• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析

    2016-08-05 09:54:50蔡紫玲劉琪司
    廣東農業(yè)科學 2016年4期
    關鍵詞:分析

    蔡紫玲,劉琪司,林 同

    (華南農業(yè)大學林學與風景園林學院,廣東 廣州 510642)

    松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析

    蔡紫玲,劉琪司,林 同

    (華南農業(yè)大學林學與風景園林學院,廣東 廣州 510642)

    轉鐵蛋白是一類非血紅素結合鐵的β1-球蛋白,廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物體內??寺×怂赡炫^D鐵蛋白基因(登錄號:KU213914),命名為MaTf,其核苷酸序列全長為2 549 bp,包含一個2 178 bp的開放閱讀框(ORF)和一個371 bp的帶有加尾信號的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。采用生物信息學方法分析MaTf的編碼蛋白,結果顯示:松墨天牛轉鐵蛋白分子量約為80 ku,等電點為7.36,為穩(wěn)定蛋白,有信號肽,不含跨膜結構域,有1個糖基化位點,有平均分布在整條肽鏈的43個磷酸化位點。二級結構多為隨機卷曲,僅有21.52%α螺旋,24%β片層(延伸鏈)結構,能形成三段卷曲螺旋,為親水性蛋白,N端和C端各有1個TR_FER結構域。

    松墨天牛;轉鐵蛋白;生物信息學;結構域

    蔡紫玲,劉琪司,林同.松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析[J].廣東農業(yè)科學,2016,43(4):117-123.

    松墨天牛(Monochamus alternatus)是毀滅性病害松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的主要媒介昆蟲,也是松樹的重要蛀干害蟲。松墨天牛的寄主植物多為松屬(Pinus)植物,包括黑松(Pinus thunbergii)、馬尾松(Pinus massoniana)、云南松(Pinus yunnanensis)、赤松(Pinus densiflora)等[1],也可危害冷杉屬(Abies)、黃杉屬(Pseudotsuga)、落葉松屬(Larix)、鐵杉屬(Tsuga)和雪松屬(Cedrus)等[2]。另外,松墨天牛分布廣泛,已成為國內南方松林最具危險性的天牛[3]。

    轉鐵蛋白(Transferrin),又稱為運鐵蛋白、鐵傳遞蛋白、嗜鐵蛋白、鐵糖蛋白,是一類非血紅素結合鐵的β1-球蛋白,廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物體內[4]。轉鐵蛋白為單鏈糖基化蛋白,相對分子質量約為70~80 ku,等電點一般呈酸性,糖基約占6%,在N端和C端各有一個高同源性的球形結構域,每個結構域含有1個可逆性結合Fe3+離子位點和1個陰離子結合位點[5]。由于轉鐵蛋白具有螯合鐵離子的能力,因此轉鐵蛋白主要負責輸送鐵離子到紅細胞作為合成血紅蛋白使用,或者運輸?shù)綑C體內其他需鐵的部位[6]。另外,鐵離子是細菌生長的必要因子,因此轉鐵蛋白也能夠抗菌殺菌,有自我保護的抗病作用[7]。

    在昆蟲綱中,有關轉鐵蛋白的研究報道有鱗翅目的云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)[8]、小菜蛾(Plutella xylostella)[9]、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)[10]、水稻二化螟(Chilo suppressalis Walker)[11],雙翅目的白紋伊蚊(Aedes albopictus)[12]、淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)[13]、埃及伊蚊(Aedes aegypti)[14-15]、刺舌蠅 (Glossina morsitans)[16],膜翅目的蜜蜂(Apis mellifera)[17]、紅火蟻[18](Solenopsis invicta Buren)。但尚未有相關鞘翅目昆蟲轉鐵蛋白的報道。本研究成功克隆了松墨天牛轉鐵蛋白基因cDNA序列全長,并分析其核苷酸序列基本特征及其推導氨基酸序列的理化特性、信號肽、疏水性、跨膜結構、二級結構、結構功能等,為研究昆蟲轉鐵蛋白分子特征提供依據(jù),也為深進一步研究昆蟲轉鐵蛋白與抗藥性機制提供了分子依據(jù)。

    1  材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 供試天牛 松墨天牛在廣州市從化區(qū)馬尾松次生林誘捕所得,將整只成蟲經(jīng)液氮迅速冷凍后,置于-80℃冰箱保存。

