杧果感染細菌性角斑病菌后的生理代謝變化

鄭 磊，詹儒林，柳 鳳，李國平，趙艷龍，常金梅，何衍彪

（1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091）

杧果感染細菌性角斑病菌后的生理代謝變化

鄭 磊1，2，詹儒林2，柳 鳳2，李國平2，趙艷龍2，常金梅2，何衍彪2

（1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091）

為探討杧果對細菌性角斑病的抗性與生理指標變化的關系，以感抗杧果品種紅杧6號（抗病品種）、貴妃杧（感病品種）為材料，采用刺傷接種法，測定杧果葉片中的超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、可溶性總糖、還原糖、游離氨基酸、可溶性蛋白及丙二醛（MDA）的含量。結果表明，杧果受Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae侵染后，其體內O2-·、H2O2、可溶性總糖、還原糖、游離氨基酸含量的變化與杧果抗性呈正相關；而MDA、可溶性蛋白含量的變化與抗性呈負相關。X.campestris pv.mangiferaeindicae侵染杧果后，O2-·、H2O2、可溶性總糖、還原糖、游離氨基酸、可溶性蛋白和MDA含量的變化規(guī)律與杧果抗性密切相關，初步確定為抗性生理指標，可作為該病防控與育種的輔助指標。

杧果；細菌性角斑病；抗性；生化物質；碳水化合物；活性氧

鄭磊，詹儒林，柳鳳，等.杧果感染細菌性角斑病菌后的生理代謝變化［J］.廣東農業(yè)科學，2016，43（4）：67-72.

由油菜黃單孢菌杧果致病變種（X.campestris pv.mangiferaeindicae）引起的杧果細菌性角斑病分布很廣，在世界各杧果產區(qū)普遍發(fā)生，目前該病在海南、廣東等地均有報道，局部地區(qū)嚴重發(fā)生，該病主要為害杧果葉片、花芽、枝條和果實，感病后表現出病斑周圍黃暈、流膠和表面隆起等癥狀。一般造成的直接經濟損失達15%～30%，嚴重的可高達50%，且近年來有為害加重的趨勢。植物受病原菌侵染后，體內會產生一系列代謝變化，如蛋白質、碳水化合物、酶、氨基酸等組分含量的變化，而這些變化與植物抗病性密切相關［1-4］。植物發(fā)生病害后會發(fā)生生理生化變化，而抗病性是由多種因素所形成的綜合作用［5］。目前，國內對該病的研究主要集中在地理分布、病害發(fā)生流行規(guī)律、病原菌鑒定、病害診斷和防治等方面［6-11］。而關于杧果細菌性角斑病抗性與杧果葉片組織中生理指標變化的關系目前報道仍不多。本研究以抗病品種紅杧6號、感病品種貴妃杧為材料，采用刺傷接種法，研究了杧果受X.campestris pv.mangiferaeindicae侵染后生理指標的變化，旨在為闡明寄主與病原物的互作關系和豐富杧果細菌性角斑病病理的基礎理論，為進一步研究該病害發(fā)生的內在機制以及杧果細菌性角斑病的防控提供理論依據。

1 　材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌為杧果細菌性角斑病菌野油菜黃單胞菌杧果致病變種（X.campestris pv.mangiferaeindicae）。供試品種包括紅杧6號、貴妃杧，均采自中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃。根據不同品種的病情指數分為抗病和感病植株。

1.2 試驗方法

試驗于2015年6月在中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃進行，以生長一致的盆栽杧果苗為材料，每個品種處理5棵，采用刺傷接種法接種，以搖床培養(yǎng)2 d的病原菌懸浮液作為接種菌液。破傷面積控制在2～4 cm2，蓋上棉花保濕，以相同處理的無菌水為對照，分別于接種后12、24、48、96、144、192 h取樣，隨機取5片葉片測定生理生化指標。3次重復，取平均值。

可溶性總糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法，還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法，游離氨基酸含量的測定采用茚三酮法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250法，H2O2含量的測定參照林植芳等［12］的方法，超氧陰離子（O2-·）產生速率的測定參照王愛國等［13］和高俊鳳［14］的方法。MDA含量的測定參照Wang等［15］方法并稍作改進，稱取0.5 g鮮樣，添加2 mL預冷的5%三氯乙酸冰浴下研磨成勻漿，于4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，加入3 mL 0.67% TBA搖勻于沸水中煮0.5 h后冷卻，然后在450、532、600 nm處測定吸光值，以TCA調零，按下式計算MDA（μmol/g，FW）含量：

