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    貝尼地平對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化體外研究

    2016-08-06 12:21:36馬忠平黃健張志峰楊云葉楠
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:成骨成骨細(xì)胞骨髓

    馬忠平 黃健 張志峰 楊云 葉楠

    內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,呼和浩特 010030

    國內(nèi)外眾多研究報道,高血壓與成骨異常存在著密切的聯(lián)系[1],高血壓患者的骨丟失明顯加重,而鈣從骨質(zhì)中流失也相應(yīng)加速,此外高血壓引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松近年來成為科學(xué)研究的熱點問題[2-3],為現(xiàn)代骨代謝研究提供了重要線索。貝尼地平(benidipine,BD)作為臨床上常用降血壓藥物,其作用機(jī)制主要是抑制血管平滑肌上的L型電壓依賴性鈣通道蛋白開放,以此阻斷鈣離子在血管平滑肌細(xì)胞中的聚集,從而舒張血管平滑肌并降低血壓[4],但該藥物在骨代謝中的研究報道甚少。本研究旨在通過體外實驗觀察貝尼地平在骨代謝中的具體作用,并探討其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠,體重10~15 g,購至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心;主要實驗儀器與試劑:(1)主要儀器:倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon,TE2000-U),(2)主要試劑:一抗Runx2(CST公司),一抗OCN(CST公司),一抗GAPDH(CST公司),一抗β-catenin(CST公司),一抗LRP5(CST公司),ALP染色試劑盒(碧云天生物試劑公司),Caspase-8比色測定工具包(凱基生物公司),貝尼地平(Sigma公司),α-MEM(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司)。

    1.2 BMSCs的提取與培養(yǎng)

    小鼠寰樞椎脫臼處死后75%酒精浸泡消毒5分鐘,在超凈臺中用眼科剪和眼科鑷剝開小鼠皮膚,從髖臼關(guān)節(jié)處取下小鼠雙下肢,PBS清洗掉粘連毛發(fā),剝離附屬肌肉等軟組織整理出股骨,浸泡于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,用一套新的滅菌眼科剪和眼科鑷剪開股骨雙側(cè)骨端暴露骨髓腔,用1 ml注射器吸取10% FBS的完全培養(yǎng)基沖出骨髓,反復(fù)并兩端交換沖洗,待骨頭發(fā)白后將含有骨髓的完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至干凈的15 ml離心管,800 r/min低速離心5分鐘,骨髓重懸后轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿中5% 的CO2下37℃培養(yǎng),培養(yǎng)基3天更換1次。

    1.3 細(xì)胞實驗的分組與處理

    取第3代生長良好的小鼠BMSCs按1×105個/孔密度接種于6孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時,將細(xì)胞分為2組,對照組:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng);貝尼地平處理組:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下分別以1、10和100 μmol/L貝尼地平培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基各成分比例為100 nmol/L的地塞米松,50 μg/ml的維生素C磷酸酯,10 mM/L的β-甘油磷酸鈉。藥物連續(xù)處理14 天,3天更換1次培養(yǎng)基,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。

    1.4 CCK8檢測貝尼地平對BMSCs的細(xì)胞毒性

    第3代BMSCs種于96孔板中,細(xì)胞的種植密度為1×105個/孔,培養(yǎng)2天后對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理,加入貝尼地平濃度分別為0.1、1、10、100和1 000 μmol/L,加藥處理1天和14天,使用Caspase-8比色測定工具包(CCK8)進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性檢測。每孔加入10 μL的CCK8溶液和90 μL的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,使用酶標(biāo)儀測量各孔吸光度(optical density, OD),CCK8溶液吸收波長為450 nm。

    1.5 ALP染色實驗

    第3代BMSCs種于6孔板中,細(xì)胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平(1~100 μmol/L)處理 14天后,對細(xì)胞行ALP染色。具體步驟為:洗去細(xì)胞培養(yǎng)基,使用無菌PBS輕柔沖洗2次,每孔加入2 ml的4%多聚甲醛室溫固定20分鐘;PBS沖洗3次,每次3分鐘,洗掉多余多聚甲醛;按照使用說明書配制ALP染液,現(xiàn)配現(xiàn)用,配好ALP染液避光保存;每孔細(xì)胞加入ALP染液1 ml避光37℃孵育半小時;PBS沖洗3遍,每遍3分鐘,終止染色。光鏡下拍照,Image-Pro Plus software(IPP,美國)軟件計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

    1.6 Western blotting 檢測Runx2、OCN、GAPDH、β-catenin和LRP5的表達(dá)水平

    對細(xì)胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平(1~100 μmol/L)處理14 天后,在冰上用蛋白裂解緩沖液裂解細(xì)胞,收集蛋白,樣品金屬浴96℃處理10分鐘,10 000 r/min高速離心1分鐘,取上清,-20℃長期儲存?zhèn)溆?。每條泳道上樣30 μg蛋白,用體積分?jǐn)?shù)(V/V)為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳60分鐘,將凝膠中蛋白電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,脫脂奶粉常溫封閉1小時后分別加入一抗(1∶2000)冰箱4℃過夜孵育,室溫TBST溶液清洗3遍,每遍5分鐘,二抗(1∶3000)常溫孵育1小時,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑顯色攝像。條帶用Image J軟件分析,測定灰度值。目的條帶與對應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值為統(tǒng)計結(jié)果。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

