發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)

張穎，劉國(guó)新，胡翠翠，張健，*（.食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)

張穎1，劉國(guó)新2，胡翠翠2，張健2，*
（1.食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

發(fā)酵酒中尿素檢測(cè)方法主要包括比色法、酶法和色譜法，綜述了這3種方法的檢測(cè)原理，并闡述了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件，最后展望了尿素檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)

尿素；發(fā)酵酒；氨基甲酸乙酯；檢測(cè)

尿素又稱碳酰二胺、碳酰胺、脲，廣泛存在于發(fā)酵酒中。除原料引入和人為添加外，釀酒酵母的氮代謝亦是發(fā)酵酒中尿素的主要來源。大量研究發(fā)現(xiàn)，尿素和乙醇在自然條件下反應(yīng)可生成氨基甲酸乙酯（EC）［1-2］，而EC已經(jīng)被證實(shí)是一種潛在的人類致癌物質(zhì)。2002年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織將EC納入重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)；2007年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將EC認(rèn)定為“2A”類致癌物；很多國(guó)家已經(jīng)制定了氨基甲酸乙酯在不同發(fā)酵酒中的限量標(biāo)準(zhǔn)［3］。雖然EC的前體物質(zhì)很多，但尿素被認(rèn)為是EC的主要前體，尿素的含量可以反映發(fā)酵酒中潛在的EC含量。不僅如此，尿素還在酵母的氮代謝中扮演重要角色，并通過氮代謝物阻遏效應(yīng)影響酵母對(duì)其他氮素的吸收，從而影響發(fā)酵酒的品質(zhì)。因此準(zhǔn)確測(cè)定發(fā)酵酒中的尿素含量具有重要的意義。

1　發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)方法

尿素的檢測(cè)方法很多，每種方法都有自身的局限性和適用范圍，尚無通用的可檢測(cè)任何樣品中尿素含量的方法［4-6］。如在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，酶法測(cè)定尿素較為適宜，這是因?yàn)槊阜y(cè)定速度快、安全無毒；而在環(huán)境領(lǐng)域，非酶法更為常用，這是因?yàn)榄h(huán)境中可能會(huì)存在酶抑制劑，這會(huì)影響酶法測(cè)定的準(zhǔn)確性。發(fā)酵酒品種多樣、基質(zhì)復(fù)雜，尿素含量差別很大。如葡萄酒中的尿素含量通常在3 mg/L以下，而日本清酒中的尿素含量在5 mg/L～80 mg/L之間［7］。尿素在發(fā)酵酒釀造過程中處于不斷的動(dòng)態(tài)變化中，在不同的發(fā)酵階段其含量可能低至μg/L的水平。這些特點(diǎn)要求發(fā)酵酒的尿素測(cè)定方法要具備高靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。迄今為止，發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)方法主要分為3類：比色法、酶法和色譜法。本文將綜述這些方法，分析其優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件，并展望尿素檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)。

1.1比色法

尿素與顯色劑在一定條件下反應(yīng)生成帶有顏色的化合物，該化合物顏色深淺程度與樣品中尿素含量呈正比，因此可以通過測(cè)定特定波長(zhǎng)下反應(yīng)溶液的吸光值來確定樣品中的尿素含量。已報(bào)道的尿素顯色反應(yīng)很多，但測(cè)定尿素的只有兩大類，即基于二乙酰一肟的反應(yīng)和基于2-異亞硝基苯丙酮的反應(yīng)，每類反應(yīng)又有很多的改進(jìn)和修飾。

