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    外源性CGRP誘導(dǎo)糖尿病大鼠膜性成骨的實驗研究

    2016-08-06 12:21:34陳海英張如玉蔡阿明
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:祖細胞墨汁骨膜

    陳海英 張如玉 蔡阿明

    1. 莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建 莆田 351100 2. 莆田學(xué)院護理學(xué)院, 福建 莆田 351100 3. 莆田學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院, 福建 莆田 351100

    神經(jīng)因素對骨代謝和生長的直接性調(diào)節(jié)在臨床觀察和實驗已得到證實,其中神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)參與心血管系統(tǒng)的生理、病理過程[1],CGRP陽性神經(jīng)纖維在骨組織內(nèi)主要分布在骨膜的等骨代謝活躍區(qū)[2],以直接或間接方式作用于相應(yīng)靶細胞來完成骨生長、正常骨代謝調(diào)控過程[3]。糖尿病性骨病的關(guān)鍵在于骨組織的修復(fù)重建,而骨膜是受神經(jīng)支配的覆蓋在所有骨骼表面的成骨器官,高度血管化并含有骨祖細胞,是骨膜成骨及骨生成與改建的基礎(chǔ)[4]。外源性CGRP誘導(dǎo)糖尿病大鼠骨膜血管膜的修復(fù)以促進骨重建國內(nèi)外未見報道。本研究通過建立糖尿病大鼠模型,觀察外源性CGRP 對糖尿病大鼠骨膜微血管結(jié)構(gòu)和骨祖細胞的影響,從改善微循環(huán)促進膜性成骨的角度探討CGRP對骨質(zhì)疏松的修復(fù)作用。

    1 材料和方法

    1.1 大鼠糖尿病模型的建立

    清潔級雄性4月齡成年SD大鼠,購自福建醫(yī)科大學(xué)動物室(閩實動質(zhì)準(zhǔn)第2002-0006號)。STZ(美國SANLAN)誘發(fā)糖尿病。OneTouch測定血糖≥167 mmol/L即為糖尿病。隨機分為6組,對照組(CON1,2);糖尿病組(DM1,2),CGRP干預(yù)組(CGRP1,2),每組20只,干預(yù)組在STZ造模前30 min尾靜脈注射CGRP (Peninsula)0.2 ml(100 μg/kg),每天1次。正常對照組注射等體積的生理鹽水。分籠、普通塊料飼養(yǎng),飲自來水。分別在5w和10 w進行觀察。

    1.2 病理標(biāo)本取材、切片及HE染色

    25%的烏拉坦麻醉后取股骨,4%多聚甲醛固定,脫水脫脂,以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣,石蠟包埋(冠狀面),酸處理,烘干,用多聚賴氨酸包被干燥。切片機(德國Leica RM2015)切片(厚度4 μm)。HE染色,光鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察。進行200×和400×的顯微照相,編號、采集存盤。

    骨膜厚度測定:鏡下置一標(biāo)尺,骨膜厚度應(yīng)垂直于骨長軸方向進行。每一標(biāo)本在不同的3個視野各測一次,取平均值。骨祖細胞數(shù)測定:鏡下計算每1 mm骨膜中骨祖細胞數(shù)量。不同視野各測一次,取平均值。

    1.3 CGRP的放射免疫測定

    外周血處理:麻醉后心臟取血4 ml,EP管(10% 依地酸二鈉30 μl,抑肽酶2 000 U)混勻后離心 (4℃, 4 500 r/min,10 min),分離血漿,冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒(普爾偉業(yè))說明書步驟操作。200 ul CGRP標(biāo)準(zhǔn)品(20、60、150、300、600及1 200 pg/ml)待測樣品先后加入CGRP抗血清、免疫分離劑,分離出抗原抗體復(fù)合物,離心,取上清液,測定復(fù)合物的放射性(B),計算各標(biāo)誰管的結(jié)合率(B/B0%),GC-1200型Y放射免疫計數(shù)器計算機自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、并標(biāo)示樣品濃度pg/ml,再換算成每單位CGRP的含量。

