兩株廣西地不容內(nèi)生真菌的抑菌活性研究

周秋艷，卿 朕，駱海玉，周獻(xiàn)青，池通海，鄧業(yè)成

（珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點實驗室/廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

兩株廣西地不容內(nèi)生真菌的抑菌活性研究

周秋艷，卿 朕，駱海玉，周獻(xiàn)青，池通海，鄧業(yè)成

（珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點實驗室/廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

從廣西地不容塊根分離出白殼菌Albonectria rigidiuscula DBR-3和黑孢霉屬Nigrospora sp.DBR-5兩株內(nèi)生真菌，以15種動物病原菌和10種植物病原真菌為供試菌，對兩株內(nèi)生真菌的抑菌活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，DBR-3對動物病原菌和植物病原真菌均有抑菌活性，其發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物對12種動物病原菌的MIC為0.625～10 g/L，對10種植物病原真菌的EC50值為0.3437～7.7094 g/L。DBR-5對植物病原真菌的抑菌活性好，但對動物病原菌的抑菌活性差，DBR-5發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌的EC50值為0.0124～0.6112 g/L，明顯高于DBR-3對植物病原真菌的抑菌活性。

廣西地不容；內(nèi)生真菌；抑菌活性

周秋艷，卿朕，駱海玉，等.兩株廣西地不容內(nèi)生真菌的抑菌活性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（4）：111-116.

植物內(nèi)生真菌是在其生活史中的某階段或全部階段存在植物組織的一類多樣性豐富的微生物類群，其次級代謝產(chǎn)物中存在大量具有抗炎、抗癌、抗菌等生物活性的物質(zhì)［1］。內(nèi)生真菌和寄主植物之間的相互作用受其共生體基因和外在環(huán)境調(diào)節(jié)的控制［2］，植物內(nèi)生真菌生活于不斷受到外界環(huán)境影響的寄主植物內(nèi)，迫使內(nèi)生真菌不斷產(chǎn)生新的防御物質(zhì)與寄主植物協(xié)同進(jìn)行系統(tǒng)防御，同時，植物內(nèi)生真菌也會受到寄主植物的刺激，產(chǎn)生與寄主植物相同或者相似的次生代謝物［3］，因此內(nèi)生真菌已成為尋找新型活性物質(zhì)的重要來源［4］。廣西地不容（Stephania kwangsiensis Lo.）是廣西特有的多年生草質(zhì)落葉藤本植物，屬防己科千金藤屬山烏龜亞屬［5］，生于石灰?guī)r的石山地區(qū)，主要產(chǎn)于廣西西北部、西南部的靖西、凌云、那坡等縣，是廣西壯族等少數(shù)民族民間常用草藥。廣西地不容塊根含有豐富的生物堿，其總生物堿含量達(dá)3%～4%，具有很強的鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌作用［6-7］。研究表明，生物堿還具有其他廣泛的生理活性，如殺蟲、抗糖尿病等［8-9］。廣西地不容是生長于石灰?guī)r地區(qū)石山上的重要藥用植物，能產(chǎn)生大量具有藥用價值的生物堿，這些生物堿已被證實具有不同的生物活性，是開發(fā)新藥的天然活性物質(zhì)。廣西地不容分布范圍窄，長期生長于土壤貧脊、干旱的特殊環(huán)境中，從中分離出特殊內(nèi)生真菌并從內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)的可能性較大。目前國內(nèi)外對廣西地不容內(nèi)生菌的研究尚屬空白，因而使該植物的內(nèi)生菌資源未能得到應(yīng)用。因此，研究廣西地不容內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性對尋找新型活性物質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物內(nèi)生真菌 白殼菌Albonectria rigidiuscula DBR-3和黑孢霉屬Nigrospora sp.DBR-5：從采自廣西植物研究所的廣西地不容塊根中分離，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（ITS序列分析）技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行分類鑒定。

1.1.2 供試病原菌 供試動物病原菌15種：大腸桿菌Escherichia coli、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes、傷寒沙門氏菌Salmonella typhi、痢疾志賀氏菌Shigella dysenteriae、普通變形桿菌Proteusbacillus vulgaris、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、乙型副傷寒桿菌Bacterium paratyphosum B、炭疽桿菌Bacillus anthraci、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、藤黃微球菌Micrococcus luteus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus、巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、白色念珠菌Candida albicans，由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供。