    1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit II總RNA試劑盒購于OMEGA公司;3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒、pMD20-T Vector、E.coli DH5 α Competent Cells購自TaKaRa公司;通用型DNA純化回收試劑盒為天根生物有限公司產品;LB培養(yǎng)基配置試劑(Yeeast Extract、Tryptone Powder、NaCl)、IPTG及X-Gal等為上海生工生物工程有限公司產品。

    1.2 松墨天牛轉鐵蛋白基因cDNA的克隆

    1.2.1 總RNA提取 取約20 mg松墨天牛成蟲樣本,加液氮研磨成粉末狀,根據(jù)RNA抽提試劑盒(OMEGA公司)說明書進行總RNA提取操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量,經(jīng)微量紫外分光光度儀(Nanodrop 2000)檢測RNA濃度后,置于-80℃冰箱保存。

    1.2.2 引物設計 從實驗室構建的松墨天牛cDNA文庫中篩選含有完整5'端的轉鐵蛋白基因序列,采用引物設計軟件Primer premier 5.0,根據(jù)引物設計原則設計3'RACE引物:Outer:5'- GTCACACAGGAATAGGGCG-3',Inner:5'-GGAAGAGCAAAGGCGGACG-3'。

    1.2.3 松墨天牛轉鐵蛋白3'RACE擴增 以總RNA反轉錄的cDNA為模板,以特異性引物Outer 和Inner為引物進行巢式PCR,Outer PCR反應體系:3'RACE Outer Primer(10 μmol/L) 2 μL,10 ×LA PCR Buffer II(Mg2+Free)4 μL,MgCl2(25 mmol/L) 3 μL,cDNA 3 μL,1×cDNA Dilution Buffer II 7 μL,Gene Specific Outer Prier(10 μmol/L) 2 μL,TaKaRaLA Taq? (5 U/μL) 0.25 μL,加水至50 μL。PCR程序:94℃ 3 min;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min,20個循環(huán);72℃ 10 min。

    Inner PCR反應體系:dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 8 μL,10×LA PCR Buffer II (Mg2+Free)5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 5 μL,TaKaRaLA Taq? (5 U/μL) 0.5 μL,3'RACE Inner Primer(10 μmol/L) 2 μL,1st PCR產物 1 μL,Gene Specific Inner Primer(10 μmol/L) 2 μL,加水至50 μL。PCR反應程序:94℃ 3 min;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min,30個循環(huán);72℃ 10 min。

    1.2.4 DNA純化及T-載體連接 3'RACE產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,切下含目的片段的電泳條帶,按通用型DNA純化回收試劑盒說明書進行Inner PCR產物回收。取純化的Inner PCR產物4 μL,1 μL pMD20-T Vetor,DNA Ligation Mix 5 μL,加dH2O至10 μL進行T-載體連接,放在4℃冰箱24 h。

    1.2.5 重組質粒轉化及序列測定 取T-載體連接產物4 μL轉化到50 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)12 h。提取白色菌落的單克隆體進行菌落PCR鑒定,再挑取4個陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

    1.3 序列分析

    1.3.1 松墨天牛轉鐵蛋白基因編碼蛋白的理化性質分析 測定序列拼接完成后,經(jīng)NCBI的BLASTp程序鑒定為一種松墨天牛轉運蛋白基因的序列,將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號:KU213914)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTp程序、ORF Finder(Open Reading Frame Finder)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)以及ProtParm(http://web.expasy.org/protparam/)對序列進行在線分析,確定轉鐵蛋白基因序列的編碼區(qū)并預測其編碼蛋白質的理化性質,進行穩(wěn)定性和半衰期的評估;信號肽預測采用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)在線分析;跨膜結構域分析利用在線工具TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);糖基化位點采用DictyOGlyc 1.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)預測;磷酸化位點采用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測;疏水性采用Expasy提供的在線工具ProtScale程序(http://web.expasy.org/protscale/)分析。

    1.3.2 松墨天牛轉鐵蛋白基因編碼蛋白的結構及功能分析 利用GOR在線工具(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)完成蛋白質的二級結構預測,并通過COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)分析其卷曲螺旋結構;利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線進行同源建模;利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)對其結構域進行預測。