    1.4 MVD測定(墨汁灌注組織學(xué)切片法)

    各組取5只大鼠,25%的烏拉坦麻醉后暴露腹主動脈下段并作動脈插管,剪斷腹主靜脈。用肝素、生理鹽水混合液沖洗腹主靜脈至流出清亮液體,用墨汁右旋糖酐50 ml(3∶7)和明膠墨汁65 ml(明膠4 g、墨汁15 ml、蒸餾水50 ml)灌注。分別取出雙側(cè)股骨頭,4%多聚甲醛固定。標(biāo)本常規(guī)脫鈣,石蠟包埋,用滑動切片機切片,片厚160 μm。微血管墨汁厚片3張,每張切片分別選擇生長板測量5個視野,采用體視學(xué)方法,測量血管占其視野的相對面積,規(guī)定為血管相對密度,以評價微血管擴張、滲漏和內(nèi)皮損傷的程度。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 骨膜組織學(xué)觀察

    CON1(圖1A)、CON2(圖1B)骨膜為厚薄均勻的致密纖維組織,外層為成熟的纖維組織,內(nèi)層的細胞形成層含較少的細胞成分。DM1早期骨膜組織疏松、水腫,纖維層間隙增大,成纖維細胞增多,細胞形成層的細胞數(shù)量增多、細胞體積增大,細胞形成層內(nèi)骨祖細胞呈多層排列(圖1C)。DM2可見骨膜退化,骨膜明顯變薄,纖維層間隙較大,骨膜纖維層膠原及成纖維細胞均減少,細胞形成層細胞較小,無規(guī)則排列(圖1D)。CGRP1骨膜結(jié)構(gòu)水腫、疏松(圖1E)。CGRP 2表現(xiàn)薄而均勻的成熟的纖維組織(圖1F)。

    2.2 組織計量學(xué)指標(biāo)測定統(tǒng)計學(xué)

    與正常組相比,DM1的骨祖細胞數(shù)明顯大于CON(P<0.01),DM2的骨膜厚度和骨祖細胞數(shù)明顯低于CON(P<0.01)。與DM相比,CGRP1的骨膜厚度與DM1比較明顯增厚(圖2)。CGRP2骨膜厚度和骨祖細胞數(shù)均明顯大于DM2組(P<0.01) (圖3)。

    圖2 骨膜厚度與正常組比較,*P<0.01,與糖尿病組比較,▲P<0.01Fig.2 The thickness of the periosteum, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

    圖3 骨祖細胞數(shù)與正常組比較,*P<0.01,與糖尿病組比較,▲P<0.01Fig.3 The number of osteogenitor cells, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

    2.3 外周血CGRP含量

    各組外周血CGRP與CON組含量[(0.308±0.035,0.373±0.022)(pg/ml)]比較,DM1的外周血CGRP含量[(0.304±0.041)pg/ml]沒有明顯變化,DM2的外周血CGRP含量[(0.217±0.051)pg/ml]表達明顯降低(P<0.01)。CGRP1的外周血CGRP含量[(0.407±0.024)pg/ml]較DM1明顯升高(P<0.01),CGRP2的外周血CGRP含量較DM2[(0.309±0.031)pg/ml]也升高(P<0.01) (圖4)。

    圖4 外周血CGRP含量與正常組比較,*P<0.01,與糖尿病組比較,▲P<0.01Fig.4 Concentration of CGRP in plasma, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

    2.4 骨膜微血管形態(tài)變化及結(jié)果分析

    CON1(圖5A)、CON2(圖5B)骨膜毛細血管呈網(wǎng)狀,連續(xù)性好,灌注飽滿,未見墨汁外滲。DM1骨膜血管豐富,交織成密網(wǎng)狀,明顯擴張(圖5C)。DM2骨膜血管密度增大,部分血管模糊不清,外滲呈局部或團塊狀黑染;另可見局灶性墨汁灌注缺損區(qū)微血管充盈不良(圖5D)。CGRP1血管擴張交織成網(wǎng)狀,連續(xù)性較好(圖5E),CGRP2骨膜毛細血管呈網(wǎng)狀,有少量外滲(圖5F)。

    圖5 A:正常5周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀,灌注全面,線條清晰,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μm;B:正常10周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀,灌注全面,線條清晰,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μm;C:糖尿病5周組骨膜微血管密度較大,連續(xù)性較好,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μm;D:糖尿病10周組骨膜微血管密度較大,灌注不全且外滲,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μm;E:Gen High組5周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀,線條清晰,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μm;F:Gen High組10周組骨膜微血管密度較大,灌注不全且有外滲現(xiàn)象,墨汁灌注,160 um切片,標(biāo)尺示20 μmFig.5 A: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in normal group at 5 weeks; B: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in normal group at 10 weeks; C: The microvascular density was enlarged and well connected in diabetic group at 5 weeks. D: The microvascular density was enlarged and not well infused in diabetic group at 10 weeks; E: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in Gen High group at 5 weeks; F: The microvascular density was enlarged and not well infused with leakage in Gen High group at 10 weeks. Infusion with ink, 160um slice, bar=20 μm.

