籽用西瓜種質(zhì)資源SSR分析及初級核心種質(zhì)庫構(gòu)建

石　磊，王　萍，楊　靜，王豐豐,孫曉華

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古野生蔬菜種質(zhì)資源與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010019)

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籽用西瓜種質(zhì)資源SSR分析及初級核心種質(zhì)庫構(gòu)建

石磊，王萍*，楊靜，王豐豐,孫曉華

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古野生蔬菜種質(zhì)資源與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010019)

摘要:采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對50份不同來源的籽用西瓜材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，并基于SSR分子標(biāo)記聚類分析采用最小距離逐步抽樣法構(gòu)建籽瓜初級核心種質(zhì)庫。研究表明：(1)從106對SSR隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的31對引物，共得到138條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶115條，占83.33%，平均Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.419 3，平均Nei’s多樣指數(shù)(h)為0.272 4，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.458 0，平均等位基因數(shù)(Na)為1.981 4，說明50份籽瓜種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性。(2)用NTsys2.10e軟件對種質(zhì)資源聚類分析表明，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)介于0.57～0.91之間，其中來源地相同的個(gè)別種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)卻很小，而來源地不同的個(gè)別種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)卻很高。(3)采用最小距離逐步抽樣法，按70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%的比例抽樣后，各個(gè)核心子集遺傳多樣性指數(shù)總體上變化不明顯，但各抽樣比例相比，以抽樣比例20%獲得10份初選種質(zhì)的 Ne、 h和 I達(dá)到最高值，說明抽樣20%構(gòu)建的初級核心種質(zhì)對原始種質(zhì)具有很好的代表性。

關(guān)鍵詞:籽用西瓜；SSR分子標(biāo)記；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；核心種質(zhì)

籽用西瓜(Citrulluslanatusssp.vulgarisvar.megalaspermusLin et Chao)簡稱籽瓜，屬于葫蘆科普通西瓜亞種中的籽瓜變種，俗稱“打瓜”、“瓜籽瓜”，主要以種子為食用器官，常根據(jù)種子顏色分為黑籽瓜和紅籽瓜兩大品種[1]。籽瓜的瓜瓤和瓜皮具有多種微量礦質(zhì)元素和果膠，長期食用能夠調(diào)節(jié)人體新陳代謝，祛除胃寒，溶蝕軟化血管，增強(qiáng)免疫力，排除體內(nèi)沉積毒素，凈化小環(huán)境。近年來，隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，復(fù)種指數(shù)增加，籽瓜的一些病害日趨嚴(yán)重，加之長期采用不規(guī)范的常規(guī)繁殖留種，造成各地栽培品種良莠不齊、混雜退化，致使品質(zhì)下降、產(chǎn)量不穩(wěn)，籽瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到嚴(yán)重制約。因此，開展籽瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，并建立核心種質(zhì)庫，對于籽用西瓜育種及種質(zhì)資源的保存利用具有重要意義。

植物遺傳多樣性資源是生物遺傳的基礎(chǔ)。近年來隨著遺傳資源的急劇減少，種質(zhì)資源的保存利用成為急需解決的問題。Frankel[2-3]和Brown[4]研究提出核心種質(zhì)的概念，即以最小的資源份數(shù)最大限度地代表該物種的遺傳多樣性，在一定程度上解決了這一問題。近年來國內(nèi)外關(guān)于核心種質(zhì)的研究較多，但多是基于農(nóng)藝表型性狀，表型性狀易受環(huán)境因素的影響。因此，只按照表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)方法是片面的。分子標(biāo)記輔助育種的研發(fā)表明，其能夠在短期內(nèi)獲得大量的遺傳信息，且能穩(wěn)定、高效地反映種質(zhì)資源群體中個(gè)體間的親緣關(guān)系。近年來，溫景輝[5]、張維瑞等[6]、劉娟等[7]、白成科等[8]采用分子標(biāo)記技術(shù)分別研究山葡萄、桂花、野杏、山茱萸等植物種質(zhì)遺傳多樣性并構(gòu)建核心種質(zhì)都得到了準(zhǔn)確的結(jié)果。

