β-胡蘿卜素發(fā)酵及提取工藝的研究

梁穎超，金貞花，張廣昊，關(guān) 陽，韓文靜，王金枝，陶 進(jìn)*

(1.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033)

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β-胡蘿卜素發(fā)酵及提取工藝的研究

梁穎超1，2，金貞花1，2，張廣昊1，2，關(guān) 陽1，2，韓文靜1，2，王金枝1，2，陶 進(jìn)1，2*

(1.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033)

摘要[目的]研究三孢布拉氏霉菌β-胡蘿卜素發(fā)酵及其提取工藝的優(yōu)化。 [方法]利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵β-胡蘿卜素，并通過分析發(fā)酵時(shí)間、干燥方法、保藏方式等因素對(duì)β-胡蘿卜素含量的影響，確定β-胡蘿卜素的制取工藝。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，最適發(fā)酵時(shí)間為5 d，干燥方法為真空冷凍干燥機(jī)干燥法，保藏方法為下罐后較短時(shí)間內(nèi)提取。按此工藝條件得到的β-胡蘿卜素胞內(nèi)含量為5.80%，發(fā)酵液中β-胡蘿卜素含量可達(dá)到0.44 g/L。[結(jié)果] 研究可為發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素及其提取工藝研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞三孢布拉氏霉菌；β-胡蘿卜素；發(fā)酵；提取

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，是一種橘黃色脂溶性化合物，是國際上公認(rèn)的優(yōu)秀天然色素，具有很強(qiáng)的抗氧化劑且為人體不可缺少的營養(yǎng)素[1]。β-胡蘿卜素因其著色功能，廣泛應(yīng)用在食品和化妝品領(lǐng)域，加有β-胡蘿卜素的口紅、胭脂等化妝品色澤豐滿自然，食品中添加β-胡蘿卜素色澤金燦誘人。β-胡蘿卜素還具有較強(qiáng)的抗氧化性，其抗氧化性是維生素C的60倍、維生素E的10倍，可用于保護(hù)肌體免受氧自由基的毒害，具有抗癌、抗心血管病、抗白內(nèi)障、抗老年性癡呆癥等保健功能[2]。β-胡蘿卜素還是維生素A的前體，可作為藥品和功能性添加劑，用于維生素A缺乏癥、光敏癥、皮膚粗糙等癥狀[3]。

隨著對(duì)β-胡蘿卜素需求量的增加[4]，越來越多的人研究其制取工藝[5-6]。常用的β-胡蘿卜素制取技術(shù)主要有化學(xué)合成法、提取法、生物合成法(發(fā)酵法)等。化學(xué)合成法是通過化學(xué)反應(yīng)人工合成β-胡蘿卜素，產(chǎn)品為全反式結(jié)構(gòu)；提取法則是從胡蘿卜、枸杞、玉米等天然植物中直接提取β-胡蘿卜素，生產(chǎn)效率低；而生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素不受環(huán)境等條件的限制，產(chǎn)量高且屬于天然產(chǎn)品，天然β-胡蘿卜素產(chǎn)品的立體異構(gòu)比合成的全反式結(jié)構(gòu)在體內(nèi)更容易被吸收、生物活性更強(qiáng)，因此在醫(yī)藥、食品及保健領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。

利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵制得天然β-胡蘿卜素，因其成本較低、生產(chǎn)條件易實(shí)現(xiàn)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，被眾多企業(yè)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[7]。三孢布拉氏霉菌發(fā)酵法得到的β-胡蘿卜素是胞內(nèi)產(chǎn)物，因此要對(duì)發(fā)酵菌絲體進(jìn)行收集，破碎菌體細(xì)胞以得到胞內(nèi)產(chǎn)物。由于β-胡蘿卜素是脂溶性，不溶于水，因此水分的存在將會(huì)影響提取效果，在β-胡蘿卜素提取前要對(duì)菌絲體進(jìn)行干燥，除去菌絲體中的水分，再用非極性有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。然而，天然β-胡蘿卜素在干燥過程中極易被氧化，降低了其生物活性，限制了其在醫(yī)藥、食品及保健品領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，β-胡蘿卜素干燥過程中找到一種低氧化率的干燥方式是非常重要的[8]。筆者以三孢布拉氏霉菌發(fā)酵法制得的發(fā)酵液為原料，采用干燥箱干燥法和真空冷凍干燥機(jī)干燥法，分別得到含天然β-胡蘿卜素的干菌體，最后利用紫外-分光光度計(jì)法進(jìn)行β-胡蘿卜素含量檢測，確定最佳發(fā)酵時(shí)間、最適干燥方法和保藏方式對(duì)β-胡蘿卜素含量的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。β-胡蘿卜素發(fā)酵液，實(shí)驗(yàn)室自制，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵法制得。

