation to obtain tumor tissue for inspection.The protein expression of HER2 and KRAS were detected with Western Blot and mRNA contents of the genes were determined by RT-PCR assay.Results Compared with blank group,the expression of HER2 and KRAS proteins were decreased in all drug groups（HER2：1.238±0.123,1.180± 0.152,1.159±0.087,0.876±0.098,0.651±0.108,0.554±0.110 vs 1.482±0.101,P＜0.05 or P＜0.01;KRAS：0.768± 0.040,0.680±0.019,0.821±0.170,0.716±0.023,0.630±0.049,0.739±0.044 vs 1.015±0.033,all P＜0.05）.Compared with that in herceptin group,KRAS protein in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.630±0.049 vs 0.759±0.029,P＜0.05）.Compared with blank group,the expression of HER2 and KRASmRNA were decreased in all drug groups（HER2 mRNA：0.916±0.026,0.783±0.061,0.846±0.021,0.741±0.079, 0.660±0.079,0.673±0.045 vs 1.000±0.193,all P＜0.05；KRAS mRNA：0.643±0.065,0.551±0.173,0.572±0.267, 0.329±0.250,0.036±0.007,0.351±0.257 vs 1.001±0.132,P＜0.05or P＜0.01）.Compared with that in herceptin group, KRAS mRNA in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.036±0.007 vs 0.362± 0.162,P＜0.01）.Conclusion Taxus chinensis water extract can down regulate the expression of HER2,KRAS protein and mRNA via Ras/MAPK pathway in mice with gastric cancer.When it is combined with herceptin,its anti-tumor effect is enhanced.

nude mice;gastric cancer;Ras/MAPK;Taxus chinensis water extract;trastuzumab;epidermal growth receptor

浙江省自然科學(xué)基金（No.LY13H290013）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013ZA043）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU（杭州310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科（杭州310006）

謝長(zhǎng)生，Tel：0571-87071083