枸杞子乙酸乙酯提取物急性毒性及對(duì)切除卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的防治作用

劉舵 楊永利 雷婷 陳寶東 張勇杰 明磊國*

1.西安組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究所，西安 710032 2.寧夏華寶枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司，銀川 750001

枸杞子(Fructus lycii)為茄科植物寧夏枸杞(Lycium barbarum)的成熟干燥果實(shí)，《本草綱目》中記載枸杞具有“堅(jiān)精骨”的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中也指出枸杞久服能“堅(jiān)筋骨”，因此，枸杞子對(duì)骨質(zhì)疏松的治療存在一定的功效，例如枸杞中的枸杞多糖能夠治療去勢(shì)雌性大鼠的骨質(zhì)疏松[1]。然而，大量研究表明中藥材中堅(jiān)筋益骨的功效成分主要為黃酮類物質(zhì)，如淫羊藿苷[2]、黃芪總黃酮[3]、蜂膠黃酮[4]、骨碎補(bǔ)黃酮[5]及大豆異黃酮[6]等。黃酮類物質(zhì)被稱為植物雌激素，近年來植物雌激素對(duì)絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的防治研究備受關(guān)注[7]。實(shí)驗(yàn)所用的枸杞子乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extraction from fructus lycii， EAEF)中黃酮類物質(zhì)含量較高，可能對(duì)骨質(zhì)疏松有一定的治療作用。但EAEF屬于粗提物，成分復(fù)雜，需要先進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。研究中通過切除雌性大鼠卵巢復(fù)制絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥，來研究EAEF防治骨質(zhì)疏松的功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57/BL6小鼠40只，雌雄各半，6～8周齡，清潔級(jí)，18～22 g。雌性SD大鼠40只，6周齡，清潔級(jí)，180～260 g。均購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(軍)2012-0007。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料與藥品：寧夏枸杞(Lycium barbarum)干果(寧夏華寶枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司提供)，大豆苷元(純度≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Z27M6L1)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2002(鞏義 宇翔)，真空冷凍干燥器2-4 LSC(德國 BMH Instruments)，Shimadzu GC 2010氣相色譜儀(日本 島津)，紫外-可見分光光度計(jì)UV-1601(北京 瑞利)，自動(dòng)組織包埋機(jī)EG1150C(德國Leica)，組織切片機(jī)RM2125(德國 Leica)，光學(xué)顯微鏡BX41(日本OLYMPUS)，Micro CT Inveon(德國 Siements)。

1.2 方法

1.2.1EAEF的制備方法：取5 000 g枸杞干果，用95%乙醇常溫浸提3次，每次3 d。合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空冷凍進(jìn)行干燥，得乙醇提取物。乙醇提取物加入少量水分散，置于分液漏斗，再采用2倍體積的石油醚連續(xù)萃取3次，棄上層萃取液，將下層水相，加入2倍體積的乙酸乙酯，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，于48℃下真空濃縮，真空冷凍干燥后得EAEF。氣相色譜測(cè)得溶劑乙酸乙酯殘留率為0.01%，UV測(cè)得多酚類物質(zhì)含量為30.17%。

1.2.2急性毒理實(shí)驗(yàn)： EAEF采用10%的DMSO玉米油溶液配制，將小鼠隨機(jī)分為1.25、2.50、5.00、10.00 g/kg劑量組及空白組，每組8只，雌雄各半，禁食不禁水。16 h后，在24 h內(nèi)分4次灌胃給藥，每次間隔6 h。給藥后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)，記錄飲食、排泄、精神、活動(dòng)等情況，連續(xù)觀察7 d。給藥后第8 d處死并解剖，肉眼觀察觀察各臟器有無異常，并對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟進(jìn)行石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.3大鼠骨質(zhì)疏松防治實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)取30只雌性SD大鼠，用35 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，在無菌條件下背部(距背側(cè)下肋緣和脊柱1 cm處)雙側(cè)縱行切口，切口約1 cm，依次切開皮膚、皮下組織及肌肉，切除雙側(cè)卵巢，切口逐層縫合。隨機(jī)分為3組，即模型組、大豆苷元組和EAEF組，每組10只。其余10只大鼠為假手術(shù)組，以同樣步驟手術(shù)，但不切除卵巢?；謴?fù)5 d，將大豆苷元組腹腔注射20 mg/kg的大豆苷元，EAEF組腹腔注射125 mg/kg EAEF，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，每周3次，連續(xù)給藥12 w。期間觀察大鼠食欲、精神狀態(tài)和局部感染等情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分離右腿股骨，進(jìn)行Micro-CT掃描。選擇掃描參數(shù)：管電壓80 KV，電流 500 μA，以360°掃描角度、10.44 μm的掃描分辨率沿股骨長軸方向掃描股骨遠(yuǎn)端，獲取掃描分辨率為21 μm連續(xù)的平面μCT圖像。掃描完成后在主機(jī)上選出生長板上1 μm和股骨遠(yuǎn)端1.5 mm的區(qū)域作為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)。CT值高于1500定為骨組織，行三維重建，進(jìn)行定量分析，測(cè)量如下指標(biāo)：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BVF)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，TN)、骨小梁間隔(trabecular spacing，TS)、骨小梁厚度(trabecular thickness，TT) 和骨表面面積比(bone surface area fraction，BSAF)。