1.1.2主要試劑。β-胡蘿卜素(標(biāo)準(zhǔn)品)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.3主要儀器與設(shè)備。全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160型)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(303A-5型)，上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)(MAXI-DRYLYO型)，法國Heto-holten；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)(DHG-9070型)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)(8823B型)，北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司；電子天平(AL204型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2方法1.2.1菌絲體預(yù)處理。將三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)“+”、“-”菌株分別接種到PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃溫度下培養(yǎng)72h。待菌株長出孢子后將菌落轉(zhuǎn)接三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃分別搖床培養(yǎng)72h得到發(fā)酵液，其中培養(yǎng)基組分包括：玉米粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂。將所得到的“+”菌發(fā)酵液取10%，接入“-”菌發(fā)酵液中，在28 ℃搖床培養(yǎng)4～6d。最終得到的發(fā)酵液采用濾網(wǎng)過濾，利用5L自來水洗滌，得到含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體。1.2.2β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，用分析純的石油醚稀釋定容至50mL，吸取定容后的溶液1.0mL用石油醚繼續(xù)稀釋定容至100mL，此稀釋液含β-胡蘿卜素10μg/mL；分別吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL含β-胡蘿卜素10μg/mL的稀釋液，用石油醚定容至25mL，此時(shí)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μg/mL；然后以石油醚為空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)測定450nm波長處每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1。

1.2.3β-胡蘿卜素含量的測定。收集發(fā)酵液中的菌體，經(jīng)干燥箱或真空冷凍干燥后得到干菌體；用研磨法粉碎細(xì)胞，然后過 60～80目篩；準(zhǔn)確稱取菌體粉末0.02g，菌體粉末放入燒杯，加入石油醚玻璃棒攪拌，萃取直至菌體粉末無色為止；用濾紙過濾萃取后的上清液，濾液倒入100mL容量瓶定容；取1mL溶液，用石油醚定容至25mL；根據(jù)β-胡蘿卜素的特征吸收波長在450nm條件下，用分光光度法測定吸光值，利用回歸方程計(jì)算出β-胡蘿卜素含量。樣品β-胡蘿卜素含量的計(jì)算公式如下：

樣品β-胡蘿卜素含量(mg/g干菌體)=(C×D×V)/(1 000×m)

式中，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算出的樣品的溶液濃度(μg/mL)；D為色素萃取液的稀釋倍數(shù)(25倍)；m為萃取所用的干菌體樣品質(zhì)量(0.02g)；V為萃取所用的石油醚體積(100mL)；1 000為將β-胡蘿卜素含量單位由μg/g換算成mg/g。

β-胡蘿卜素的含量(mg/L發(fā)酵液)=菌體干重(g/L)×樣品β-胡蘿卜素含量(mg/g干菌體)

1.3干菌體制備方法

1.3.1烘箱干燥法制備。菌絲體預(yù)處理過程，同“1.2.1”。將洗滌好的含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體放入40 ℃烘箱烘干4h，直至菌絲體恒重，將干燥好的菌絲體取出，用研缽研磨粉碎細(xì)胞，然后過60目篩，得到烘箱干燥法干燥含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

1.3.2真空冷凍干燥機(jī)法制備。菌絲體預(yù)處理過程，同“1.2.1”。將洗滌好的含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體預(yù)凍，再利用真空冷凍干燥機(jī)干燥4h，直至菌絲體恒重，將干燥好的菌絲體取出，用研缽研磨粉碎細(xì)胞，然后過60目篩，得到真空冷凍干燥機(jī)法干燥含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

2結(jié)果與分析

2.1β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線通過檢測不同濃度的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，繪制了其標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.118 7x-0.001 7，R2=0.997 5，線性區(qū)間為0～1.6μg/mL，其中x(μg/ml)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，y為波長450nm處吸光度。