    1.3.3 基于昆蟲轉鐵蛋白基因推導的氨基酸序列分析 采用軟件DNAMAN對松墨天牛與其他12種昆蟲轉鐵蛋白氨基酸序列進行同源性比對,而系統(tǒng)發(fā)育樹則通過Clustalx和MEGA4軟件(NJ法)構建。

    2 結果與分析

    2.1 松墨天牛轉鐵蛋白核苷酸序列組成

    以松墨天牛cDNA為模板,采用3'RACE克隆得到轉鐵蛋白cDNA序列,其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列已提交GenBank(登錄號:KU213914),命名為MaTf。MaTf的全長cDNA序列有2 549 bp,包含一個2 178 bp的開放閱讀框(ORF)和一個371 bp的帶有加尾信號的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。

    2.2 MaTf理化性質

    MaTf共有725個氨基酸,計算分子量約為80 ku,分子式為C3561H5611N967O1080S33,等電點為7.36,預測MaTf是一類穩(wěn)定蛋白,這些為MaTf蛋白質的分離和純化提供了依據(jù)。

    2.3 昆蟲轉運蛋白氨基酸序列比對

    經(jīng)過 B L A S T p分析松墨天牛的轉鐵蛋白,搜索并篩選了 1 2種昆蟲的轉鐵蛋白,分別為Apriona germari(AAW70172.1)、Tribolium castaneum(XP_001808066.1)、Protaetia brevitarsis(ABI31834.1)、Zootermopsis nevadensis(KDR19744.1)、Mastotermes darwiniensis(AAN03488.1)、Romalea microptera (AAQ62963.2)、Nephotettix cincticeps (BAQ94504.1) 、Papilio xuthus (KPI94090.1)、Apis dorsata (XP_006608191.1)、Aedes aegypti (XP_001647578.1)、Drosophila melanogaster (AAC67389.1)、Glossina morsitans morsitans (AAM46784.3)。使用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)松墨天牛與桑天牛(Apriona germari)的同源性最高,氨基酸一致性在90%以上;與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、白星花金龜(Protaetia brevitarsis)的同源性較高,氨基酸一致性在70%以上,與其余昆蟲的同源性較低,氨基酸一致性在43%~59%之間(圖1)。

    2.4 基于昆蟲轉運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

    采用Clustalx和MEGA4對松墨天牛和7個目12種昆蟲的轉鐵蛋白氨基酸序列建立系統(tǒng)進化樹(圖2),結果顯示,桑天牛、赤擬谷盜、白星花金龜同屬于鞘翅目,與松墨天牛的親緣關系較為接近,云南野生大蜜蜂、柑桔鳳蝶等與松墨天牛的親緣關系最遠。

    2.5 信號肽、跨膜結構域及翻譯后修飾分析

    信號肽位于初生蛋白的N端,一般由15~30個氨基酸殘基組成,是一段能引導新合成肽鏈轉移到內質網(wǎng)上的多肽[19]。經(jīng)過Singal IP 4.1在線分析,以0.5分為閾值,C分值0.715在20位點,Y分值0.780在20位點,S分值0.956在1位點,信號肽計算結果為“Yes”,即表示松墨天牛轉鐵蛋白N端有信號肽,為分泌蛋白。

    TMHMM采用馬氏模型,綜合跨膜區(qū)螺旋長度、親疏水性和膜蛋白拓撲學等特性,能有效地預測肽鏈的跨膜區(qū)及膜內外區(qū)。根據(jù)TMHMM Server分析,結果顯示松墨天牛轉鐵蛋白不含跨膜結構域,且整條肽鏈都位于膜外。

    采用DictyOGlyc在線軟件對MaTf氨基酸序列的糖基化位點進行分析,發(fā)現(xiàn)MaTf含有1個糖基化位點,位于196位,為絲氨酸。

    圖1 松墨天牛與12種昆蟲的轉運蛋白氨基酸序列的同源比對

    NetPhos2.0 Server磷酸化位點分析MaTf,結果發(fā)現(xiàn)磷酸化位點在整條肽鏈上的分布較平均,計算分值>0.5的有:絲氨酸(Ser)磷酸化位點20個,蘇氨酸(Thr)磷酸化位點8個,酪氨酸(Tyr)磷酸化位點15個。