2 結(jié)果

2.1 EAEF對(duì)急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠一般表現(xiàn)與體重的影響

小鼠灌胃給藥后，自發(fā)活動(dòng)有所減少，半小時(shí)后恢復(fù)正常。給藥一周內(nèi)，各組小鼠活動(dòng)正常，動(dòng)物外觀、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、呼吸及大小便均未出現(xiàn)異常，亦未出現(xiàn)死亡。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠間體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。一周后，各組小鼠體重均顯著增加(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)后各組小鼠間體重增長率均無顯著差異(P>0.05)。EAEF的LD50及MTD>10 g/kg，根據(jù)GB15193.3-2003中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，表明EAEF屬實(shí)際無毒物。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠體重(n=8，g)Table 1 Body weights of the mice in the acute toxicity experiment (n=8,g)

2.2 EAEF對(duì)急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠臟器的影響

7天后，處死解剖，觀察其內(nèi)臟顏色、光澤、形態(tài)、大小等，均未見異常。對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟進(jìn)行病理學(xué)檢查，各實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)臟組織結(jié)構(gòu)排列有序，細(xì)胞大小、形態(tài)正常，胞漿、胞核染色清晰，未見明顯異常(圖1)。說明EAEF的經(jīng)口急性毒性不明顯，在一定范圍的應(yīng)用是安全可靠的。

圖1 各組急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠各主要臟器HE染色圖(400×)。A：心臟；B：肝臟；C：脾臟；D：肺臟；E：腎臟 Fig.1 HE staining of the main organs of mouse for acute toxicity experiment (400×). A: Heart; B: Liver; C: Spleen; D: Lung; E: Kidney.

2.3 EAEF對(duì)切除卵巢大鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠間體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重比實(shí)驗(yàn)前均有極顯著增加(P<0.01)，各組大鼠間體重增長率均無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)前后各組骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)大鼠體重(n=10，g)Table 2 Body weights of the rats in the osteoporosis experiment (n=10,g)

2.4 EAEF對(duì)切除卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的骨小梁結(jié)構(gòu)均較為纖細(xì)且疏松，厚度較薄，結(jié)構(gòu)退化最為嚴(yán)重，大豆苷元組、EAEF組的骨小梁結(jié)構(gòu)退化不及模型組明顯，可以初步得出，EAEF對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松有一定的防治作用(圖2)。

圖2 各組骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)不同組Micro-CT圖片。A：股骨縱剖圖；B：股骨ROI區(qū)橫截面；C：股骨ROI區(qū)3D模型 Fig.2 Micro-CT images of different groups in the osteoporosis experiment. A: Longitudinal profiles of the femurs; B: Cross sections in ROI area of the femurs; C: 3D models in ROI area of the femurs.