趙虎基等[9]用RAPD標(biāo)記對籽用西瓜的8個(gè)品種(系)和西瓜種內(nèi)其它變種的4個(gè)品種(系)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。張建農(nóng)[10]用RAPD標(biāo)記對4個(gè)籽用西瓜、2個(gè)野生西瓜和不同生態(tài)類型瓤用西瓜等34個(gè)品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析。柳唐鏡等[11]用RAPD標(biāo)記對不同的紅籽瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析。與前人相比，本研究運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對19個(gè)不同來源地的50份籽(西)瓜種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，并基于聚類分析結(jié)果采用最小遺傳距離逐步抽樣法(LDSS)構(gòu)建籽瓜的初級核心種質(zhì)庫，能夠較為全面地為中國籽瓜種質(zhì)資源的評價(jià)提供參考，為今后進(jìn)一步構(gòu)建籽瓜核心種質(zhì)奠定基礎(chǔ)，也為籽瓜種質(zhì)資源的保護(hù)利用及育種工作提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

本研究所收集的50份籽(西)瓜材料來自個(gè)19省區(qū)，甘肅13份，內(nèi)蒙古5份，新疆、湖南、美國各4份，寧夏、廣東各3份，陜西、前蘇聯(lián)各2份，剩余的10份分別來自10個(gè)省區(qū)。其中含野生型種質(zhì)2份，普通西瓜2份。所有材料已經(jīng)過多代的自交純化。供試50份籽(西)瓜材料(表1)種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。參考錢韋等[12]的取樣方法，于2014年8月采集了生長旺盛期的籽瓜幼嫩葉片，將不同材料葉片放入有標(biāo)記的塑封袋中，立即暫時(shí)存入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱中冷凍備用。

1.2PCR反應(yīng)

采用DNA提取試劑盒(天根生化有限公司)提取50份材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。選用106對隨機(jī)引物以提取的籽瓜基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，篩選出電泳條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的31對引物(表2)，分別對50份樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL[13]，模板DNA 2 μL(約50 ng/μL)，引物2 μL，25 mmol/L MgCl21.8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×TaqBuffer 2 μL，TaqDNA Polymerase 0.1 μL(5 U/μL)，ddH2O 11.1 μL。PCR擴(kuò)增程序反應(yīng)在BYQ6031 E-505型PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃伸5 min，4 ℃保存以備電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠于80 V電壓下預(yù)電泳30 min，后在70 W恒定電壓下電泳90 min左右，銀染后拍照記錄。

表1　供試籽瓜材料及來源

Table 1Continued

編號Code材料Accession類型Type來源Sourceofgermplasm引種地Introductionplace38大板2號瓜子DabanNo.2guazi黑籽瓜Blackseedwatermel-on甘肅GansuA39蘭州大板1號LanzhoudabanNo.1黑籽瓜Blackseedwatermel-on甘肅GansuB40紅籽瓜Hongzigua紅籽瓜Redseedwatermelon前蘇聯(lián)FormerSovietUnionB41道縣紅籽瓜(白肉)Daoxianhongzigua(bairou)紅籽瓜Redseedwatermelon湖南HunanB42江西信豐紅瓜子Jiangxixinfenghong-guazi紅籽瓜Redseedwatermelon江西Jiangxi江西Jiangxi43花皮籽瓜Huapizigua黑籽瓜Blackseedwatermel-on陜西ShaanxiB44寧夏紅籽瓜Ningxiahongzigua紅籽瓜Redseedwatermelon寧夏NingxiaB45道縣紅籽瓜(紅肉)Daoxianhongzigua(hongrou)紅籽瓜Redseedwatermelon湖南HunanB46靖遠(yuǎn)大板1號JingyuandabanNo.1黑籽瓜Blackseedwatermel-on甘肅GansuB47蘭州大板Lanzhoudaban黑籽瓜Blackseedwatermel-on蘭州LanzhouA48道縣紅籽瓜(粉紅肉)Daoxianhongz-igua(fenghongrou)紅籽瓜Redseedwatermelon湖南HunanB49新籽瓜1號XinziguaNo.1黑籽瓜Blackseedwatermel-on新疆Xinjiang新疆Xinjiang50新疆紅籽瓜Xinjianghongzigua紅籽瓜Redseedwatermelon新疆Xinjiang新疆Xinjiang

注：A. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所；B. 國家西甜瓜種質(zhì)資源平臺(河南，鄭州)。