    2.6 二級結構、卷曲螺旋及疏水性分析

    GOR在線預測松墨天牛轉鐵蛋白的二級結構,結果(圖3)表明,α螺旋占21.52%,β片層(延伸鏈)結構占24%,隨機卷曲最多,占 54.48%,并不存在β轉角等其他結構。根據(jù)COILS Server分析,MaTf有3段序列可形成卷曲螺旋。MaTf疏水性最大分值為3.456、在第8位點,而最小分值為-2.811、在第27位點,為親水蛋白。

    圖2 基于松墨天牛與12種昆蟲轉運蛋白構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖3 MaTf二級結構GOR分析

    2.7 同源建模與功能結構域分析

    提交MaTf氨基酸序列到SWISS-MODEL在線軟件進行分析,結果顯示該蛋白的三維結構分子(圖4)有明顯的兩個分區(qū)折疊。

    根據(jù)SMART在線工具分析,MaTf存在兩個功能結構域,為TR_FER(圖5)。第1個功能結構域位于32~378個氨基酸殘基,第2個機構域位于379~725個氨基酸殘基。

    圖4 MaTf的同源建模SWISS-MODEL分析

    圖5 MaTf的結構功能域SMART分析

    3 討論

    作為脊椎動物和無脊椎動物體內轉運鐵離子的主要蛋白,轉運蛋白在成紅細胞合成血紅蛋白過程中起重要作用,表現(xiàn)在其結構上的保守性。本試驗克隆了松墨天牛轉鐵蛋白(MaTf)基因cDNA的全長序列,其推導的氨基酸序列長達725個氨基酸殘基。通過生物信息學分析,MaTf含有信號肽,不含跨膜結構域,二級結構大部分為隨機卷曲,21.52%為α螺旋,24%為β片層(延伸鏈)結構,在300~600之間能形成兩段卷曲螺旋。根據(jù)SMART對MaTf的功能結構域分析,MaTf有兩個TR_FER功能結構域,經(jīng)過比對其他昆蟲序列,發(fā)現(xiàn)除了雙翅目昆蟲有且僅有1個TR_FER結構域外[20],其他鞘翅目、等翅目、直翅目、半翅目、膜翅目的昆蟲均有兩個TR_FER。通過比對人轉鐵蛋白序列,得知人轉鐵蛋白也含有兩個TR_FER結構域。轉鐵蛋白這兩個功能類似的結構域有一定的同源性,都保留了結合鐵原子和碳酸陰離子的氨基酸位點,被認為是機體進化過程中以基因復制方式形成的,可加強對鐵離子的轉運能力[21-22]。由于鞘翅目昆蟲比雙翅目昆蟲更為進化,前者比后者在C端多1個TR_FER結構域,可能發(fā)揮更豐富的生理功能。

    由于轉鐵蛋白具有抗菌殺菌的功能,對大腸埃希菌生長有明顯抑制作用,因此在昆蟲中可作為新的抗性檢測的基因靶標[13]。2011年王霄等[12]驗證了轉鐵蛋白基因在白紋伊蚊溴氰菊酯抗性品系高表達,推測該基因可能與蚊蟲抗性機制相關。人轉鐵蛋白N端半分子能在體外表達并具有活性,因此在醫(yī)學界被作為藥物運輸載體應用于臨床階段[23]。目前未見有關于昆蟲轉鐵蛋白基因外源表達的研究報道,將來可利用該基因進行昆蟲抗性監(jiān)測。

    [1]Bartlett A C.Genetic changes during insect domestication.advances and challenges in insects rearing[M].ARS,USDA New Orlean,1984:1-8.

    [2]楊建霞.松墨天牛對寄主植物的適應性與松材線蟲危害特性的研究[D].南京:南京農業(yè)大學,2008.

    [3]楊建霞,郝德君,周曙東,等.寄主植物對松墨天牛的營養(yǎng)效應及對體內酯酶與羧酸酯酶活性的影響[J].林業(yè)科學,2009,45(1):97-100.

    [4]Gomme P T,Mc Cann K B,Bertolini J.Transferrin:structure,function and potential therapeutic actions [J].Drug Discov Today,2005(10):267-273.

    [5]Brock J H.Transferrins,Metalloproteins[M].Hongkong:Machillan Press,1985:183.