式中，Vt表示提取液總體積（mL），Vs表示反應用體積（mL），m表示樣品鮮重（g）。

1.3 數據處理及統計分析

所有數據采用Excel作圖和SAS軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種杧果接種病菌后可溶性總糖含量的動態(tài)變化

植物糖含量的變化與植物的抗性密切相關。圖1顯示，整體上接種病原菌后不同抗性杧果葉片的可溶性總糖含量均低于對照，抗性品種紅杧6號接種后12～48 h稍有上升并略高于對照，96 h后顯著下降并低于對照。而貴妃杧品種的葉片中，發(fā)病24 h之后可溶性總糖含量顯著下降且低于對照，與未接種相比，感病品種貴妃杧可溶性總糖含量的降幅（32.38%）顯著高于紅杧6號（5.31%），但抗性品種紅杧6號的可溶性總糖含量（48.54 mg/g）高于感病品種貴妃杧（41.99 mg/g）。由可溶性總糖含量的變化規(guī)律來看，可溶性總糖含量變化與杧果抗病性呈正相關。

圖1 不同品種杧果接種病菌后可溶性總糖含量的動態(tài)變化

2.2 不同品種杧果接種病菌后還原糖含量的動態(tài)變化

從圖2可以看出，接種病原菌后對不同抗性杧果葉片還原糖含量均有一定影響。感病品種貴妃杧和抗病品種紅杧6號的還原糖含量在接種后12～48 h均先上升后下降，隨后均明顯下降且低于對照，接種后144 h降至最低（分別是對照的0.53 和0.51倍），兩個處理間差異不大，總體來看貴妃杧和紅杧6號都呈下降趨勢，從變化幅度水平看，與對照相比貴妃杧降幅較大，初步推測可能是貴妃杧由于病原菌的侵染，以還原糖作為碳源消耗的原因。從還原糖含量變化的規(guī)律來看，還原糖含量與抗病性呈正相關。

圖2 不同品種杧果接種病菌后還原糖含量的動態(tài)變化

2.3 不同品種杧果接種病菌后游離氨基酸含量的動態(tài)變化

氨基酸是構成蛋白質的基本單位，是一項重要的生理指標，植物受到病原菌侵染后游離氨基酸含量會發(fā)生變化。由圖3可知，紅杧6號、貴妃杧接種后游離氨基酸含量均顯著高于對照，均呈現先上升后下降的趨勢。從游離氨基酸含量來看貴妃杧（每100 g 26.3 mg，FW）高于紅杧6號（每100 g 26.13 mg，FW），差異不顯著。但紅杧6號氨基酸含量的增幅（135.86%）顯著高于貴妃杧（78.56%）。從游離氨基酸含量的變化規(guī)律來看，游離氨基酸含量變化動態(tài)與抗病性呈正相關。

圖3 不同品種杧果接種病菌后游離氨基酸含量的動態(tài)變化

2.4 不同品種杧果接種病菌后MDA含量的動態(tài)變化

植物細胞受病害脅迫會發(fā)生膜脂化氧化，MDA是其最終產物之一，其含量高低反映植物受害的程度。從圖4可以看出，接種后紅杧6號、貴妃杧的MDA含量均顯著高于對照，兩個杧果品種都呈現先上升后下降的趨勢，且同時在接種后96 h達到最大值。從MDA含量來看，貴妃杧的MDA含量高于紅杧6號，差異顯著，說明膜脂化氧化損傷程度比紅杧6號更嚴重。但紅杧6號MDA含量的增幅在接種后12～48 h較高，而貴妃杧在接種后96～192 h增幅較高，這與接種病菌后寄主的顯癥時間相吻合，說明MDA與杧果抗細菌性角斑病密切相關。

圖4 不同品種杧果接種病菌后MDA含量的動態(tài)變化

圖5 不同品種杧果接種病菌后可溶性蛋白含量的動態(tài)變化

2.5 不同品種杧果接種病菌后可溶性蛋白含量的動態(tài)變化

蛋白質是一項重要的生理指標，植物受病原菌的侵染會引起植物體內蛋白質含量的變化。兩個杧果品種植株葉片中可溶性蛋白含量變化如圖5所示，接種后紅杧6號的可溶性蛋白含量低于對照，呈下降的趨勢；而貴妃杧的可溶性蛋白含量則高于對照。接種后12～48 h紅杧6號的可溶性蛋白含量相對較平穩(wěn)，而貴妃杧的可溶性蛋白含量則急劇上升且高于對照；接種后48～192 h紅杧6號的可溶性蛋白含量急劇下降且低于對照，接種后144 h達到最低且比對照低94.55%，貴妃杧的可溶性蛋白含量則高于對照且保持較高水平。這可能是由于病原菌的侵入，導致寄主在抗病過程中消耗蛋白以供應能量，或使蛋白表達受阻，所以抗性品種紅杧6號可溶性蛋白含量低于對照。從變化規(guī)律來看，蛋白質含量變化與抗病性呈負相關。