    實驗數(shù)據(jù)在SPSS 20.0統(tǒng)計軟件中運用單因素方差分析。首先行方差齊性檢驗,若結(jié)果方差齊,則組間多重比較采用LSD法;若結(jié)果方差不齊組間多重比較采用Dunnett’s T3法。P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±方差表示。

    2 結(jié)果

    2.1 BD對BMSCs的細(xì)胞毒性影響

    加藥處理1天(圖1)和14天(圖2)后,對細(xì)胞行CCK8檢測,結(jié)果提示BD濃度在1~100 μmol/L時對細(xì)胞均不會出現(xiàn)毒性作用(P>0.05),各實驗組(1~100 μmol/L)CCK8結(jié)果和對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1、2,表1)。

    圖1 各濃度貝尼地平處理BMSC 24小時后所得CCK8吸光度(OD)Fig.1 The optical density of CCK8 with different doses of benidipine for 24h (OD).

    圖2 不同濃度貝尼地平處理BMSC 14天后所得CCK8吸光度(OD)Fig.2 The optical density of CCK8 with different doses of benidipine for 2 weeks (OD).

    組別24小時CCK8吸光度14天CCK8吸光度ALP陽性細(xì)胞數(shù)Runx2灰度值OCN灰度值β-catenin灰度值LRP5灰度值對照組1.195500±0.1895421.193000±0.18862588.931830±13.8409301.054064±0.1719731.094875±0.0915891.014758±0.0531500.990622±0.0440071 μmol/L組1.233300±0.3393531.225200±0.309850120.267100±24.9013301.634447±0.1609291.667254±0.0822152.090139±0.1359571.611732±0.09187110 μmol/L組1.346800±0.1567971.351400±0.097437133.637300±20.9852302.116751±0.2348301.984705±0.1670003.444125±0.4555161.864968±0.096020100 μmol/L組1.268800±0.1979481.345200±0.156238174.438700±15.3431602.924276±0.1659722.586582±0.2274704.381943±0.4081262.474474±0.158240

    2.2 BD對BMSCs的ALP表達(dá)影響

    細(xì)胞處理14天后,行ALP染色,光鏡下拍照用IPP軟件計陽性細(xì)胞數(shù)。對照組:88.931830±13.840930,1 μmol/L組:120.267100±24.901330,10 μmol/L組:133.637300±20.985230,100 μmol/L組:174.438700±15.343160,各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3,表1),隨著BD濃度的增加,ALP陽性細(xì)胞數(shù)相應(yīng)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3 BD對BMSCs的Runx2和OCN表達(dá)影響

    細(xì)胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測Runx2表達(dá)量,對照組:1.054064±0.171973, 1 μmol/L組:1.634447±0.160929,10 μmol/L組:2.116751±0.234830,100 μmol/L組:2.924276±0.165972,各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4,表1),隨著BD濃度的增加,Runx2表達(dá)相應(yīng)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣,對細(xì)胞行蛋白免疫印跡檢測OCN表達(dá)量,對照組:1.094875±0.091589, 1 μmol/L組:1.667254±0.082215,10 μmol/L組:1.984705±0.167000,100 μmol/L組:2.586582±0.227470,各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4,表1),隨著BD濃度的增加,OCN表達(dá)也相應(yīng)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖3 不同濃度貝尼地平處理下ALP染色結(jié)果(100×)Fig.3 The staining of ALP with different doses of benidipine (100×).

    圖4 不同濃度貝尼地平處理下Runx2和OCN蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.4 The Western blotting result of Runx2 and OCN with different doses of benidipine

    2.4 BD對WNT/β-catenin信號通路影響

    細(xì)胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測β-catenin表達(dá)量,對照組:1.014551±0.053150,1 μmol/L組:2.090139±0.135957,10 μmol/L組:3.444125±0.455516,100 μmol/L組:4.381943±0.408126,各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5,表1),隨著BD濃度的增加,β-catenin表達(dá)相應(yīng)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣,對細(xì)胞行蛋白免疫印跡檢測LRP5表達(dá)量,對照組:0.990622±0.044007,1 μmol/L組:1.611732±0.091871,10 μmol/L組:1.864968±0.096020,100 μmol/L組:2.474474±0.158239,各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5,表1),隨著BD濃度的增加,LRP5表達(dá)也相應(yīng)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖5 不同濃度貝尼地平處理下β-catenin和LRP5蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.5 The Western blotting result of β-catenin and LRP5 with different doses of benidipine.

