松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析

蔡紫玲，劉琪司，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析

蔡紫玲，劉琪司，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

轉(zhuǎn)鐵蛋白是一類非血紅素結(jié)合鐵的β1-球蛋白，廣泛分布于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)?？寺×怂赡炫＾D(zhuǎn)鐵蛋白基因（登錄號(hào)：KU213914），命名為MaTf，其核苷酸序列全長(zhǎng)為2 549 bp，包含一個(gè)2 178 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）和一個(gè)371 bp的帶有加尾信號(hào)的3'非編碼區(qū)（3'UTR）。采用生物信息學(xué)方法分析MaTf的編碼蛋白，結(jié)果顯示：松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白分子量約為80 ku，等電點(diǎn)為7.36，為穩(wěn)定蛋白，有信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，有平均分布在整條肽鏈的43個(gè)磷酸化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)多為隨機(jī)卷曲，僅有21.52%α螺旋，24%β片層（延伸鏈）結(jié)構(gòu)，能形成三段卷曲螺旋，為親水性蛋白，N端和C端各有1個(gè)TR_FER結(jié)構(gòu)域。

松墨天牛；轉(zhuǎn)鐵蛋白；生物信息學(xué)；結(jié)構(gòu)域

蔡紫玲，劉琪司，林同.松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（4）：117-123.

松墨天牛（Monochamus alternatus）是毀滅性病害松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus）的主要媒介昆蟲(chóng)，也是松樹(shù)的重要蛀干害蟲(chóng)。松墨天牛的寄主植物多為松屬（Pinus）植物，包括黑松（Pinus thunbergii）、馬尾松（Pinus massoniana）、云南松（Pinus yunnanensis）、赤松（Pinus densiflora）等［1］，也可危害冷杉屬（Abies）、黃杉屬（Pseudotsuga）、落葉松屬（Larix）、鐵杉屬（Tsuga）和雪松屬（Cedrus）等［2］。另外，松墨天牛分布廣泛，已成為國(guó)內(nèi)南方松林最具危險(xiǎn)性的天牛［3］。

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin），又稱為運(yùn)鐵蛋白、鐵傳遞蛋白、嗜鐵蛋白、鐵糖蛋白，是一類非血紅素結(jié)合鐵的β1-球蛋白，廣泛分布于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)［4］。轉(zhuǎn)鐵蛋白為單鏈糖基化蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為70～80 ku，等電點(diǎn)一般呈酸性，糖基約占6%，在N端和C端各有一個(gè)高同源性的球形結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有1個(gè)可逆性結(jié)合Fe3+離子位點(diǎn)和1個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)［5］。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白具有螯合鐵離子的能力，因此轉(zhuǎn)鐵蛋白主要負(fù)責(zé)輸送鐵離子到紅細(xì)胞作為合成血紅蛋白使用，或者運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體內(nèi)其他需鐵的部位［6］。另外，鐵離子是細(xì)菌生長(zhǎng)的必要因子，因此轉(zhuǎn)鐵蛋白也能夠抗菌殺菌，有自我保護(hù)的抗病作用［7］。

在昆蟲(chóng)綱中，有關(guān)轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究報(bào)道有鱗翅目的云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）［8］、小菜蛾（Plutella xylostella）［9］、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）［10］、水稻二化螟（Chilo suppressalis Walker）［11］，雙翅目的白紋伊蚊（Aedes albopictus）［12］、淡色庫(kù)蚊（Culex pipiens pallens）［13］、埃及伊蚊（Aedes aegypti）［14-15］、刺舌蠅 （Glossina morsitans）［16］，膜翅目的蜜蜂（Apis mellifera）［17］、紅火蟻［18］（Solenopsis invicta Buren）。但尚未有相關(guān)鞘翅目昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白的報(bào)道。本研究成功克隆了松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因cDNA序列全長(zhǎng)，并分析其核苷酸序列基本特征及其推導(dǎo)氨基酸序列的理化特性、信號(hào)肽、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能等，為研究昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白分子特征提供依據(jù)，也為深進(jìn)一步研究昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白與抗藥性機(jī)制提供了分子依據(jù)。