2.6 不同品種杧果接種病菌后H2O2含量的動態(tài)變化

從圖6可以看出，接種后紅杧6號、貴妃杧的H2O2含量均顯著高于對照，紅杧6號的H2O2含量在接種后24 h后達到一個峰值，顯著高于對照，接種后48 h降低但仍高于對照，而后隨著病原菌的入侵H2O2含量繼續(xù)增加，貴妃杧的H2O2含量接種后繼續(xù)上升，在接種后48 h達到峰值，比對照提高37.14%，差異達顯著水平，隨后H2O2含量相對較平穩(wěn)。從整體含量上看，紅杧6號的H2O2含量高于貴妃杧含量，紅杧6號H2O2含量的平均增幅（51.9%）顯著高于貴妃杧（26.25%），說明H2O2含量與抗病性密切相關且呈正相關。

圖6 不同品種杧果接種病菌后H2O2含量的動態(tài)變化

2.7 不同品種杧果接種病菌后O2-·產生速率的動態(tài)變化

由圖7可知，兩種杧果品種接種后O2-·的產生速率都有所提高，紅杧6號接種后12 h其O2-·產生速率顯著高于對照，分別在接種后48 h和144 h達到峰值Ⅰ、峰值Ⅱ，峰值Ⅱ大于峰值Ⅰ，并且顯著高于對照，接種后紅杧6號的O2-·產生速率呈現先下降后上升循環(huán)的趨勢。接種后96 h貴妃杧的O2-·產生速率顯著高于對照，隨后顯著下降，192 h后又升高；貴妃杧的O2-·生產速率呈現出先下降后上升的趨勢。兩個處理間的O2-·生產速率相差不大，但紅杧6號O2-·產生速率的增幅顯著大于貴妃杧，說明O2-·產生速率與抗病性呈正相關。

圖7 不同品種杧果接種病菌后O2-·產生速率的動態(tài)變化

3 結論與討論

病原菌侵染植物后，寄主體內會發(fā)生一系列的生理代謝變化，如體內碳水化合物、氨基酸、蛋白質等的含量都會發(fā)生變化，而這些變化與植物抗病性有著密切關系［1-4］。糖作為植物本身各類代謝的物質和能量來源，也可以作為病原菌的營養(yǎng)來源。糖含量與植物的抗病性有一定關系［1］，有報道認為糖含量越高越抗?。?6］，有研究發(fā)現含糖量越高越有利于病害發(fā)生［17］，但也有學者認為糖含量與抗病性沒有相關性［18］。蛋白質是基因表達的產物，同時也是植物性狀表現的物質基礎，蛋白質含量與品種抗病性有一定關系。李佐同等［19］認為可溶性蛋白含量與抗病性呈正相關，郭陞垚等［20］則認為蛋白質含量與抗病性呈負相關。氨基酸作為蛋白質的基本組成單位，是一切生命存在的基石，參與到所有生命，因此植物生長發(fā)育離不開氨基酸。楊輝等［21］認為氨基酸含量與抗病性呈正相關，胡莉莉［22］研究發(fā)現氨基酸含量與抗病性呈負相關，而張淑紅［23］則認為氨基酸與抗病性不相關。當植物細胞受到嚴重破壞后產生活性氧進而發(fā)生膜質過氧化反應，MDA含量會提高［24］，其含量高低反映植物受害程度。有研究發(fā)現MDA含量與抗病性呈負相關［25］，也有研究發(fā)現其與抗病性呈正相關［26］。正常情況下，植物體內的活性氧濃度極低且處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，當受到病原物脅迫后其失去平衡，造成活性氧的大量積累，稱為氧迸發(fā)［27］。植物體內所產生的活性氧與植物抗病性密切相關［28］，曾永三等［29］研究發(fā)現抗病品種的O2-·產生速率小于感病品種，王晨芳等［30］研究發(fā)現抗性品種的H2O2含量以及O2-·產生速率均高于感病品種。由此可見這些生理指標與寄主抗病性有著重要的關系。