None: A. Vegetable and Flower Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences；B. The platform of watermelon and muskmelon germplasm resources (Henan, Zhengzhou)

1.3數(shù)據(jù)分析

利用0、1矩陣統(tǒng)計(jì)方式構(gòu)建SSR數(shù)據(jù)庫。采用POPGENE32軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比率、Shannon’s信息指數(shù)等遺傳多樣性指數(shù)。采用NTsys2.10e[14]聚類分析軟件UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

1.4初級核心種質(zhì)庫構(gòu)建及其評價(jià)

用NTsys2.10e軟件對種質(zhì)資源聚類分析后，采用最小距離逐步抽樣法(LDSS)構(gòu)建核心種質(zhì)[15]。具體方法為：通過觀察50份種質(zhì)的UPUMA聚類圖，將遺傳相似系數(shù)較大的種質(zhì)組合隨機(jī)刪除1份，再將剩余的種質(zhì)再次聚類分析；再次刪除遺傳相似系數(shù)較大的成對種質(zhì)中的1份種質(zhì)。以此類推，直到篩選出能夠達(dá)到要求的核心種質(zhì)。第1次抽樣時(shí)，選出一定份數(shù)種質(zhì)，運(yùn)用NTsys2.10e軟件對其進(jìn)行聚類分析；第2次抽樣在第1次抽樣聚類分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行，以此類推。每次抽樣后，均采用POPGENE32軟件分別對構(gòu)建的核心種質(zhì)的SSR-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行核心種質(zhì)的遺傳多樣性分析，進(jìn)而評價(jià)初級核心種質(zhì)的代表性。

2結(jié)果與分析

2.1SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

從106對SSR引物中共篩選出31對多態(tài)性好、條帶清晰的引物，分別對50份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1為引物P1、P43對50份籽瓜材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳圖。由圖1可以看出每個(gè)樣品體系中均得到了清晰、豐富的條帶，可進(jìn)行下一步的多樣性分析。31對引物(表2)對50份材料共擴(kuò)增出138條條帶。有115條重復(fù)性好、清晰的多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率高達(dá)83.33%。表明本研究所收集的籽瓜種質(zhì)資源在分子水平上具有豐富多態(tài)性，種質(zhì)具有很好的代表性。

（1）首次揭示在郎酒高溫制曲進(jìn)程中，細(xì)菌與真核微生物種類具多樣性，但細(xì)菌與真核微生物變化趨勢差異顯著。

2.2籽瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果(表3)顯示，50個(gè)材料的擴(kuò)增條帶平均Shannon’s信息指數(shù)為0.419 3，平均Nei’s多樣指數(shù)為0.272 4，平均有效等位基因數(shù)為1.458 0，這50份種質(zhì)資源在分子水平上具有豐富的遺傳多樣性，具有很高的代表性。

2.3SSR聚類分析

31對隨機(jī)引物對50份籽(西)瓜種質(zhì)進(jìn)行SSR擴(kuò)增，得到115條多態(tài)性條帶，通過NTsys軟件處理，在獲得的相似系數(shù)矩陣中，相似系數(shù)范圍為0.57～0.91，其中種質(zhì)29和33之間的相似系數(shù)最小，表明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而親緣關(guān)系最近的1組種質(zhì)是32和36，相似系數(shù)都為0.87。從基于SSR標(biāo)記的聚類樹狀圖中可知(圖2)，在相似系數(shù)為0.657處，50份籽(西)瓜種質(zhì)可分為6組。第一組：2份野生種質(zhì)，29(野籽瓜)和33(PI542120)；第二組：30(磴口籽瓜)和34(GN-1)；第三組：4(陜西紅籽)和6(黑大片-2)；第四組：5(黑崩筋)和47(蘭州大板)；第五組：40[紅籽瓜(蘇聯(lián))]和44(寧夏紅籽瓜)；第六組：剩余的40份種質(zhì)資源，相似系數(shù)范圍為0.661～0.910。

1～50.編號同表1圖1　引物P1(A)和P43(B)對50份籽瓜材料的PCR擴(kuò)增圖譜1～50.Same as Table 1Fig. 1　PCR products from primer P1(A)and P43(B) with 50 seed watermelon accessions