1939年，F(xiàn)earon研究發(fā)現(xiàn)尿素和二乙酰在酸性條件下反應(yīng)顯黃色，而不同的尿素氨基取代物能和二乙酰（圖1a）反應(yīng)生成紅色、暗紅色或紫紅色化合物，該反應(yīng)即為Fearon反應(yīng)［8］。二乙酰一肟和尿素的顯色反應(yīng)正是由Fearon反應(yīng)演化而來的，使用二乙酰一肟（圖1b）取代二乙酰作為反應(yīng)物克服了二乙酰穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，其基本反應(yīng)原理為，二乙酰一肟首先在酸性條件下解離為二乙酰和羥胺，然后二乙酰與尿素在酸性、加熱的條件下形成紅色衍生物，該反應(yīng)產(chǎn)物顏色深淺程度與樣品溶液中尿素含量呈正比。此后，眾多學(xué)者在提高該檢測(cè)方法的精密度和準(zhǔn)確性等方面做了大量工作［9］，如在反應(yīng)體系中加入氨基硫脲可有效鈍化紅色產(chǎn)物的光敏性，顯著提高該物質(zhì)的顏色穩(wěn)定性，增大線性范圍；加入Fe3+可除去反應(yīng)二乙酰一肟水解副產(chǎn)物羥胺，從而增強(qiáng)反應(yīng)顯色效果；加入安替比林或4-氨基安替比林可增大反應(yīng)的線性范圍。

圖1　光譜測(cè)量的試劑Fig.1　Spectrophotometric reagents

二乙酰一肟法是檢測(cè)游泳池水中尿素的國(guó)標(biāo)方法，也普遍應(yīng)用于測(cè)定環(huán)境樣品和發(fā)酵酒等樣品中的尿素。1970年，Douglas等［10］采用該法來測(cè)定土壤樣品中的尿素，2004年，Hasnip等［11］在研究時(shí)間和溫度對(duì)葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的影響時(shí)，采用該法在3年的時(shí)間跨度內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定了尿素含量。陳宜宜等［12］添加氨基硫脲和氯化鐵改進(jìn)該法，在酸性條件下成功檢測(cè)了黃酒中的尿素。梁新紅等［13］通過優(yōu)化反應(yīng)條件，顯著提高了該方法的精密度和準(zhǔn)確度，測(cè)定葡萄酒中的尿素含量，檢測(cè)限可達(dá)0.5 mg/L，能夠滿足葡萄酒樣品中尿素常規(guī)檢查的要求。

1989年，Ough等［14］建立了另一種比色法，即采用1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟（2-異亞硝基苯丙酮；圖1c）作為基礎(chǔ)試劑與尿素反應(yīng)，然后在540 nm下檢測(cè)吸光值。這種方法已被Ough和許多學(xué)者應(yīng)用于釀酒酵母的氨基酸代謝研究和葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的研究。1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟與二乙酰一肟相比，穩(wěn)定性更好，并且沒有難聞的氣味，但產(chǎn)生的有色產(chǎn)物對(duì)光更加敏感，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性比較差。Nagel［15］和Monteiro的報(bào)道中［16］，葡萄酒中尿素的檢測(cè)限均為1 mg/L，但也有報(bào)道采用該法測(cè)定尿素檢測(cè)限更低［17］。

綜上，比色法涉及的試劑較多，且有很多修飾和改進(jìn)，不同的反應(yīng)條件導(dǎo)致產(chǎn)物顏色不盡相同，從而影響到了檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇以及檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。只有通過系統(tǒng)性研究，明晰各種比色法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用條件，才能充分發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢(shì)，才能規(guī)范針對(duì)發(fā)酵酒中尿素檢測(cè)的比色法。

1.2酶法

脲酶（EC3.5.1.5）又稱尿素酰胺水解酶，相對(duì)分子質(zhì)量為120 000 Da～130 000 Da，廣泛存在于豆類植物籽實(shí)和細(xì)菌中，能特異性水解尿素形成氨氣和二氧化碳。大多數(shù)脲酶的最適pH在中性或偏堿性范圍內(nèi)，但是源于腸道乳酸菌體內(nèi)的酸性脲酶最適pH在2～4之間。酸性脲酶非常適合在發(fā)酵酒環(huán)境中分解尿素，生成的氨氣或二氧化碳，通過測(cè)定生成的氨氣或二氧化碳含量，即可間接測(cè)定尿素含量。體系中的pH、乙醇、有機(jī)酸和氟化物的含量對(duì)酸性尿酶活力有一定的影響［18］，因此在測(cè)定尿素前需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使酸性脲酶能在最適條件下反應(yīng)。