供試植物病原真菌10種：玉米小斑病菌Bipolaris maydis、煙草黑脛病菌Phytophthora parasitica var.Nicotianae、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici、甘藍(lán)黑斑病菌Alternaria oleracea、金桔砂皮病菌Diaporthe citri、甘蔗鳳梨病菌Ceratocystis paradoxa、茶輪斑病菌Pestalotiopsis theae、貢柑鏈格孢菌Alternaria citri、水稻胡麻葉病菌Cochliobolus miyabeanus，除金桔砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供以外，其余8種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵 挑取保存的純化菌種接種于PDA平板上，待生長旺盛后，用0.4 cm打孔器在菌落平板上打取菌餅，用鑷子挑取3個菌餅，接種于裝有500 mL滅菌馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖晃2～3次。培養(yǎng)溫度為27（±1）℃，培養(yǎng)時間30d。

1.2.2 內(nèi)生真菌粗提物的制備 將內(nèi)生真菌發(fā)酵物用2層紗布過濾，分為菌餅和發(fā)酵液。得到的菌餅于60℃條件下烘干，粉碎后用5倍量的甲醇浸泡干粉，期間攪拌2～3次，24h后抽濾。浸提2次，將2次濾液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得菌餅提取物濃縮液。過濾得到的發(fā)酵液進(jìn)一步抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得發(fā)酵濃縮液。最后將菌餅提取物濃縮液和發(fā)酵濃縮液合并，蒸干溶劑，得內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物，保存于4℃冰箱中備用。

1.2.3 內(nèi)生真菌粗提物的初步分離 用液-液萃取法分離內(nèi)生真菌粗提物。先用一定量的蒸餾水溶解一定質(zhì)量粗提物，置于分液漏斗中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，合并3次萃取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

1.2.4 抑菌活性測定 （1）對動物病原菌的抑制活性測定：參考相關(guān)文獻(xiàn)采用帶毒平板法［10］。將菌種接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（若接白色念珠菌用沙氏液體培養(yǎng)基）中，37（±1）℃的水浴恒溫振蕩器培養(yǎng)12～14 h進(jìn)行活化。把樣品配成一定濃度的藥液（溶劑為丙酮和水=1∶1）。在無菌潔凈工作臺中，將1 mL藥液與9 mL熱熔牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（白色念珠菌用沙氏培養(yǎng)基）混合均勻，制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。將已活化的菌種搖勻吸取0.1 mL于9.9 mL無菌水中稀釋成菌懸液。吸取0.1 mL菌懸液，加到帶藥培養(yǎng)基上，涂布均勻。每個處理3次重復(fù)。陽性對照組用溶樣溶劑代替藥液，其他條件不變，用于觀察細(xì)菌能否正常生長。陰性對照則涂0.1 mL無菌水，其他條件不變，用于觀察培養(yǎng)基、藥液或無菌水是否污染。37 （±1）℃條件下培養(yǎng)48h后，觀察并記錄結(jié)果。

測定樣品對病原菌的MIC值時，將樣品配成系列濃度的藥液與培養(yǎng)基混合，制成系列濃度的帶毒培養(yǎng)平板。以不長菌的最低濃度作為樣品對動物病原菌的MIC值。

（2）對植物病原真菌菌絲生長的抑制活性測定：參照相關(guān)文獻(xiàn)采用菌絲生長速率法測定［11］。把樣品配成一定濃度的藥液（溶劑為丙酮和水=1∶1）。在無菌潔凈工作臺中，把1 mL藥液（對照組用溶樣溶劑代替）與9 mL熱熔PDA培養(yǎng)基混合均勻，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。在已活化的供試菌邊緣，用直徑為0.4cm的無菌打孔器切取菌餅，并使菌絲面朝下接于帶藥培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿接3個菌餅成品字形分布，每個處理3次重復(fù)。置于27（±1）℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率：

測定有效中濃度（EC50）時，配制5個系列濃度的藥液，測定各個濃度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r、EC50及EC50的95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對15種動物病原菌的抑制活性

表1 兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對15種供試動物病原菌的抑制活性

用帶毒平板法測定兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對15種動物病原菌的48h抑制活性，結(jié)果見表1。由表1可知，當(dāng)各個萃取物濃度為10g/L時，DBR-3乙酸乙酯萃取物對12種供試動物病原菌有抑制活性，正丁醇萃取物和水萃取物對15種供試動物病原菌均無抑制活性，表明抑菌物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-5的3種溶劑萃取物對15種供試動物病原菌均無抑制活性。