引物Primer序列Sequence總帶數(shù)No.ofbands多態(tài)性條帶Polymorphibands多態(tài)性比率Percentageofpolymorphicband/%P1FTCTGTGTGGATGCAAATGGT6583.33RGCTAATCGAGCCCAGTTACGP2FTCAAAAGGTTTGCCCTAAATGAAA5240.00RTGCTGATCTCCCATTCTTAACCTCP4FGCAAAGATTGTCTATGAAGCAGCA44100.00RGCTCATTGGCTTCTTGAATCTGTTP5FTGCTTCAAAATCTATTCACAATTTGC5360.00RTTCTTGGTTTCGGGTTTCTTTACAP6FAAACCATGATTTTACAGGGGATCA33100.00RTTTCTGTCTTCTTTTGACCAATGCP10FTGGTTGAAATCAATAAAAAGTGAA44100.00RTGGATGTTTTTGGCATTTGAP11FTTAGCCTAAGCAAGGGTTTTT3266.67RAAGTACACATTTTAAACAATCAATCCAP12FTCAAACCGACTGCCATATCA3266.67RAGCTTGTCTTCCTGGCCTTTP13FAAAATTACATCTTAAATGCGCC44100.00RGGAACATTGACTTCAATCAGCAP14FTTCTTGAAACTCAACCCTCAAA5360.00RAAAGCGTGTCGAGTGTGAGAP15FTGGATCATTTGACAGATTTAGCGA44100.00RCATCACAGTTAACGATCACAAGGCP19FTGTTGAGATTCTTTGATTTCAACTGT6583.33RTGGGTCAAAGTATTTTTGCTTTTTP20FATGGTTCATTTTCACGTTCG6583.33RAAAAATCAAGCAAAGAACAACATP21FTTCCACACCAAGGAGGTAGG44100.00RCATGTCATTCGATAAAGCAGAAA

Table 2Continued

引物Primer序列Sequence總帶數(shù)No.ofbands多態(tài)性條帶Polymorphibands多態(tài)性比率Percentageofpolymorphicband/%P24FATTTCTGGCCCCAGTGTAAG66100.00RGAACAACGCAACCACGTATGP25FCCCTATTGCCTATTTTTCTCAA6583.33RAAATTTGTGCTCTTCGTGGGP29FAGCAAATGCATGGGGAAAAC33100.00RTGTTGAATGGAGGCTTTGAGP30FATTTCTGGCCCCAGTGTAAG55100.00RGAACAACGCAACCACGTATGP32FTCAATTCCAATCATCCATCC33100.00RTAATGGCCGGACTTTATGCP34FGAGCAGGGGAGAAGGAAAAC66100.00RCCAGTAGCTTTTTCCGATGCP36FTGCTCAATCCACCCTTCTC6583.33RAAAAACAGCAACTCTCCCATCP43FCAGAGGAACGAGAGGGAGTG44100.00RGGGGAGCCCATATTTTAACCP47FGCTTTGAAGTTTGTTTAATTTTAGTCC3266.67RCGCCTCACGCTCTCTAACP52FAATCTTCCCCATGCCAAAAC4375.00RGACTTCCAAACCCTCCCTTCP54FAAAAATTTGAAAATTAGGTGAGGAG3266.67RTTTTGACTAGGTGTACACTACCTTTGP57FCAAACAAAAACTTAGGAACTAGATTG4375.00RTTAGCCATGAGGCGTGTACCP75FAGATGCCCCATTCAGTTTTG66100.00RTTGAAGGAGAGAGGGAATGGP81FAGACAGGGAAATCGCAGAGA22100.00RGGTTAAAGGACGTCGGGATTP83FTTGGGATGTAGATGTCCGGT55100.00RTCCCCAATCCAACTCCCTATP94FATATGTGTGTCGTGTTCCGC6583.33RCAGATTTCCGAGAGGGAAAA

表3　最小距離逐步抽樣法構(gòu)建籽瓜核心種質(zhì)的遺傳多樣性

圖2　50份籽瓜種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖Fig. 2　UPGMA dendrogram of 50 edible seed watermelon germplasms

圖3　主成分散點(diǎn)圖Fig. 3　The principal component scatterplot

2.4基于SSR標(biāo)記的主成分分析

對基于SSR標(biāo)記的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示：第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為9.13%，第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為7.42%，第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為5.74%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為22.84%。根據(jù)每份籽瓜種質(zhì)的主成分之值，繪制第一、二主成分散點(diǎn)圖(圖3)。