2.5 EAEF對(duì)切除卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)相關(guān)參數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組BD有顯著降低(P<0.05)，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復(fù)，且大豆苷元組與模型組存在顯著差異(P<0.05，圖3A)。與假手術(shù)組相比，模型組BVF、TN顯著降低(P<0.05)，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復(fù)，且與模型組均有顯著差異(P<0.05，3B、3C)。與假手術(shù)組相比，模型組TS增大極顯著(P<0.01)，大豆苷元組和EAEF物組均有一定程度的恢復(fù)，且大豆苷元組與模型組存在顯著差異(P<0.05，圖3D)。與假手術(shù)組相比，模型組TT有所減小，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復(fù)，各組間均無顯著差異(P>0.05，圖3E)。與假手術(shù)組相比，模型組BSAF有所增加，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復(fù)，各組間均無顯著差異(P>0.05，圖3F)。

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種伴隨著骨量降低和骨微觀結(jié)構(gòu)退化的系統(tǒng)性骨骼常見多發(fā)病[8]。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病率很高，據(jù)調(diào)查70歲以下婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率為30%左右，至80歲時(shí)40%的婦女發(fā)生過骨折[9]。骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中，骨結(jié)構(gòu)中的骨小梁的變化表現(xiàn)為骨小梁變細(xì)，最終使松質(zhì)骨的穩(wěn)定性和力學(xué)強(qiáng)度等生物力學(xué)性能減退[6]。有研究者認(rèn)為骨結(jié)構(gòu)的退化對(duì)骨的整體性能通常比骨量的減少更具危害性[10]，因此通過藥物干預(yù)保護(hù)骨的微觀結(jié)構(gòu)，使骨微觀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)是骨質(zhì)疏松治療的重要方向之一。目前切除卵巢大鼠建立骨質(zhì)疏松模型來研究絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為經(jīng)典模型[11]，實(shí)驗(yàn)中也采用切除卵巢大鼠來建立骨質(zhì)疏松模型。

圖3 骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)不同組松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)(n=10)。A：各組BD；B：各組BVF；C：各組TN；D：各組TS；E：各組TT；F：各組BSAF。*：P≤0.05，**：P≤0.01Fig.3 Trabecular microstructure parameters of different groups in the osteoporosis experiment (n=10).A: BD in each group; B: BVF in each group; C: TN in each group; D: TS in each group; E: TT in each group; F: BSAF in each group.*：P≤0.05，**：P≤0.01.

目前，研究者們通過不同工藝流程提取得到的EAEF成分不盡相同，功效也不盡相同，張麗等人[12]發(fā)現(xiàn)EAEF具有良好的抗氧化活性，徐飛等人[13]在EAEF中分離得到了黃酮類物質(zhì)槲皮素單體。實(shí)驗(yàn)中EAEF溶劑乙酸乙酯殘留率為0.01%，其值遠(yuǎn)低于中國藥典(2010年版)中乙酸乙酯的殘留標(biāo)準(zhǔn)0.5%。EAEF的LD50及MTD>10 g/kg，屬實(shí)際無毒，其在一定濃度范圍內(nèi)應(yīng)用是相對(duì)安全可靠的。實(shí)驗(yàn)中所用的EAEF中多酚類物質(zhì)含量30.17%，其中包含較多的黃酮類物質(zhì)，對(duì)骨質(zhì)疏松具有一定的防治作用。大豆異黃酮是典型的植物雌激素，能同時(shí)作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，大豆苷元是大豆異黃酮的主要成分之一，能改善去卵巢小鼠的皮毛蓬松、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍和精神不振等癥狀，增加去卵巢小鼠的子宮重量系數(shù)、骨小梁分布密度和骨皮質(zhì)厚度，還能通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL比例調(diào)節(jié)骨重建過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡，具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[14]，在實(shí)驗(yàn)中作為了陽性藥物。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大豆苷元組、EAEF組的大鼠股骨TN、TT、BVF和BD相對(duì)模型組增加，而TS和BSAF相對(duì)模型組減小，微觀結(jié)構(gòu)有所改善，減緩因絕經(jīng)導(dǎo)致的骨微觀結(jié)構(gòu)退化，對(duì)骨質(zhì)疏松具有一定的防治作用。此實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究開發(fā)治療骨質(zhì)疏松的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為有針對(duì)性的開發(fā)利用寧夏枸杞中的活性成分提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中僅僅使用EAEF進(jìn)行試驗(yàn)，黃酮類物質(zhì)含量較高，但無法排除其中的其他物質(zhì)也對(duì)骨質(zhì)疏松有治療作用。下一步，還需要對(duì)其中的成分進(jìn)一步分離純化，設(shè)定一定的劑量梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，EAEF防治骨質(zhì)疏松的機(jī)制目前還不清楚，有待于進(jìn)一步深入的研究。