圖1　β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of β-carotene

2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素得率的影響微生物的生長經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、穩(wěn)定期和衰亡期，因此發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體生長和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量影響比較大，為了積累更多的β-胡蘿卜素，需要確定最佳發(fā)酵時(shí)間。圖2表示菌體干重和菌體中的β-胡蘿卜素含量隨時(shí)間的變化，從圖2可以看出，兩者均在發(fā)酵第5天時(shí)最高，其值分別為6.7g/L和58.127mg/g(凍干機(jī)干燥法檢測結(jié)果)。這說明發(fā)酵第5天時(shí)，三孢布拉氏霉菌的生長處于穩(wěn)定期，菌體數(shù)量積累最多；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成β-胡蘿卜素的酶系已完全形成，因此積累了大量的β-胡蘿卜素。從圖3可以看出，發(fā)酵液中β-胡蘿卜素含量的最高值也出現(xiàn)在發(fā)酵第5天，即0.44g/L。唐玲在文獻(xiàn)中報(bào)道，三孢布拉氏霉菌在第5天進(jìn)入細(xì)胞生長穩(wěn)定期[9]，這與該試驗(yàn)中得到的結(jié)論一致。因此選擇5d為最適發(fā)酵周期，后續(xù)試驗(yàn)均采用發(fā)酵5d的發(fā)酵液。

圖2　發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體中β-胡蘿卜素含量和菌體干重的影響 Fig.2　Effects of fermentation time on thalli β-carotene content and thalli dry weight

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中β-胡蘿卜素含量的影響Fig.3　Effects of fermentation time on β-carotene content in fermentation liquid

2.3不同干燥法對(duì)β-胡蘿卜素含量的影響天然β-胡蘿卜素在干燥過程中很容易被氧化，降低其生物活性，因此，在β-胡蘿卜素干燥過程中找到一種低氧化率的干燥方式非常重要。常用的菌體干燥法有：干燥箱干燥法和真空冷凍干燥機(jī)干燥法，前者應(yīng)用最廣泛，操作方便、設(shè)備簡單；后者因其干燥過程不經(jīng)過水分的液態(tài)轉(zhuǎn)化而直接升華，能保持物料的物理性質(zhì)和化學(xué)組成，但生產(chǎn)成本較高。該試驗(yàn)以三孢布拉氏霉菌菌絲為原料，采用此2種干燥法分別制得干菌體，比較了這2種干燥法對(duì)β-胡蘿卜素含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　不同干燥方式對(duì)菌體中β-胡蘿卜素含量的影響Fig.4　Effects of different drying methods on β-carotene content in thalli

從圖4可以看出，使用真空冷凍干燥機(jī)干燥制得的干菌體中的β-胡蘿卜素含量明顯高于烘箱干燥制得的干菌體中的β-胡蘿卜素含量。圖5是β-胡蘿卜素的分子結(jié)構(gòu)式，可以看出β-胡蘿卜素分子具有多雙鍵結(jié)構(gòu)，對(duì)光、熱、氧等因素都很敏感，很容易氧化分解和異構(gòu)化[10-11]。因此，β-胡蘿卜素在低溫真空條件下穩(wěn)定性更好，在較高溫度(40 ℃)和空氣接觸環(huán)境中更容易被氧化。考慮到β-胡蘿卜素是一種高附加值的產(chǎn)品，降低β-胡蘿卜素的氧化降解率對(duì)收益率的提高影響較大，在菌體干燥工藝中應(yīng)選擇真空冷凍干燥法干燥菌體。

圖5　β-胡蘿卜素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.5　Molecular structure of β-carotene

2.4保藏方式對(duì)β-胡蘿卜素降解的影響由于β-胡蘿卜素分子中含有很多共軛雙鍵，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，很容易被氧化降解，保藏方式對(duì)β-胡蘿卜素的降解有很大的影響。首先，圖6中比較了未經(jīng)保藏的β-胡蘿卜素和經(jīng)過20h避光10 ℃保藏(分別稀釋2 500倍低濃度保藏和稀釋100倍高濃度保藏)的β-胡蘿卜素干粉中β-胡蘿卜素含量。從圖6可以看出，菌體中β-胡蘿卜素和發(fā)酵液中的β-胡蘿卜素經(jīng)過20h的保藏，其含量均有明顯下降。從圖6中還可以看出，低濃度(石油醚稀釋2 500倍)保藏的β-胡蘿卜素溶液中的β-胡蘿卜素殘留比高濃度(石油醚稀釋100倍)保藏的更多。這是因?yàn)榈蜐舛葧r(shí)溶液中β-胡蘿卜素物質(zhì)的量少，底物與氧氣接觸的概率要小很多，導(dǎo)致β-胡蘿卜素降解率下降。