從圖3可知，50份籽(西)瓜種質(zhì)被分成4組，29(野籽瓜)和33(PI542120)單獨(dú)劃分出來分成一組，5(黑崩筋)獨(dú)自可分一組，表明這3份種質(zhì)與其它份種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn)。而其余份種質(zhì)相對緊密的聚合在一起，表明它們之間的親緣關(guān)系非常近。雖然主成分分析和聚類分析對50份籽(西)瓜種質(zhì)的分類結(jié)果基本一致，都能將野生西瓜種質(zhì)、普通西瓜種質(zhì)與籽瓜種質(zhì)區(qū)分開來，但它們所反映的信息不同。聚類分析在揭示密切相關(guān)的個(gè)體間的關(guān)系時(shí)能夠提供更豐富的信息，而主成分分析偏重于在不同群體之間的聚類上提供更多的信息。

先對50份籽(西)瓜種質(zhì)的聚類分析，其結(jié)果再用最小距離逐步抽樣法(LDSS)進(jìn)行構(gòu)建核心種質(zhì)。共抽樣7次，每次抽樣構(gòu)建籽瓜核心種質(zhì)的遺傳多樣性如表3。由表3可以看出，隨著抽樣種質(zhì)數(shù)目的減少，遺傳多樣性參數(shù)總體上變化較?。挥行У任换驍?shù)目變化較小，且抽樣6的有效等位基因數(shù)目最高；Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)均略有增加，而在抽樣6中達(dá)到最高值；多態(tài)性位點(diǎn)百分率呈現(xiàn)下降趨勢，在抽樣7下降較明顯。抽樣6所構(gòu)建的種質(zhì)庫的抽樣數(shù)是抽樣前的20%。

原始種質(zhì)除去核心種質(zhì)后保留下來的種質(zhì)資源叫做保留種質(zhì)[16]。從表3可看出核心種質(zhì)保留了原種質(zhì)20%的樣品，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)的保留率分別為94.93%、97.47%、101.84%、108.88%和108.71%，可見核心種質(zhì)能很好地代表原種質(zhì)遺傳多樣性。綜合上述分析，取抽樣6為初級核心種質(zhì)(圖4)。

圖4　抽樣6構(gòu)建的籽瓜核心種質(zhì)庫聚類圖Fig. 4　Dendrogram of core collection of seed watermelon No.6 sampling

3討論

本研究SSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果顯示，篩選出的31對SSR引物，對50份來自個(gè)19省區(qū)種質(zhì)資源PCR擴(kuò)增出138條清晰的多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率高達(dá)83.33%，表明本研究收集到的籽瓜種質(zhì)資源在分子水平上具有豐富的多態(tài)性。于海彬等[17]用篩選出的12條RAPD隨機(jī)引物在51份籽(西)瓜種質(zhì)間共擴(kuò)增出80條譜帶。其中74條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶的比率為92.50%，12條隨機(jī)引物的平均Shannon多樣性信息指數(shù)為0.7295；用不同分子標(biāo)記方法對籽瓜種質(zhì)研究結(jié)果證明了籽瓜DNA分子水平上的高度多態(tài)性和代表性。

本實(shí)驗(yàn)聚類分析中，其遺傳相似系數(shù)介于0.57～0.91之間，除個(gè)別種質(zhì)外，50個(gè)種質(zhì)聚類結(jié)果與地區(qū)來源有較高的一致性，表明其親緣關(guān)系比較近，遺傳范圍狹窄。在相似系數(shù)為0.594時(shí)，將50份籽(西)瓜種質(zhì)分為兩大類，2份野生種質(zhì)廣東野生籽瓜(29)和美國野生籽瓜PI542120(33)單獨(dú)聚為一類，剩余48份種質(zhì)聚為另一大類，說明這兩份野生種質(zhì)的基因組和其所攜帶的遺傳信息與其它種質(zhì)之間的差異較大，表明了野生型與栽培型籽瓜種質(zhì)間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，2份野生種質(zhì)間遺傳關(guān)系較近，而栽培型的籽瓜間遺傳關(guān)系較近。這與趙虎基等前人研究結(jié)果相似[9，11,17]。