    [6]Aisen P,Listowsky I.Iron transport and storage proteins.Ann.Rev.Biochem[J].1980,49:357-393.

    [7]Wang J,Chen G,F(xiàn)ilebeen C,et al.Insights on regulation and function of the iron regulatory protein 1 (IRP1)[J].Hemoglobin,2008,32(1):109-115.

    [8]Ampasala D R,Zheng S C,Retnakaran A,et al.Cloning and expression of a putative transferrin cDNA of the spruce budworm,Choristoneura fumiferana[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2004,34:493-500.

    [9]Kim J,Kim Y.A viral histone H4 suppresses expression of a transferrin that plays a role in the immune response of the diamondback moth,Plutella xylostella[J].Insect Molecular Biology,2010,19 (4),567-574.

    [10]Zhang L,Shang Q,Lu Y,et al.A transferrin gene associated with development and 2-tridecanone tolerance in Helicoverpa armigera[J].Insect Molecular Biology,2015,24(2):155-166.

    [11]Sonoda S,Maruyama T,Izumi Y,et al.Molecular cloning,nucleotide sequence and gene expression of a transferring gene from the rice stem borer,Chilo suppressalis Walker(Lepidoptera:Crambidae)[J].Appl.Entomol.Zool.,2004,39(3):463-468.

    [12]王霄,譚文彬,程鵬,等.三種品系白紋伊蚊轉鐵蛋白基因表達量的比較分析.國外醫(yī)學醫(yī)學地理分冊[J].2011,32(3):182-187.

    [13]吳松泉,王光麗,周武,等.淡色庫蚊轉鐵蛋白在畢赤酵母中的分泌表達及其抑菌活性的初步研究[J].2014,32(1):38-41.

    [14]Zhou G L,Velasquez L S,Geiser D L,et al.Differential regulation of transferrin 1 and 2 in Aedes aegypti[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2009,39:234-244.

    [15]Harizanova N,Georgieva T,Dunkov B C,et al.Aedes aegypti transferrin.Gene structure,expression pattern,and regulation[J].Insect Molecular Biology,2005,14(1):79-88

    [16]Guz N,Attardo G M,Wu Y,et al.Molecular aspects of transferring expression in the tsetse fly(Glossina morsitans morsitans)[J].Journal of Insect Physilogy,2007,53:715-723.

    [17]do Nascimento A M,Cuvillier-Hot V,Barchuk A R,et al.Honey bee(Apis mellifera) transferringene structure and the role of ecdysteroids in the developmental regulation of its expression[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2004,34 :415-424.

    [18]Valles S M,Pereira R M.Developmental expression of a transferrin in the red imported fire ant,solenopsis invicta[J].Florida Entomologist,2005,88(4):541-543.

    [19]鄭斌,詹希美.信號肽序列及其在蛋白質表達中的應用[J].生物技術通訊,2005,16(3):296-298.

    [20]龔曉林,張潔,李顯航,等.家蠅轉鐵蛋白基因的克隆和生物信息學分析[J].生物信息學,2012,10 (4):234-237.

    [21]Lambert L A,Perri H,Halbrooks P J,et al.Evolution of the transferrin family:conservation of residues associated with iron and anion binding[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2005,142 (2):129-41.

    [22]Chatilata,Gehars.Phosphorylation of T cell membrane proteins by activators of protein kinases[J].J Immunol,1988,140(12):4308-4314.

    [23]Qian Z M,Li H Y,Sun H Z,et al.Targeted drug delivery via the transferring receptorm ediated endocytosis pathway[J].Pharm acological Reviews,2002 (4):561-587.

    (責任編輯 崔建勛)

    Cloning and bioinformatics analysis of transferring gene of Monochamus alternatus

    CAI Zi-ling,LIU Qi-si,LIN Tong
    (College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

    Abstracts:Transferrin,a non-heme iron beta1 globulin,is widely distributed in vertebrate and invertebrate animals.The gene of transferrin of Monochamus alternatus (GenBank accession number is KU213914) was cloned and named as MaTf in this study.The whole length of MaTf was 2 549 bp,including 2 178 bp open reading frame (ORF) and 371 bp non-encoding region with a tail signal.Bioinformatics methods were used to analyze the characteristics of MaTf.The results showed that MaTf was a stable protein with molecular weight of 80 ku and isoelectric point of 7.36.There was a signal peptide,one glycosylation site,and 43 phoshorylaton sites in MaTf.The transmembrane domain structure was not found.Random curls,alpha helix (21.52%) and beta extension structure (24%) existed in the secondary structure,forming three sections of coiled coil.MaTf was a hydrophilic protein with TR_FER structures in the N and C terminals.