1 　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試天牛 松墨天牛在廣州市從化區(qū)馬尾松次生林誘捕所得，將整只成蟲(chóng)經(jīng)液氮迅速冷凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit II總RNA試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒、pMD20-T Vector、E.coli DH5 α Competent Cells購(gòu)自TaKaRa公司；通用型DNA純化回收試劑盒為天根生物有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基配置試劑（Yeeast Extract、Tryptone Powder、NaCl）、IPTG及X-Gal等為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因cDNA的克隆

1.2.1 總RNA提取 取約20 mg松墨天牛成蟲(chóng)樣本，加液氮研磨成粉末狀，根據(jù)RNA抽提試劑盒（OMEGA公司）說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取操作。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，經(jīng)微量紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）檢測(cè)RNA濃度后，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)中篩選含有完整5'端的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 5.0，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)3'RACE引物：Outer：5'- GTCACACAGGAATAGGGCG-3'，Inner：5'-GGAAGAGCAAAGGCGGACG-3'。

1.2.3 松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白3'RACE擴(kuò)增 以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以特異性引物Outer 和Inner為引物進(jìn)行巢式PCR，Outer PCR反應(yīng)體系：3'RACE Outer Primer（10 μmol/L） 2 μL，10 ×LA PCR Buffer II（Mg2+Free）4 μL，MgCl2（25 mmol/L） 3 μL，cDNA 3 μL，1×cDNA Dilution Buffer II 7 μL，Gene Specific Outer Prier（10 μmol/L） 2 μL，TaKaRaLA Taq? （5 U/μL） 0.25 μL，加水至50 μL。PCR程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

Inner PCR反應(yīng)體系：dNTP Mixture （2.5 mmol/L each） 8 μL，10×LA PCR Buffer II （Mg2+Free）5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 5 μL，TaKaRaLA Taq? （5 U/μL） 0.5 μL，3'RACE Inner Primer（10 μmol/L） 2 μL，1st PCR產(chǎn)物 1 μL，Gene Specific Inner Primer（10 μmol/L） 2 μL，加水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 DNA純化及T-載體連接 3'RACE產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下含目的片段的電泳條帶，按通用型DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Inner PCR產(chǎn)物回收。取純化的Inner PCR產(chǎn)物4 μL，1 μL pMD20-T Vetor，DNA Ligation Mix 5 μL，加dH2O至10 μL進(jìn)行T-載體連接，放在4℃冰箱24 h。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及序列測(cè)定 取T-載體連接產(chǎn)物4 μL轉(zhuǎn)化到50 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)12 h。提取白色菌落的單克隆體進(jìn)行菌落PCR鑒定，再挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 序列分析

1.3.1 松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 測(cè)定序列拼接完成后，經(jīng)NCBI的BLASTp程序鑒定為一種松墨天牛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（序列號(hào)：KU213914）。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp程序、ORF Finder（Open Reading Frame Finder）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）以及ProtParm（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)序列進(jìn)行在線分析，確定轉(zhuǎn)鐵蛋白基因序列的編碼區(qū)并預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，進(jìn)行穩(wěn)定性和半衰期的評(píng)估；信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）在線分析；跨膜結(jié)構(gòu)域分析利用在線工具TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；糖基化位點(diǎn)采用DictyOGlyc 1.1 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）預(yù)測(cè)；磷酸化位點(diǎn)采用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)；疏水性采用Expasy提供的在線工具ProtScale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）分析。

1.3.2 松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能分析 利用GOR在線工具（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）完成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并通過(guò)COILS Server（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分析其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線進(jìn)行同源建模；利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.3 基于昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析 采用軟件DNAMAN對(duì)松墨天牛與其他12種昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，而系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)則通過(guò)Clustalx和MEGA4軟件（NJ法）構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白核苷酸序列組成

以松墨天牛cDNA為模板，采用3'RACE克隆得到轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA序列，其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列已提交GenBank（登錄號(hào)：KU213914），命名為MaTf。MaTf的全長(zhǎng)cDNA序列有2 549 bp，包含一個(gè)2 178 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）和一個(gè)371 bp的帶有加尾信號(hào)的3'非編碼區(qū)（3'UTR）。

2.2 MaTf理化性質(zhì)

MaTf共有725個(gè)氨基酸，計(jì)算分子量約為80 ku，分子式為C3561H5611N967O1080S33，等電點(diǎn)為7.36，預(yù)測(cè)MaTf是一類穩(wěn)定蛋白，這些為MaTf蛋白質(zhì)的分離和純化提供了依據(jù)。