本研究結果表明，不同抗性杧果品種感病后還原糖含量、可溶性總糖含量均小于對照，且感病品種降幅均大于抗病品種，與王玲平［31］研究結果相似。這可能是由于病原菌的入侵使作為營養(yǎng)物質的糖被消耗，說明糖含量越高越抗??；也可能與杧果機體自身和不同病原菌有關，也有可能是在杧果與病原菌的互作過程中，糖相關代 謝基因被抑制的結果，這有待進一步深入研究。接種后不同品種杧果葉片內MDA含量均高于對照，感病品種的MDA含量顯著高于抗病品種。接種后12～48 h抗病品種MDA含量的增幅大于感病品種，接種后96～192 h感病品種MDA含量的增幅大于抗病品種。這可能是因為接種前期由于受病原菌的侵染，抗病品種機體中大量產生活性氧，導致機體發(fā)生過敏反應而表現為抗病，使得MDA大幅增加。隨著發(fā)病時間的推移，感病品種的MDA含量較高且增幅較大，說明感病品種受損害程度比較嚴重，MDA含量變化與杧果抗病性呈負相關，與陸君［25］的研究結果一致。接種后感病品種的可溶性蛋白含量均高于對照，而抗病品種的可溶性蛋白含量則低于對照?？扇苄缘鞍缀颗c抗病性呈負相關，與張淑紅［23］研究結果相似。一方面，可能是病原菌刺激了機體蛋白質的降解，降解產物有可能參與其他代謝途徑，阻止病害發(fā)生，從而表現為抗病；另一方面，也可能是感病品種由于病原菌的入侵，抗病基因表達受到抑制，而寄主與細菌性角斑病菌相互作用的蛋白有可能是致病蛋白，也可能與機體自身有關，這有待進一步深入研究。不同抗性杧果品種接種后H2O2含量及O2-·產生速率均高于對照，抗病品種葉片中的H2O2含量顯著高于感病品種，且抗病品種H2O2含量的增幅顯著高于感病品種，而抗病品種的O2-· 產生速率增幅顯著高于感病品種，這與王晨芳等［30］研究結果相似。這推測可能是抗病品種與病原菌互作產生大量的活性氧，從而發(fā)生過敏性細胞死亡反應，限制了病原菌的進一步擴散，從而表現為抗??；感病品種未發(fā)生過敏反應從而表現為感病。

本研究發(fā)現了不同抗性杧果受X.campestris pv.mangiferaeindicae侵染后還原糖、可溶性糖、氨基酸、H2O2、O2-·、MDA和可溶性蛋白含量的變化過程與杧果抗細菌性角斑病的關系，結果表明：還原糖、可溶性總糖、氨基酸、H2O2和O2-·的變化與杧果抗病性呈正相關，MDA和可溶性蛋白的變化與杧果抗病性呈負相關。初步確定這些指標與杧果抗病性有密切的聯系，而寄主對病原物的抗性是由一系列生理生化過程決定的，抗性與寄主體內的多種化合物種類及其含量有關。要全面了解抗病性的生理生化機制，還需要從包括酶、酚類以及核酸等多種生化組分的作用進一步開展研究，為抗病育種提供相關理論基礎。

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（責任編輯 張輝玲）

Physiological metabolic changes of mango infected by bacterial leaf spot pathogen

ZHENG Lei1，2，ZHAN Ru-lin2，LIU Feng2，LI Guo-ping2，ZHAO Yan-long2，CHANG Jin-mei2，HE Yan-biao2
（1.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China；2.South Asia Tropical Crop Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524091，China）

To explore the relationship of resistance to bacterial angular leaf spot in mango and changes of its physiological parameters，we tested the contents of superoxide anion （O2-·），hydrogen perox-ide，total soluble sugars，reducing sugars，free amino acids，soluble proteins and malondialdehyde （MDA） in mango leaves of No.6 Hongmango （resistance） and Guifeimango （susceptible）.It indicated that mango infected by X.campestris pv.mangiferaeindicae，the changes of the contents of its superoxide anion （O2-·），hydrogen peroxide （H2O2），total soluble sugars，reducing sugars and free amino acids were positively correlated with mango resistance，malondialdehyde （MDA） and soluble proteins were negatively correlated with mango resistance.After X.campestris pv.mangiferaeindicae infected mango，variation from the contents of its superoxide anion （O2-·） production rate，hydrogen perox-ide （H2O2），total soluble sugars，reducing sugars，free amino acids，soluble proteins and malondialdehyde （MDA） were closely related to the mango resistance.They were initially identified as resistant physiological indexes，and could be used as auxiliary indicators of the disease prevention，control and breeding.

mango；bacterial leaf spot；resistance；biochemicals；carbohydrate；reactive oxygen species

S667.7

A

1004-874X（2016）04-0067-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.014

2015-11-11

中央級非盈利性研究機構基本科研業(yè)務費研究專項（1630062014007）；海南省自然科學基金（20163109）

鄭磊（1988-），男，在讀碩士生，E-mail：1210043316@qq.com

柳鳳（1984-），女，博士，助理研究員，E-mail：liufengneau@163.com