    3 討論

    隨著我國人口老齡化程度加劇,人們心血管問題越發(fā)突出,高血壓病的發(fā)病率以及患者數(shù)呈逐年上漲趨勢,給社會、家庭和個人帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。此外,國外臨床證據(jù)提示體內(nèi)長期高血壓狀態(tài)和骨代謝異常存在著密切聯(lián)系[7],這為我們提供了一個解決高血壓病和骨代謝異常疾病的良好思路,能否在降血壓藥物中找到一種良好的緩解骨質(zhì)疏松癥的藥物是本次研究的主要目的。貝尼地平作為L型鈣離子通道阻滯劑,通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣通道進(jìn)而調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮,但貝尼地平在其他靶細(xì)胞的具體作用目前研究不多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞,調(diào)控著體內(nèi)成骨發(fā)育的關(guān)鍵過程,但貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的具體作用目前尚不清楚,明確貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化過程中的影響,對臨床上如何干預(yù)骨折愈合、抗骨丟失有重要意義。

    本實驗采用體外誘導(dǎo)原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞技術(shù)來探討貝尼地平對成骨分化的影響,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為骨代謝中重要的祖細(xì)胞,是成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等共同的來源細(xì)胞,地位重要[8]。本研究首先通過酶標(biāo)儀法檢測貝尼地平對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用,在實驗設(shè)置的貝尼地平濃度范圍內(nèi)(1~100 μmol/L)未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)毒性反應(yīng)(P>0.05),這為下一步的實驗研究提供了重要參考。此外,堿性磷酸酶作為成骨細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,在成骨細(xì)胞鑒定、成骨功能實現(xiàn)等過程中作用巨大。在成骨誘導(dǎo)條件下加藥培養(yǎng)14天后的中期成骨階段,筆者發(fā)現(xiàn)在實驗組中各濃度(1~100 μmol/L)的堿性磷酸酶表達(dá)和對照組相比都是明顯增加的(P<0.05),此外,在實驗組(1~100 μmol/L)的組內(nèi)比較中發(fā)現(xiàn),隨著貝尼地平的濃度增大,堿性磷酸酶的表達(dá)和陽性細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性增加(P<0.05),提示貝尼地平對成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用。另外,為進(jìn)一步探討貝尼地平對成骨分化的分子生物學(xué)影響,筆者對處理14天后的細(xì)胞行蛋白免疫印跡檢測,探究成骨分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2[9]和重要成骨調(diào)控蛋白OCN表達(dá)量,本研究發(fā)現(xiàn)貝尼地平通過促進(jìn)成骨細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化進(jìn)程,在各實驗組(1~100 μmol/L)中,OCN的表達(dá)均高于對照組(P<0.05),并呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05),從成骨調(diào)控蛋白角度印證了貝尼地平對成骨分化的作用。另外,成骨過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá)在貝尼地平的作用下明顯增加,在實驗組中(1~100 μmol/L)Runx2表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05),隨著貝尼地平濃度增加,Runx2表達(dá)明顯增加的(P<0.05),從核轉(zhuǎn)錄因子水平發(fā)現(xiàn)貝尼地平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Wang BX等人[10]在成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中發(fā)現(xiàn)貝尼地平促進(jìn)ALP、Runx2和OCN表達(dá)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的上游細(xì)胞,其成骨能力改變對骨代謝的影響更為巨大,本研究則從干細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)貝尼地平對成骨作用的影響。

    為進(jìn)一步探討貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的信號通路機(jī)制,本研究對成骨誘導(dǎo)并加藥培養(yǎng)14天后的細(xì)胞行蛋白免疫印跡檢測,探究WNT/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin和LRP5的表達(dá)水平。WNT/β-catenin信號通路是成骨細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵通路[11],前人實驗結(jié)果提示在β-catenin參與情況下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞才具有向成骨細(xì)胞分化的能力[12]。在本實驗中,貝尼地平的加入能上調(diào)β-catenin表達(dá),和對照相比,實驗組(1~100 μmol/L)的β-catenin表達(dá)量均明顯增加(P<0.05),實驗組(1~100 μmol/L)內(nèi)β-catenin的表達(dá)隨貝尼地平增加而增加(P<0.05);另外,作為WNT/β-catenin信號通路中重要的通路活性調(diào)控蛋白,LRP5表達(dá)隨著貝尼地平加入而明顯上調(diào)(P<0.05),并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性(P<0.05)。由以上結(jié)果我們不難看出,β-catenin和LRP5作為WNT/β-catenin信號通路內(nèi)關(guān)鍵正性調(diào)控蛋白,其表達(dá)量的上調(diào)提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路強(qiáng)度明顯增強(qiáng),從信號通路方面闡述貝尼地平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制。

    貝尼地平作為臨床上常用的心血管藥物,其降血壓特性已得到廣泛運用,國外已有部分研究報道貝尼地平對成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用[10, 13]。在此背景下,本研究以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為研究切入點,從成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞水平在體外環(huán)境下探討貝尼地平對骨代謝的具體作用,并闡述了本過程的信號通路機(jī)制,為臨床上貝尼地平的全新運用提供實驗依據(jù)。

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