圖6　不同保藏方式對(duì)β-胡蘿卜素降解的影響Fig.6　Effects of different storage methods on β- carotene degradation

因此，β-胡蘿卜素發(fā)酵液的干燥和干粉的提純工藝都應(yīng)在下罐之后較短的時(shí)間內(nèi)完成，這樣才能降低β-胡蘿卜素的氧化降解。在β-胡蘿卜素后處理過程中如需保藏，應(yīng)在低濃度條件下保藏，從而降低其損失。

3結(jié)論

綜上所述，利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵制備β-胡蘿卜素5d為最適發(fā)酵周期；在菌體干燥工藝中選擇真空冷凍干燥法干燥菌體；β-胡蘿卜素發(fā)酵液的干燥和干粉的提純工藝都應(yīng)在下罐之后較短的時(shí)間內(nèi)完成為宜；低濃度保藏方式有利于降低β-胡蘿卜素的降解率。在此條件下制得的β-胡蘿卜素胞內(nèi)含量為5.80%，發(fā)酵液中β-胡蘿卜素含量可達(dá)到0.44g/L。

該研究中得出最佳發(fā)酵時(shí)間、最適干燥法和最適保藏方式，最大限度地降低了制取過程中β-胡蘿卜素的氧化降解損失，可為利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵法制取β-胡蘿卜素工藝提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 上海第六制藥廠.食品添加劑β-胡蘿卜素：GB8821—1988[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1988

[2] 楊寧.發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2004，25(3)：19-21.

[3] 潘鵬，楊斯，蔡俊.三孢布拉霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46(4)：36-40.

[4] 張婷婷，葛佳，牛天貴，等.三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品科技，2009，34(11)：2-7.

[5] 余茜煒,向夢(mèng)雄,左樂,等.三孢布拉氏霉中β-胡蘿卜素的提取研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(2):587-588,622.

[6] 梁明.天然β-胡蘿卜素提取工藝研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(20):6771-6773,6782.

[7] 童海寶，蔡楊，馬海森，等.發(fā)酵法生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，2002(2)：15-16.

[8] 朱秀靈，車振明，徐偉，等.β-胡蘿卜素的生理功能及其提取技術(shù)的研究進(jìn)展[J].廣州食品工業(yè)科技，2002，20(2)：158-161.

[9] 唐玲.三孢布拉氏霉菌發(fā)酵β-胡蘿卜素的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

[10] 孫慶杰，丁霄霖.番茄紅素穩(wěn)定性的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24(2)：47-49.

[11] 惠軍，韓彬，單艷麗.番茄紅素提取工藝及其穩(wěn)定性初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，41(4)：204-207.

基金項(xiàng)目吉林省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20130305024NY)。

作者簡介梁穎超(1988- )，女，黑龍江肇源人，助理工程師，碩士，從事玉米深加工研究。*通訊作者，博士，從事生物催化與生物化工研究。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號(hào)Q 503

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)16-070-03

FermentationandExtractionProcessofβ-carotene

LIANGYing-chao1,2,JINZhen-hua1,2,ZHANGGuang-hao1,2,TAOJin1,2*

(1.TheNationalEngineeringResearchCenterofCornDeepProcessing,Changchun,Jilin130033; 2.COFCO(Jilin)Bio-ChemicalCo.,Ltd.,Changchun,Jilin130033)

Abstract[Objective] To optimize the fermentation and extraction technology of β-carotene in Blakeslea trispora. [Method] β-carotene was fermented by Blakeslea trispora. Effects of fermentation time, drying method and storage method on β-carotene content were researched. The processing technology of β-carotene was determined. [Result] The optimal fermentation time was 5 d; the drying method was vacuum freeze drying; and the storage method was extracting as soon as possible after the fermentation. Under this condition, β-carotene contents in thalli and fermentation liquid were 5.80%; and 0.44 g/L, respectively. [Conclusion] This research provides references for the research and extraction of β-carotene by fermentation method.

Key wordsBlakeslea trispora; β-carotene; Fermentation; Extraction