    Monochamus alternatus;transferrin;bioinformatics;domain

    S476.9;Q789

    A

    1004-874X(2016)04-0117-07

    10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.023

    2015-12-19

    廣東省自然科學基金(1414050001666)

    蔡紫玲(1992-),女,在讀碩士生,E-mail:1274800271@qq.com

    林同(1969-),男,博士,副教授,E-mail: lintong@scau.edu.cn

    猜你喜歡
    分析
    禽大腸桿菌病的分析、診斷和防治
    隱蔽失效適航要求符合性驗證分析
    電力系統(tǒng)不平衡分析
    電子制作(2018年18期)2018-11-14 01:48:24
    電力系統(tǒng)及其自動化發(fā)展趨勢分析
    經(jīng)濟危機下的均衡與非均衡分析
    對計劃生育必要性以及其貫徹實施的分析
    GB/T 7714-2015 與GB/T 7714-2005對比分析
    出版與印刷(2016年3期)2016-02-02 01:20:11
    網(wǎng)購中不良現(xiàn)象分析與應對
    中西醫(yī)結合治療抑郁癥100例分析
    偽造有價證券罪立法比較分析
    美国免费a级毛片| 一本精品99久久精品77| 俺也久久电影网| 久久久久九九精品影院| 老鸭窝网址在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av美国av| 两个人免费观看高清视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老司机在亚洲福利影院| 成人一区二区视频在线观看| xxx96com| 高清在线国产一区| 国产片内射在线| 级片在线观看| 亚洲avbb在线观看| 成人国语在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 两个人免费观看高清视频| 丰满的人妻完整版| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产又爽黄色视频| 久久久国产欧美日韩av| 久久久国产欧美日韩av| 日韩欧美国产一区二区入口| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 91字幕亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 不卡av一区二区三区| 岛国在线观看网站| av免费在线观看网站| 久热爱精品视频在线9| 欧美成人午夜精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 一区二区三区激情视频| 国产一区二区三区视频了| 男人舔奶头视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品久久久av美女十八| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 看免费av毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 99精品在免费线老司机午夜| 精品一区二区三区av网在线观看| 怎么达到女性高潮| 日日夜夜操网爽| 国产熟女xx| 亚洲一区中文字幕在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日日爽夜夜爽网站| 成人精品一区二区免费| av电影中文网址| www日本在线高清视频| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲色图av天堂| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 在线观看免费视频日本深夜| 妹子高潮喷水视频| 999久久久国产精品视频| 国产精品影院久久| 国产在线观看jvid| 日韩欧美三级三区| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美成人性av电影在线观看| 成人手机av| 人人妻人人澡人人看| 首页视频小说图片口味搜索| 高清在线国产一区| 怎么达到女性高潮| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 黄色 视频免费看| 亚洲 国产 在线| 男女午夜视频在线观看| 91成人精品电影| 99re在线观看精品视频| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产亚洲欧美在线一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 国产高清有码在线观看视频 | 男人舔女人下体高潮全视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 视频区欧美日本亚洲| 国产亚洲精品久久久久5区| av视频在线观看入口| 制服诱惑二区| 久久这里只有精品19| 91麻豆av在线| 午夜福利成人在线免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品野战在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| netflix在线观看网站| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜视频精品福利| 精华霜和精华液先用哪个| 草草在线视频免费看| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 麻豆一二三区av精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 色老头精品视频在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本五十路高清| 久热这里只有精品99| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲中文字幕日韩| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久热这里只有精品99| 90打野战视频偷拍视频| 一级片免费观看大全| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 可以在线观看毛片的网站| 美国免费a级毛片| 精品国产亚洲在线| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲第一av免费看| 天堂√8在线中文| 久久久久久久精品吃奶| 两性夫妻黄色片| xxxwww97欧美| 两个人看的免费小视频| 韩国av一区二区三区四区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 视频区欧美日本亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 一a级毛片在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲一区中文字幕在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 一a级毛片在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 中亚洲国语对白在线视频| 国产成人av教育| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日日爽夜夜爽网站| 少妇 在线观看| 亚洲美女黄片视频| 深夜精品福利| 久久亚洲真实| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产一区二区三区视频了| 午夜福利一区二区在线看| 久久中文字幕一级| av福利片在线| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成人欧美| 国产免费av片在线观看野外av| or卡值多少钱| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲第一电影网av| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产免费男女视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 变态另类丝袜制服| 日韩高清综合在线| 午夜福利欧美成人| 