2.3 昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列比對(duì)

經(jīng)過(guò) B L A S T p分析松墨天牛的轉(zhuǎn)鐵蛋白，搜索并篩選了 1 2種昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白，分別為Apriona germari（AAW70172.1）、Tribolium castaneum（XP_001808066.1）、Protaetia brevitarsis（ABI31834.1）、Zootermopsis nevadensis（KDR19744.1）、Mastotermes darwiniensis（AAN03488.1）、Romalea microptera （AAQ62963.2）、Nephotettix cincticeps （BAQ94504.1） 、Papilio xuthus （KPI94090.1）、Apis dorsata （XP_006608191.1）、Aedes aegypti （XP_001647578.1）、Drosophila melanogaster （AAC67389.1）、Glossina morsitans morsitans （AAM46784.3）。使用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)松墨天牛與桑天牛（Apriona germari）的同源性最高，氨基酸一致性在90%以上；與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、白星花金龜（Protaetia brevitarsis）的同源性較高，氨基酸一致性在70%以上，與其余昆蟲(chóng)的同源性較低，氨基酸一致性在43%～59%之間（圖1）。

2.4 基于昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

采用Clustalx和MEGA4對(duì)松墨天牛和7個(gè)目12種昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示，桑天牛、赤擬谷盜、白星花金龜同屬于鞘翅目，與松墨天牛的親緣關(guān)系較為接近，云南野生大蜜蜂、柑桔鳳蝶等與松墨天牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.5 信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及翻譯后修飾分析

信號(hào)肽位于初生蛋白的N端，一般由15～30個(gè)氨基酸殘基組成，是一段能引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多肽［19］。經(jīng)過(guò)Singal IP 4.1在線分析，以0.5分為閾值，C分值0.715在20位點(diǎn)，Y分值0.780在20位點(diǎn)，S分值0.956在1位點(diǎn)，信號(hào)肽計(jì)算結(jié)果為“Yes”，即表示松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白N端有信號(hào)肽，為分泌蛋白。

TMHMM采用馬氏模型，綜合跨膜區(qū)螺旋長(zhǎng)度、親疏水性和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)等特性，能有效地預(yù)測(cè)肽鏈的跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)。根據(jù)TMHMM Server分析，結(jié)果顯示松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，且整條肽鏈都位于膜外。

采用DictyOGlyc在線軟件對(duì)MaTf氨基酸序列的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MaTf含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于196位，為絲氨酸。

圖1 松墨天牛與12種昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列的同源比對(duì)

NetPhos2.0 Server磷酸化位點(diǎn)分析MaTf，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)在整條肽鏈上的分布較平均，計(jì)算分值＞0.5的有：絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)20個(gè)，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)8個(gè)，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)15個(gè)。

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋及疏水性分析

GOR在線預(yù)測(cè)松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）表明，α螺旋占21.52%，β片層（延伸鏈）結(jié)構(gòu)占24%，隨機(jī)卷曲最多，占 54.48%，并不存在β轉(zhuǎn)角等其他結(jié)構(gòu)。根據(jù)COILS Server分析，MaTf有3段序列可形成卷曲螺旋。MaTf疏水性最大分值為3.456、在第8位點(diǎn)，而最小分值為-2.811、在第27位點(diǎn)，為親水蛋白。

圖2 基于松墨天牛與12種昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 MaTf二級(jí)結(jié)構(gòu)GOR分析

2.7 同源建模與功能結(jié)構(gòu)域分析

提交MaTf氨基酸序列到SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白的三維結(jié)構(gòu)分子（圖4）有明顯的兩個(gè)分區(qū)折疊。

根據(jù)SMART在線工具分析，MaTf存在兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，為TR_FER（圖5）。第1個(gè)功能結(jié)構(gòu)域位于32～378個(gè)氨基酸殘基，第2個(gè)機(jī)構(gòu)域位于379～725個(gè)氨基酸殘基。