現(xiàn)已開發(fā)出基于酶法中氨氣測(cè)定的尿素檢測(cè)試劑盒，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵酒中的尿素檢測(cè)［19-20］。其原理是利用酸性脲酶水解尿素生成氨氣和二氧化碳（反應(yīng)式1），氨氣與2-酮戊二酸和原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在谷氨酸脫氫酶（GLDH）作用下反應(yīng)生成谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和水（反應(yīng)式2）。在340 nm處檢測(cè)NADH的吸光值，根據(jù)NADH的減少量與氨的減少量成正比，即可測(cè)定樣品中的尿素含量。樣品的色澤和渾濁度對(duì)測(cè)定有一定的干擾，因此需用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）吸附樣品中的色素，并用0.45 μm濾膜過濾除雜。試劑盒可以測(cè)定25 μL～50 μL的微量樣品，通過增加樣品含量可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中微量尿素的定量。由于試劑盒內(nèi)NADH不穩(wěn)定，容易被氧化，會(huì)造成吸光度下降，因此在每次測(cè)量前需要重新進(jìn)行定標(biāo)。此方法對(duì)尿素標(biāo)品的檢測(cè)限通常為0.15mg/L，但對(duì)于實(shí)際樣品中的尿素，檢測(cè)限僅為1 mg/L［21］。

Satoh等［22］將脲酶固定化，通過溫度控制的氣體擴(kuò)散單元將直接氨氣導(dǎo)入溴百里酚藍(lán)溶液，在596 nm下測(cè)量百里酚藍(lán)溶液的吸光值來確定尿素的含量，開發(fā)了流動(dòng)注射-分光光度法提高了尿素測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度和自動(dòng)化程度。Ilda等［23］開發(fā)了類似的方法來檢測(cè)清酒中尿素的含量。因?yàn)榍寰浦械钠渌陌鳖愇镔|(zhì)含量很高，可達(dá)尿素含量的6倍～10倍，所以該方法采用了離子交換法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。只要樣品中的乙醇濃度低于5%，尿素檢測(cè)就不受影響，線性范圍在0.5 mg/L～60 mg/L。Ilda課題組［24］還用該法測(cè)定了黃酒中的尿素含量，并且與前述的試劑盒法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果無顯著差別。

基于酶法中二氧化碳的測(cè)定亦可檢測(cè)尿素［25-26］。將樣品流動(dòng)注射到載有酸性脲酶的固體柱里，通過氣體擴(kuò)散裝置分離的二氧化碳，透過膜擴(kuò)散到溴百里酚藍(lán)溶液中，通過測(cè)定溶液在617 nm處的吸光度來檢測(cè)二氧化碳的含量，進(jìn)而得出尿素的濃度。該法無需去除樣品中的其他氨類物質(zhì)，但尿素水解所產(chǎn)生的二氧化碳含量?jī)H是氨氣含量的一半（反應(yīng)式1），并且有潛在空氣污染的危險(xiǎn)。Iida等［27］采用了標(biāo)準(zhǔn)添加技術(shù)，大大地提高了該法檢測(cè)尿素的靈敏度。

1.3色譜分離法

過去，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定發(fā)酵酒中尿素的報(bào)道不多，這是因?yàn)樗玫臋z測(cè)器多為紫外檢測(cè)器（UV），而尿素的最大吸收波長(zhǎng)在203 nm，在此波長(zhǎng)下，很多物質(zhì)都有吸收，從而造成尿素的檢測(cè)靈敏度不夠，檢測(cè)限很高。1990年，F(xiàn)ujinawa等［28］開發(fā)了離子對(duì)色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定葡萄酒中的尿素，其原理是利用固定化脲酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨與OPA衍生化后生成產(chǎn)熒光化合物，經(jīng)離子對(duì)色譜分離后可用熒光檢測(cè)器（FLD）檢測(cè)。該方法靈敏度高，但樣品前處理繁瑣，需經(jīng)過過濾、脫醇、離子交換、C18預(yù)柱除雜等步驟。1995年，Kodama等［29］優(yōu)化了該方法，顯著地減少了分析時(shí)間，降低了尿素的檢出限。同年，Matsudo等［30］在酸性條件下，將尿素與二乙酰一肟、安替比林和氯化鐵在120℃下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)凝膠柱分離后，在波長(zhǎng)466 nm處進(jìn)行檢測(cè)，間接測(cè)定了尿素含量。此方法借鑒了二乙酰一肟與尿素的反應(yīng)原理，樣品制備相對(duì)比較簡(jiǎn)單，但該法靈敏度太低，且其他氨?；衔飼?huì)對(duì)結(jié)果造成嚴(yán)重干擾。