久热这里只有精品99| 极品教师在线免费播放| 制服诱惑二区| 国产精品永久免费网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| www.999成人在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 国产精品一区二区精品视频观看| 精品人妻1区二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 可以在线观看毛片的网站| 黄色 视频免费看| 自线自在国产av| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 欧美色视频一区免费| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品一区二区三区av网在线观看| 成年版毛片免费区| 成人三级黄色视频| av有码第一页| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产av一区二区精品久久| 日本免费a在线| 久久这里只有精品19| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产黄片美女视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| or卡值多少钱| 欧美乱妇无乱码| 日韩欧美国产在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 身体一侧抽搐| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清有码在线观看视频 | 露出奶头的视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 熟女电影av网| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费搜索国产男女视频| 女人被狂操c到高潮| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲 国产 在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 狠狠狠狠99中文字幕| 俺也久久电影网| 人妻久久中文字幕网| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲久久久国产精品| 免费搜索国产男女视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 色哟哟哟哟哟哟| 宅男免费午夜| 一级片免费观看大全| 老司机午夜福利在线观看视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 最好的美女福利视频网| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美色视频一区免费| 亚洲国产欧美网| 成年版毛片免费区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄片大片在线免费观看| 国产片内射在线| 曰老女人黄片| 亚洲美女黄片视频| videosex国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 宅男免费午夜| 桃红色精品国产亚洲av| 午夜久久久久精精品| 一二三四在线观看免费中文在| 久久亚洲精品不卡| 午夜福利在线观看吧| 国产片内射在线| 亚洲熟女毛片儿| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 1024香蕉在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 最新美女视频免费是黄的| 欧美成人午夜精品| 亚洲av美国av| 一本一本综合久久| 日本一本二区三区精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 黄色女人牲交| 大香蕉久久成人网| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 91av网站免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久精品91无色码中文字幕| 九色国产91popny在线| 成人av一区二区三区在线看| 黄色视频不卡| 成人免费观看视频高清| 国产成人影院久久av| 观看免费一级毛片| 身体一侧抽搐| 国产精品九九99| 精品无人区乱码1区二区| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久av美女十八| 日韩av在线大香蕉| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三 | av超薄肉色丝袜交足视频| 一本精品99久久精品77| 日本黄色视频三级网站网址| АⅤ资源中文在线天堂| 99热6这里只有精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久热这里只有精品99| 久久午夜亚洲精品久久| 窝窝影院91人妻| 大型黄色视频在线免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 老司机午夜福利在线观看视频| av免费在线观看网站| 天堂动漫精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美日韩精品网址| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精华国产精华精| 久久热在线av| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久久久久国产a免费观看| 热99re8久久精品国产| 亚洲国产欧美网| 在线视频色国产色| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人18禁在线播放| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一a级毛片在线观看| 久久亚洲真实| 欧美大码av| 国产成人欧美| 色综合站精品国产| 亚洲免费av在线视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 窝窝影院91人妻| 国产精品久久久av美女十八| 夜夜爽天天搞| 怎么达到女性高潮| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品一区av在线观看| 夜夜爽天天搞| 我的亚洲天堂| 一区二区三区高清视频在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人国语在线视频| 国产乱人伦免费视频| 日韩三级视频一区二区三区| 国产亚洲欧美98| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 天堂动漫精品| 免费在线观看亚洲国产| 成人永久免费在线观看视频| 在线观看一区二区三区| 俺也久久电影网| 国产成人精品久久二区二区免费| 无遮挡黄片免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品永久免费网站| 999精品在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美日韩黄片免| 51午夜福利影视在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 深夜精品福利| 美女 人体艺术 gogo| 欧美性长视频在线观看| 免费在线观看完整版高清| 久久久国产成人精品二区| 精品国产亚洲在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| √禁漫天堂资源中文www| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 免费在线观看影片大全网站| 久久中文字幕人妻熟女| 久久伊人香网站| 日韩精品青青久久久久久| 大型av网站在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲自拍偷在线| 制服丝袜大香蕉在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲美女黄片视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 看片在线看免费视频| av在线播放免费不卡| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品亚洲美女久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产单亲对白刺激| 