圖4 MaTf的同源建模SWISS-MODEL分析

圖5 MaTf的結(jié)構(gòu)功能域SMART分析

3 討論

作為脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的主要蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在成紅細(xì)胞合成血紅蛋白過(guò)程中起重要作用，表現(xiàn)在其結(jié)構(gòu)上的保守性。本試驗(yàn)克隆了松墨天牛轉(zhuǎn)鐵蛋白（MaTf）基因cDNA的全長(zhǎng)序列，其推導(dǎo)的氨基酸序列長(zhǎng)達(dá)725個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)生物信息學(xué)分析，MaTf含有信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)大部分為隨機(jī)卷曲，21.52%為α螺旋，24%為β片層（延伸鏈）結(jié)構(gòu)，在300～600之間能形成兩段卷曲螺旋。根據(jù)SMART對(duì)MaTf的功能結(jié)構(gòu)域分析，MaTf有兩個(gè)TR_FER功能結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過(guò)比對(duì)其他昆蟲(chóng)序列，發(fā)現(xiàn)除了雙翅目昆蟲(chóng)有且僅有1個(gè)TR_FER結(jié)構(gòu)域外［20］，其他鞘翅目、等翅目、直翅目、半翅目、膜翅目的昆蟲(chóng)均有兩個(gè)TR_FER。通過(guò)比對(duì)人轉(zhuǎn)鐵蛋白序列，得知人轉(zhuǎn)鐵蛋白也含有兩個(gè)TR_FER結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)鐵蛋白這兩個(gè)功能類似的結(jié)構(gòu)域有一定的同源性，都保留了結(jié)合鐵原子和碳酸陰離子的氨基酸位點(diǎn)，被認(rèn)為是機(jī)體進(jìn)化過(guò)程中以基因復(fù)制方式形成的，可加強(qiáng)對(duì)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力［21-22］。由于鞘翅目昆蟲(chóng)比雙翅目昆蟲(chóng)更為進(jìn)化，前者比后者在C端多1個(gè)TR_FER結(jié)構(gòu)域，可能發(fā)揮更豐富的生理功能。

由于轉(zhuǎn)鐵蛋白具有抗菌殺菌的功能，對(duì)大腸埃希菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用，因此在昆蟲(chóng)中可作為新的抗性檢測(cè)的基因靶標(biāo)［13］。2011年王霄等［12］驗(yàn)證了轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在白紋伊蚊溴氰菊酯抗性品系高表達(dá)，推測(cè)該基因可能與蚊蟲(chóng)抗性機(jī)制相關(guān)。人轉(zhuǎn)鐵蛋白N端半分子能在體外表達(dá)并具有活性，因此在醫(yī)學(xué)界被作為藥物運(yùn)輸載體應(yīng)用于臨床階段［23］。目前未見(jiàn)有關(guān)于昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)鐵蛋白基因外源表達(dá)的研究報(bào)道，將來(lái)可利用該基因進(jìn)行昆蟲(chóng)抗性監(jiān)測(cè)。

［1］Bartlett A C.Genetic changes during insect domestication.advances and challenges in insects rearing［M］.ARS，USDA New Orlean，1984：1-8.

［2］楊建霞.松墨天牛對(duì)寄主植物的適應(yīng)性與松材線蟲(chóng)危害特性的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［3］楊建霞，郝德君，周曙東，等.寄主植物對(duì)松墨天牛的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)及對(duì)體內(nèi)酯酶與羧酸酯酶活性的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（1）：97-100.

［4］Gomme P T，Mc Cann K B，Bertolini J.Transferrin：structure，function and potential therapeutic actions ［J］.Drug Discov Today，2005（10）：267-273.

［5］Brock J H.Transferrins，Metalloproteins［M］.Hongkong：Machillan Press，1985：183.

［6］Aisen P，Listowsky I.Iron transport and storage proteins.Ann.Rev.Biochem［J］.1980，49：357-393.

［7］Wang J，Chen G，F(xiàn)ilebeen C，et al.Insights on regulation and function of the iron regulatory protein 1 （IRP1）［J］.Hemoglobin，2008，32（1）：109-115.

［8］Ampasala D R，Zheng S C，Retnakaran A，et al.Cloning and expression of a putative transferrin cDNA of the spruce budworm，Choristoneura fumiferana［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34：493-500.

［9］Kim J，Kim Y.A viral histone H4 suppresses expression of a transferrin that plays a role in the immune response of the diamondback moth，Plutella xylostella［J］.Insect Molecular Biology，2010，19 （4），567-574.