2.2 DBR-3乙酸乙酯萃取物對12種動物病原菌的最低抑制濃度

根據(jù)表1的結(jié)果，將DBR-3乙酸乙酯萃取物配成系列梯度濃度，制成帶毒平板，測定其對12種動物病原菌的48 h最低抑制濃度（MIC），結(jié)果見表2。由表2可知，DBR-3乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌的抑制活性最高，MIC值為0.625 g/L，對其余11種動物病原菌的MIC值為2.5-10 g/L。

表2 DBR-3乙酸乙酯萃取物對12種供試病原真菌的最低抑制濃度

2.3 兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

采用菌絲生長速率法測定濃度為5 g/L 時，兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長72 h的抑制活性，結(jié)果見表3。由表3可知，除DBR-3水萃取物對玉米小斑病菌菌絲生長具有促進(jìn)作用，兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對供試植物病原真菌菌絲生長均有抑制活性。兩種內(nèi)生真菌的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-5乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌的抑制活性明顯高于DBR-3的活性。

表3 兩株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

2.4 兩株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力

為進(jìn)一步明確兩株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，測定其乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力，結(jié)果見表4。由表4可知，DBR-3乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌的毒力最高，EC50為0.3437 g/L，對甘藍(lán)黑斑病菌的毒力最低，EC50為 7.7094 g/L，對其余8種植物病原真菌的EC50值為0.9983～5.4507 g/L。DBR-5乙酸乙酯萃取物對茶倫斑病菌的毒力最低，對玉米大斑病菌的毒力最高，EC50值分別為 0.6112 g/L 和0.0124 g/L，對其余8種植物病原真菌的EC50值為0.0200～0.5989 g/L。DBR-5乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌的毒力明顯高于DBR-3的毒力。

表4 兩株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力

3 　討論

近年來，人們對植物內(nèi)生真菌白殼屬和黑孢霉屬做了一些研究工作，發(fā)現(xiàn)具有較好的生物活性，如阮麗軍［12］從白殼屬菌株的發(fā)酵液中分離出的3個化合物對腫瘤細(xì)胞有較明顯的抑制作用，李麗等［13］從核桃葉分離出黑孢霉屬Y4 菌株對供試的8種供試病原菌抑制率均大于60%。前人對黑孢霉屬真菌的研究較多，目前已分離獲得一系列具有抗菌、抗腫瘤等活性的化合物［14-16］。表明該兩屬植物內(nèi)生真菌有較廣泛的生物活性。本研究從廣西地不容快根中分離出的兩株內(nèi)生真菌DBR-3 和DBR-5分別屬于白殼屬和黑孢霉屬真菌，對其發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性研究顯示，發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物對供試菌有不同程度的抑菌作用，DBR-3對動物病原菌和植物病原真菌均有抑制活性，抑菌譜廣，而DBR-5對植物病原真菌的抑菌活性高。表明兩株廣西地不容內(nèi)生真菌在抑菌劑領(lǐng)域有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。至于兩株內(nèi)生真菌的抑菌活性物質(zhì)，還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Study on the inhibitory activity of two endophytic fungi of Stephania kwangsiensis Lo.

ZHOU Qiu-yan，QING Zhen，LUO Hai-yu，ZHOU Xian-qing，CHI Tong-hai，DENG Ye-cheng
（Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education of China/College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China）

DBR-3 and DBR-5 were two endophytic fungal strains isolated from the root tubers of Stephania kwangsiensis Lo..They were identified as Albonectria rigidiuscula and Nigrospora sp..15 animal pathogens and 10 plant pathogenic fungi were used as indicators to conduct the microbial inhibition experiment of the two endophytic fungi.The results showed that DBR-3 presented inhibitory activity against the tested animal pathogens and plant pathogenic fungi.The MIC values of acetyl acetate extract from DBR-3 fermentation product against the 12 tested animal pathogens were 0.625-10 g/L，and the EC50values to the 10 tested plant pathogenic fungi were 0.3437-7.7094 g/L.DBR-5 had high inhibitory activity against the tested plant pathogenic fungi，but low inhibitory activity against the tested animal pathogens.The EC50values of acetyl acetate extract from DBR-5 fermentation product to the 10 tested plant pathogenic fungi were 0.0124-0.6112 g/L.

Stephania kwangsiensis Lo.； endophytic fungi； inhibitory activity

S482.2+92

A

1004-874X（2016）04-0111-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.022

2015-10-08

廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFA A019058）；廣西高?？蒲许椖浚?013YB037）

周秋艷（1988-），女，在讀碩士生，E-mail：393095358@qq.com

鄧業(yè)成（1965-），男，博士，教授，E-mail：dyecheng@163.com