黄色 视频免费看| 性色av乱码一区二区三区2| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 韩国精品一区二区三区| 69av精品久久久久久| 国产精品电影一区二区三区| avwww免费| 国产麻豆成人av免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品影院6| 午夜福利成人在线免费观看| 午夜福利高清视频| 亚洲av熟女| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老司机靠b影院| 免费搜索国产男女视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 两个人看的免费小视频| 国产在线观看jvid| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产久久久一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看www视频免费| 午夜福利免费观看在线| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久中文字幕一级| 国内精品久久久久精免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 白带黄色成豆腐渣| 欧美性猛交黑人性爽| 淫妇啪啪啪对白视频| 99re在线观看精品视频| bbb黄色大片| 中文亚洲av片在线观看爽| а√天堂www在线а√下载| 99国产精品99久久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | av超薄肉色丝袜交足视频| 精品国产国语对白av| 亚洲男人天堂网一区| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品 国内视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品在线观看二区| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线观看免费视频日本深夜| 国产高清有码在线观看视频 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 18禁观看日本| 禁无遮挡网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜免费鲁丝| 久久亚洲精品不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 韩国精品一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 亚洲专区国产一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 午夜日韩欧美国产| 日韩三级视频一区二区三区| xxx96com| 久久精品国产清高在天天线| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利18| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲熟女毛片儿| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产精品合色在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产1区2区3区精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人18禁在线播放| 99re在线观看精品视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 啦啦啦 在线观看视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色女人牲交| www国产在线视频色| 日本五十路高清| 国产国语露脸激情在线看| 999精品在线视频| 香蕉国产在线看| 欧美精品亚洲一区二区| av视频在线观看入口| 欧美乱色亚洲激情| 久久中文字幕一级| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产午夜精品久久久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲美女黄片视频| aaaaa片日本免费| 亚洲成人久久性| 久久久国产成人免费| 不卡一级毛片| 大香蕉久久成人网| 成人特级黄色片久久久久久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲五月天丁香| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99久久无色码亚洲精品果冻| 手机成人av网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲国产精品合色在线| 51午夜福利影视在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线国产一区二区在线| 91成年电影在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久国产精品麻豆| 9191精品国产免费久久| 免费高清在线观看日韩| 热re99久久国产66热| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 丁香六月欧美| 国产黄a三级三级三级人| 男女那种视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久久久久免费视频了| 波多野结衣高清作品| 国产成人av激情在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费在线观看日本一区| 在线天堂中文资源库| 一级毛片精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产欧美日韩精品亚洲av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 变态另类丝袜制服| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| or卡值多少钱| 一本大道久久a久久精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 婷婷精品国产亚洲av| 久久精品成人免费网站| 在线观看免费视频日本深夜| 在线观看免费日韩欧美大片| 妹子高潮喷水视频| 1024手机看黄色片| www.自偷自拍.com| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲国产精品999在线| 99热这里只有精品一区 | 亚洲成av人片免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲精品在线美女| 在线观看免费午夜福利视频| 嫩草影视91久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产欧洲综合997久久, | АⅤ资源中文在线天堂| 成人欧美大片| 听说在线观看完整版免费高清| 搞女人的毛片| 亚洲精华国产精华精| 久久精品91蜜桃| 亚洲成人久久爱视频| 免费看a级黄色片| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 一本精品99久久精品77| 亚洲精品粉嫩美女一区| 色播在线永久视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人影院久久av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久这里只有精品19| 成人三级黄色视频| 亚洲第一电影网av| 国产av不卡久久| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美黑人巨大hd| 999久久久精品免费观看国产| 国产成人av教育| 美女午夜性视频免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 一级毛片高清免费大全| а√天堂www在线а√下载| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| av福利片在线| 亚洲国产精品999在线| 黄色丝袜av网址大全| 欧美激情极品国产一区二区三区|