［10］Zhang L，Shang Q，Lu Y，et al.A transferrin gene associated with development and 2-tridecanone tolerance in Helicoverpa armigera［J］.Insect Molecular Biology，2015，24（2）：155-166.

［11］Sonoda S，Maruyama T，Izumi Y，et al.Molecular cloning，nucleotide sequence and gene expression of a transferring gene from the rice stem borer，Chilo suppressalis Walker（Lepidoptera：Crambidae）［J］.Appl.Entomol.Zool.，2004，39（3）：463-468.

［12］王霄，譚文彬，程鵬，等.三種品系白紋伊蚊轉(zhuǎn)鐵蛋白基因表達(dá)量的比較分析.國(guó)外醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)地理分冊(cè)［J］.2011，32（3）：182-187.

［13］吳松泉，王光麗，周武，等.淡色庫(kù)蚊轉(zhuǎn)鐵蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其抑菌活性的初步研究［J］.2014，32（1）：38-41.

［14］Zhou G L，Velasquez L S，Geiser D L，et al.Differential regulation of transferrin 1 and 2 in Aedes aegypti［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2009，39：234-244.

［15］Harizanova N，Georgieva T，Dunkov B C，et al.Aedes aegypti transferrin.Gene structure，expression pattern，and regulation［J］.Insect Molecular Biology，2005，14（1）：79-88

［16］Guz N，Attardo G M，Wu Y，et al.Molecular aspects of transferring expression in the tsetse fly（Glossina morsitans morsitans）［J］.Journal of Insect Physilogy，2007，53：715-723.

［17］do Nascimento A M，Cuvillier-Hot V，Barchuk A R，et al.Honey bee（Apis mellifera） transferringene structure and the role of ecdysteroids in the developmental regulation of its expression［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34 ：415-424.

［18］Valles S M，Pereira R M.Developmental expression of a transferrin in the red imported fire ant，solenopsis invicta［J］.Florida Entomologist，2005，88（4）：541-543.

［19］鄭斌，詹希美.信號(hào)肽序列及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通訊，2005，16（3）：296-298.

［20］龔曉林，張潔，李顯航，等.家蠅轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的克隆和生物信息學(xué)分析［J］.生物信息學(xué)，2012，10 （4）：234-237.

［21］Lambert L A，Perri H，Halbrooks P J，et al.Evolution of the transferrin family：conservation of residues associated with iron and anion binding［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2005，142 （2）：129-41.

［22］Chatilata，Gehars.Phosphorylation of T cell membrane proteins by activators of protein kinases［J］.J Immunol，1988，140（12）：4308-4314.

［23］Qian Z M，Li H Y，Sun H Z，et al.Targeted drug delivery via the transferring receptorm ediated endocytosis pathway［J］.Pharm acological Reviews，2002 （4）：561-587.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

Cloning and bioinformatics analysis of transferring gene of Monochamus alternatus

CAI Zi-ling，LIU Qi-si，LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Abstracts：Transferrin，a non-heme iron beta1 globulin，is widely distributed in vertebrate and invertebrate animals.The gene of transferrin of Monochamus alternatus （GenBank accession number is KU213914） was cloned and named as MaTf in this study.The whole length of MaTf was 2 549 bp，including 2 178 bp open reading frame （ORF） and 371 bp non-encoding region with a tail signal.Bioinformatics methods were used to analyze the characteristics of MaTf.The results showed that MaTf was a stable protein with molecular weight of 80 ku and isoelectric point of 7.36.There was a signal peptide，one glycosylation site，and 43 phoshorylaton sites in MaTf.The transmembrane domain structure was not found.Random curls，alpha helix （21.52%） and beta extension structure （24%） existed in the secondary structure，forming three sections of coiled coil.MaTf was a hydrophilic protein with TR_FER structures in the N and C terminals.

Monochamus alternatus；transferrin；bioinformatics；domain

S476.9；Q789

A

1004-874X（2016）04-0117-07

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.023

2015-12-19

廣東省自然科學(xué)基金（1414050001666）

蔡紫玲（1992-），女，在讀碩士生，E-mail:1274800271@qq.com

林同（1969-），男，博士，副教授，E-mail: lintong@scau.edu.cn