近年來，有研究者開發(fā)了新的HPLC-FLD方法來檢測(cè)發(fā)酵酒中的尿素含量［31-32］。其原理為酸性條件下，9-羥基噸與尿素反應(yīng)可生成噸基脲（如圖2），噸基脲受特定波長(zhǎng)激發(fā)光照射后，可發(fā)射出特定波長(zhǎng)的發(fā)射光，通過測(cè)定衍生物的發(fā)射光強(qiáng)度即可對(duì)樣品中的尿素進(jìn)行定量。事實(shí)上，9-羥基噸可與很多氨酰化合物發(fā)生反應(yīng)，而很多反應(yīng)產(chǎn)物都可發(fā)出熒光。根據(jù)此原理，本課題組［33］在近期開發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的方法，在發(fā)酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的檢測(cè)中得到了很好的應(yīng)用。

1.4其他方法

除了以上方法外，楊珩等［34］還開發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速的試紙條定性、半定量的尿素測(cè)定方法，此法操作簡(jiǎn)單，但只能對(duì)尿素進(jìn)行定性，不能應(yīng)用于實(shí)際測(cè)量。近年來，也有用近紅外光譜法［35］和質(zhì)譜法［36］來分析尿素含量的報(bào)道，這兩種方法最顯著的優(yōu)勢(shì)是分析操作簡(jiǎn)單、快速，但設(shè)備價(jià)格昂貴，在很多工廠和實(shí)驗(yàn)室不能實(shí)現(xiàn)。

圖2反應(yīng)示意圖Fig.2　The schematic diagram of the derivative reaction

2　發(fā)酵酒中尿素檢測(cè)的發(fā)展方向

綜上所述，發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)方法很多，但每種方法都有各自的缺點(diǎn)，比如分光光度法顯色試劑的不穩(wěn)定性，反應(yīng)中有其他成分的干擾；酶催化水解法中，樣品制備繁瑣，樣品中其他氨類物質(zhì)和大氣中的CO2同樣會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果；色譜分離法對(duì)設(shè)備要求高等等。因此對(duì)以上方法有針對(duì)性地改進(jìn)是尿素檢測(cè)重要的發(fā)展方向，如：分光光度法可以結(jié)合順序標(biāo)準(zhǔn)注射分析，酶催化法時(shí)可以結(jié)合在線固相萃取流動(dòng)注射分析，色譜分離法分析設(shè)備的改進(jìn)等，也可以通過自動(dòng)化程序的協(xié)助來縮短分析時(shí)間［37-38］。在實(shí)際應(yīng)用中，需綜合考慮尿素不同檢測(cè)方法的特點(diǎn)及適用性，發(fā)揮不同方法的優(yōu)勢(shì)，滿足不同的分析要求。

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The Determination of Urea in Fermented Liquors

ZHANG Ying1，LIU Guo-xin2，HU Cui-cui2，ZHANG Jian2，*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

This article reviewed the principle of the colorimetry，enzyme and chromatography for urea detection in fermented liquors，and summarzed the advantages and disadvantages，as well as the applied conditions of these methods，in the end，proposed the tendency for urea detection.

urea；fermented liquors；ethyl carbamate；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.050

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31101275；31201354）

張穎（1978—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事食品安全方面的研究。
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2015-12-14