    DM1的微血管單位面積明顯大于CON組(P<0.01),DM2的微血管單位面積明顯大于CON組(P<0.01)。CGRP1的微血管單位面積均明顯大于DM1組(P<0.01)。CGRP2的微血管單位面積和與DM2比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

    Fig.6 The unit area of microvascular,*P<0.01, compared with CON,▲P<0.01, compared with DM.

    3 討論

    已有研究證實Ⅰ型糖尿病存在血管內(nèi)皮細胞分泌障礙,并參與一系列的臨床病理過程。糖尿病時葡萄糖氧化過程,內(nèi)皮細胞缺少葡萄糖誘導(dǎo)的自動調(diào)節(jié)的反應(yīng)功能[5],使內(nèi)皮細胞內(nèi)葡萄糖與代謝中產(chǎn)物的持續(xù)性增高,損傷內(nèi)皮細胞,加上激活非酶促蛋白糖基化等擴大內(nèi)皮的損傷[6],出現(xiàn)微循環(huán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)病變。而墨汁灌注連續(xù)切片,能清晰地反映組織微血管結(jié)構(gòu)變化及其損傷情況,包括血管空間分布、走行、形態(tài)聯(lián)系和過渡關(guān)系。另外,周圍神經(jīng)釋放的神經(jīng)肽CGRP是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的內(nèi)源性擴血管肽,具有很強的血管調(diào)節(jié)活性[7],能刺激血管內(nèi)皮細胞增殖,促進血管生成。對血管內(nèi)皮細胞具有減少損傷和保護作用,CGRP 拮抗或緩解的微血管破裂出血。實驗結(jié)果顯示DM1骨膜微血管尚未出現(xiàn)病變,DM2骨膜微血管的內(nèi)皮損傷,微血管滲漏,CGRP1骨膜的微血管未出現(xiàn)病變,而CGRP2骨膜的微血管內(nèi)皮,血管滲漏得到緩解,血管連續(xù)性較好。CGRP可以通過促進血管內(nèi)皮細胞釋放VEGF等血管因子的表達的循環(huán)調(diào)節(jié)途徑[8],改善微循環(huán)、增加組織血流灌注量。

    DM1機體的代謝紊亂和糖毒作用,組織缺血缺氧的低氧環(huán)境能誘導(dǎo)軟骨細胞將線粒體中Ca2+釋放于基質(zhì),同時刺激骨祖細胞分化,進一步表明短時間的低氧刺激,激活骨祖細胞增殖,這可能是骨膜成骨活性的一個重要的因素。DM2骨膜血供不足,代謝低下,骨祖細胞分化停滯,骨膜水腫、變薄。由于高血糖狀態(tài)引起代謝紊亂,導(dǎo)致組織缺血缺氧,CGRP神經(jīng)纖維減少,CGRP隨之釋放減少[9],又進一步加重骨膜血管內(nèi)皮細胞損傷。另應(yīng)激所引起的機體CGRP改變可以刺激成骨細胞自分泌IGF-1,間接地影響成骨細胞的活性,影響成骨效應(yīng)[10]。CGRP通過骨組織局部血流量的增加來增強骨代謝,促進成骨、抑制破骨等通路在骨組織正常代謝及骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。CGRP1表現(xiàn)出CGRP升高,骨膜厚度和骨祖細胞數(shù)增多。說明外源性CGRP與內(nèi)源性CGRP的分布水平相一致。CGRP2加大骨膜微循環(huán)血流灌注量,減輕糖尿病骨膜組織的病理損傷程度,在骨修復(fù)過程中起重要作用[11]。說明外源性CGRP也分布于骨膜等成骨活躍的區(qū)域[12-13],適時調(diào)節(jié)成骨細胞的活性。以及外源性CGRP早期的表達水平高于晚期的動態(tài)變化,主要在成骨的早期發(fā)揮作用。由此可見外源性CGRP在骨組織修復(fù)中起到了主要的調(diào)節(jié)作用。

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