通過主成分分析和聚類分析也揭示出了地理上的來源對籽瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系影響不大。例如，紅籽瓜(27)和大板2號瓜子(38)的遺傳相似系數(shù)為0.866，建陽月子籽瓜(32)和點(diǎn)心(83)(36)的遺傳相似系數(shù)為0.874。2種籽瓜所處地理位置和生態(tài)環(huán)境不同，卻在分子水平上聚為同一類，表明來自不同地區(qū)的種質(zhì)資源之間在分子水平上親緣關(guān)系較近。另外，來自同一地區(qū)的種質(zhì)親緣關(guān)系不一定近，例如來自甘肅省的8份種子類型為大板的籽瓜資源，其中大板紅籽瓜(放射網(wǎng))(11)、大板紅籽瓜(綠網(wǎng))(15)、甘肅大板1號(18)、大板瓜子(26)、大板2號瓜子(38)、靖遠(yuǎn)大板1號(46)親緣關(guān)系比較近，而蘭州大板1號(39)、蘭州大板(47)與它們比較相對較遠(yuǎn)。綜上所述，這可能是由于籽瓜在漫長的發(fā)展史中各地區(qū)相互引種交流，造成各地區(qū)籽瓜出現(xiàn)品種混雜、同名異物和同物異名等的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象還需進(jìn)一步的深入探討和研究。

核心種質(zhì)構(gòu)建是種質(zhì)資源研究的熱點(diǎn)。形態(tài)標(biāo)記作為研究核心種質(zhì)的指標(biāo)，有簡便和研究費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，但形態(tài)標(biāo)記的數(shù)量少，易受環(huán)境條件的影響，對資源的鑒定和分類不夠精準(zhǔn)，在反映品種間遺傳差異的問題上不夠真實(shí)[18]；DNA分子標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的一種十分有效快速的手段，其中簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、結(jié)果可靠、重復(fù)性好的特點(diǎn)[19]，所以在對核心種質(zhì)的評價(jià)上，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行評價(jià)相比其它標(biāo)記具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

李自超等[20]認(rèn)為各物種適宜的核心種質(zhì)規(guī)模不應(yīng)簡單化而定，對應(yīng)具體的物種，應(yīng)按照該物種的遺傳多樣性來定。本實(shí)驗(yàn)對50份籽(西)瓜種質(zhì)資源進(jìn)行最小距離逐步抽樣法構(gòu)建核心種質(zhì)，并對各抽樣進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明隨著抽取種質(zhì)數(shù)目的減少，各種質(zhì)庫遺傳多樣性參數(shù)變化較小，幾個(gè)參數(shù)出現(xiàn)了峰值變化，但多態(tài)性位點(diǎn)百分率呈現(xiàn)下降趨勢。綜合上述分析，確定20%的核心子集抽樣6為初級核心種質(zhì)庫。抽樣6的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)分別為0.296 6和0.455 8，而且多態(tài)位點(diǎn)比率和等位基因數(shù)均達(dá)到抽樣前的94%以上，符合核心種質(zhì)資源代表初始種質(zhì)資源遺傳多樣性達(dá)到70%～80%的要求[21]，表明抽樣比例為20%的抽樣6所構(gòu)建的種質(zhì)庫具有較高的代表性，更能代表原始群體的遺傳多樣性。種質(zhì)資源合理的聚類分組、取樣方法、取樣比例是構(gòu)建核心種質(zhì)的關(guān)鍵之一，后期還需利用更多方法探討籽瓜種質(zhì)的核心種質(zhì)。

豐富的遺傳多樣性是物種具有更高的適應(yīng)和存活能力的基礎(chǔ)，從而才能提高物種的進(jìn)化、繁殖以及優(yōu)化遺傳結(jié)構(gòu)的能力[22]。所以，對現(xiàn)存籽瓜種質(zhì)資源應(yīng)該采取一些有效的保護(hù)措施。通過建立核心種質(zhì)庫，收集、保存具有較高遺傳多樣性的種質(zhì)資源，這些具有豐富的基因多樣性資源的地區(qū)是將來育種的優(yōu)良種質(zhì)庫的來源，在制定保護(hù)措施和對其利用時(shí)應(yīng)多加注意。

參考文獻(xiàn):

[1]柳唐鏡, 汪李平. 籽瓜(籽用西瓜)產(chǎn)業(yè)前景展望[J]. 北京農(nóng)業(yè), 2007, 11: 13-15.

LIU T J, WANG L P. Prospect of the industry of seed watermelon[J].BeijingAgriculture, 2007, 11: 13-15.

[2]FRANKEL O H. Genetic manipulation: impact on man and society[M]// ARBER W, II.I.MENSEE R, PEACOCK W J. Genetic Perspectives of Germplasm Onservation. London: Cambridge University Press, 1989: 161-170.

[3]FRANKEL O H.BROWN A H D. Crop genetic resources: conservation &. evolution[M]//HOLDEN J H W, WILLIAMSJ T,etal. Current Plant Genetic Resources Today-A Critical Appraisal. London: George Allen &. Urwin Ltd, 1984: 249-257.

[4]BROWN A H D. Core collections: a practical approach to genetic resources management[J].Genome, 1989, 31: 818-824 .

[5]溫景輝. 基于SSR分子標(biāo)記的山葡萄種質(zhì)遺傳多樣性研究與核心種質(zhì)構(gòu)建[D]. 吉林: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[6]張維瑞, 袁王俊, 尚富德. 基于AFLP分子標(biāo)記的桂花品種核心種質(zhì)的構(gòu)建[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2012, 32(7): 1 349-1 354.

ZHANG W R, YUAN W J, SHANG F D. Construction of core collection of sweet osmanthus cultivars based on AFLP molecular markers[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2012, 32(7): 1 349-1 354.

[7]劉娟, 廖康, 趙世榮, 等. 利用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建新疆野杏核心種質(zhì)資源[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(10), 2 017-2 028.

LIU J, LIAO K, ZHAO S R,etal. Using ISSR markers to construct Xinjiang wild apricot germplasm resources[J].ChineseAgriculturalScience, 2015, 48(10): 2 017-2 028.

[8]白成科, 俞君如, 于鳳, 等. 山茱英種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析與初級核心種質(zhì)庫的構(gòu)建[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2009,29(12): 2 401-2 407.

BAI C K, YU J R, YU F,etal. Genetic diversity and construction of primary core germplasm inCornusofficinalisby ISSR marker[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2009, 29(12): 2 401-2 407.

[9]趙虎基，樂錦華，李紅霞，等. 籽用西瓜品種(系)間親緣關(guān)系的RAPD分析[J]. 果樹學(xué)報(bào), 1999, 16(3): 235-238.

ZHAO H J, LE J H, LI H X,etal. Genetic relationships of seed watermelon varieties (lines) RAPD analysis[J].JournalofFruitScience, 1999, 16(3): 235-238.

[10]張建農(nóng). 籽用西瓜種質(zhì)資源利用和耐貯性生理機(jī)理的研究[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[11]柳唐鏡, 于海彬, 張棵, 等. 紅籽瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系RAPD分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(22): 264-270.

LIU T J, YU H B, ZHANG K,etal. RAPD analysis of genetic relationship of Red Seed Watermelon germplasm resources[J].ChinaAgriculturalBulletin, 2010, 26(22): 264-270.

[12]錢韋, 葛頌, 洪德元. 采用RAPD和ISSR標(biāo)記探討中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[J]. 植物學(xué)報(bào), 2000, 42(7): 741-750.

QIAN W, GE S, HONG D Y. Assessment of genetic variation ofOryzagrarzulatedetected by RAPDs and ISSRs[J].ActaBotanicaSinica, 2000, 42(7): 741-750.

[13]周鵬, 王萍, 石磊, 等. 籽用西瓜SSR體系的建立與優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 29(12): 2 401-2 407.

ZHOU P, WANG P, SHI L,etal. Establishment and optimization of SSR system for seed used watermelon[J].JournalofInnerMongoliaAgriculturalUniversity, 2015, 29(12): 2 401-2 407.

[14]ROHI.F F J. NTSYSpc:Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version2.1[CP]. New York:Exeter Software, 2000.

[15]胡晉, 徐海明, 朱軍. 基因型值多次聚類法構(gòu)建作物種質(zhì)資源核心庫[J]. 生物數(shù)學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 15(1): 103-109.

HU J, XU H M, ZHU J. Constructing core collection of crop germplasm by multiple clusters based on geno typic values[J].JournalofBiomathematics, 2000, 15(1): 103-109.

[16]BROWN A H D. The core collection at the crossroad.//: Core Collection of Plant Genetic resources[PGR]. A Wiley-Sayce Publication, 1995, 3-19.

[17]于海彬. 籽用西瓜種子生長發(fā)育規(guī)律與種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[18]李慧峰, 盧森權(quán), 李彥青, 等. 廣西甘薯核心種質(zhì)構(gòu)建初探[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 41(7): 732-735.

LI H F, LU S Q, LI Y Q,etal. Preliminary study on constructing core collection of sweet potato germplasmin of Guangxi[J].GuangxiAgriculturulSciences, 2010, 41(7): 732-735.

[19]徐海明, 胡晉, 邱英雄. 利用分子標(biāo)記和數(shù)量性狀基因型值構(gòu)建作物核心種質(zhì)庫的研究[J]. 生物數(shù)學(xué)學(xué)報(bào),2005, 20(3): 351-355.

XU H M, H J, QIU Y X. Study on the construction of core collection of crops by using molecular markers and quantitative trait loci[J].JournalofBiomathematics, 2005, 20(3): 351-355.

[20]李自超, 張洪亮, 孫傳清, 等. 植物遺傳資源核心種質(zhì)研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 4(5): 51-62.

LI Z C, ZHANG H L, SUN C Q,etal. Status and prospects of core collection in plant germplasm resource[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity, 1999, 4(5): 51-62.

[21]GU X F, YANG A F, MENG H,etal. In vitro induction of tetraploid plants from diploidZizyphusjujubaMill, cv. Zhanhua[J].PlantCellReports, 2005, 24(11): 671-676.

[22]FRANKHAM R, BALLOU J D, BRISCOE D A. Introduction to Conversation Genetics[M]. Cambridge:Cambridge Univer City Press, 2002: 10-36.

(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1125-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1125

收稿日期:2016-03-16;修改稿收到日期:2016-05-09

基金項(xiàng)目:內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2016MS0356);內(nèi)蒙古科技計(jì)劃(20090707,2010704,20110711,20120212)；內(nèi)蒙古高寒地區(qū)高產(chǎn)安全蔬菜生產(chǎn)的研究與創(chuàng)新(NDPYTD2013-3)

作者簡介:石磊(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：1010969973@qq.com *通信作者:王萍，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：wangping@imau.edu.cn

中圖分類號:Q346+.5;Q789;S651

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Genetic Diversity Analysis and Construction of Seed Watermelon Core Germplasm Resources by SSR

SHI Lei，WANG Ping*，YANG Jing，WANG Fengfeng，SUN Xiaohua

(College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Key Laboratory of Wild Peculiar Vegetable Germplasm Resource and Enhancement，Hohhot 010019，China)

Abstract:The genetic diversity of 50 seed watermelon germplasm from different places were analyzed by SSR molecular marker and the primary core collection was constructed by Least Distance Step-wise Sampling(LDSS).The results showed that:(1) 31 pairs of primers which showed high polymorphism were selected from 106 SSR primers, showed 115 polymorphic bands in 138 bands owning 83.33% polymorphic loci, the average of Shannon information index(I), Nei’s genetic diversity(h),effective number of alleles(Ne) and number of alleles(Na) by POPGENE32 analysis was 0.419 3, 0.272 4, 1.458 0 and 1.981 4, respectively, which indicated high genetic diversity in 50 seed watermelon accessions. (2) The clustering result showed that genetic similarity coefficient ranged 0.57-0.91. Some germplasms distributed in different origins and far geographic distance showed high genetic similarity coefficient in 50 accessions. (3) The germplasm were sampled by the method of LDSS and ratio at 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% and 10%, and the genetic diversity parameters of each core subset was compared. The results showed that the change of genetic diversity parameters of each core subset was not clear with the samples reduced in six samplings. But the percentage of polymorphic loci, Ne, h and I of 10 primary accessions were obtained by sampling proportion 20%. It showed that the primary core collection from 20% sampling could well represent the genetic diversities of the whole collection．

Key words:seed watermelon; SSR molecular marker; germplasm resources; genetic diversity; core collection