大腸桿菌cDNA文庫的構(gòu)建與質(zhì)量分析

肖　業(yè)，王婷婷，向雙林

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙　410081)

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大腸桿菌cDNA文庫的構(gòu)建與質(zhì)量分析

肖業(yè)，王婷婷，向雙林

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙410081)

摘要采用Stratagene公司的cDNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建大腸桿菌的cDNA文庫，從中篩選出與RNase Ⅲ有相互作用的蛋白，為研究RNase Ⅲ蛋白在原核生物中的作用奠定基礎(chǔ).用Trizol試劑提取大腸桿菌的總RNA，在E.coli poly(A) Polymerase作用下給mRNA特異性地加上poly(A)尾，分離純化mRNA，利用mRNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA.經(jīng)pfx酶補平雙鏈末端，在兩端加上EcoRⅠ接頭，XhoⅠ酶切消化產(chǎn)生粘性末端.用CHROMA SPIN-400 column分級分離純化cDNA片段，與pTRG XR載體連接后，電擊轉(zhuǎn)入XL1-BLUE MRF′菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)中.得到原始文庫，經(jīng)計算文庫的容量達到3×106個克隆.用PCR方法測得文庫的重組率為100%，插入片段的平均長度基本位于300 bp以上，測定放大文庫的滴度為:3.15×1010pfu/mL.說明構(gòu)建的大腸桿菌cDNA 文庫質(zhì)量比較高，適合用于篩選目的基因克隆.

關(guān)鍵詞大腸桿菌；細菌雙雜交；cDNA文庫

RNase Ⅲ是一種雙鏈特異性的核酸內(nèi)切酶，在細菌、酵母和人類的rRNA成熟過程中起加工rRNA前體的作用，在一些細菌中它也參與mRNA和小片段核酸RNA的加工、RNA干擾或rRNA的成熟過程[1].在真核生物的RNA干擾過程中，RNase Ⅲ起重要作用，主要是Drosha和Dicer兩種RNase Ⅲ參與干擾小RNA的剪切成熟過程[2].Yang等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的RNase Ⅲ酶能將雙鏈的RNA剪切成endoribonuclease-prepared siRNA(esiRNA)，從而介導(dǎo)有效的RNA干擾[3].為了研究RNase Ⅲ酶在原核生物中的作用，本實驗室構(gòu)建大腸桿菌的cDNA文庫，采用細菌雙雜交的方式從中釣取出與RNase Ⅲ有相互作用的蛋白.通過分析釣取到的蛋白，研究RNase Ⅲ蛋白在原核生物中的作用，探究細菌內(nèi)是否存在類似真核生物的RNA干擾方式.

1材料與方法

1.1材料

BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit購自Stratagene公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIAGEN公司，PolyATtract mRNA Isolation system IV購自Promega公司，pBT誘餌質(zhì)粒和pTRG靶蛋白質(zhì)粒購自Stratagene公司，pGEX-4T-2和pQE-N2質(zhì)粒為湖南師范大學(xué)基因功能與調(diào)控教育部重點實驗室保存，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，CHROMA SPIN-400 column柱子購自Clontech公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，adenine HCl和3-amino-1,2,4-triazole購自Sigma公司，His Dropout Supplement和Bacto agar購自BD/Clontech公司.

1.2方法

1.2.1大腸桿菌總RNA的提取37 ℃培養(yǎng)細菌至OD600達到0.5 ℃左右， 收集3 mL菌體，加入200 μL的TE buffer:10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0，含10 g/L的溶菌酶，室溫處理5 min. 5 min后加入1 mL Trizol試劑提取總RNA[4]，將RNA保存在-80 ℃.

1.2.2mRNA加poly(A)尾并純化用E.colipoly(A) Polymerase加尾酶，給細菌總RNA中的mRNA特異性地加上poly(A)的尾，方法參照NEB公司E.colipoly(A) Polymerase說明書.按Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV試劑盒說明書，分離純化mRNA，再用12 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測.

1.2.3mRNA加尾驗證取mRNA 5 μg在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以oligo(dT)做為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈.cDNA第一條鏈反轉(zhuǎn)錄后用細菌的GAPDH引物做PCR，驗證mRNA加尾和反轉(zhuǎn)錄是否成功，引物序列見表1所示.

表1　引物的名稱和序列

1.2.4cDNA雙鏈的合成及純化參照Stratagene公司的BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit中cDNA雙鏈合成步驟合成cDNA雙鏈，取5 μg mRNA 為模板，以含XhoⅠ酶切位點的Oligo(dT)作為引物，在AccuScript RT反轉(zhuǎn)錄酶作用下42 ℃孵育1 h，合成cDNA第一條鏈.在第一條鏈混合物中，加入RNase H，DNA polymerase I，second-strand dNTP mixture(其中dCTP甲基化)，16 ℃孵育2.5 h合成cDNA第二條鏈，用pfx酶補平雙鏈的末端，在T4連接酶的作用下，兩端加上EcoRⅠ接頭，T4 polynucleotide kinase使其磷酸化后，再用XhoⅠ酶切消化產(chǎn)生cDNA 粘性末端.采用clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱子分級分離純化cDNA雙鏈片段，主要除掉300 bp以下的片段.

1.2.5高效率電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備高效率電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備，參照韋曉明等人的實驗方法[5].制備好的電轉(zhuǎn)感受態(tài)須馬上使用.

1.2.6cDNA與表達載體重組及轉(zhuǎn)化寄主菌取90 ng cDNA片段與90 ng pTRG載體，用T4 DNA連接酶，4 ℃連接過夜.加入3倍體積的酒精和0.1倍體積3 mol/L的醋酸鈉沉淀連接產(chǎn)物，將沉淀重懸浮在一定體積的水中，得到純化和濃縮后的連接產(chǎn)物，測定濃度.在4個0.2 cm的電擊杯中，將200 ng連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入XL1-BLUE MRF′菌中，得到原始cDNA文庫，取一定體積的菌液按梯度稀釋后涂在四環(huán)素平板上，30 ℃培養(yǎng)，統(tǒng)計克隆數(shù)計算文庫的容量.

1.2.7cDNA文庫的重組率和滴度測定在上一步四環(huán)素平板上隨機挑取20個克隆，用表2的引物做菌落PCR，條件如下：94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,30個循環(huán)后再72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物做DNA瓊脂糖凝膠電泳，判斷文庫插入片段的大小并計算重組率；收刮所有四環(huán)素平板上的克隆，重懸浮于一定體積20%的甘油中，即放大文庫.取一定體積的菌液按梯度稀釋后，涂布在四環(huán)素平板上，30 ℃培養(yǎng)，統(tǒng)計克隆數(shù)計算放大文庫的滴度.

表2　引物的名稱與序列

2結(jié)果

2.1大腸桿菌總RNA的提取

按標準的Trizol法提取細菌RNA，整個過程注意防止RNase酶污染，分別取1 μg RNA加在1，2號膠孔中，做DNA瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1，總RNA電泳后可見清晰明顯的3個條帶，條帶干凈無拖尾現(xiàn)象且23 S rRNA亮度差不多為16 S rRNA亮度的2倍，OD260/OD280≈2.0, OD260/OD230≈2.0, 這說明總RNA 基本上沒有雜蛋白質(zhì)、酚和硫氰酸胍污染，提取的RNA質(zhì)量非常高.

2.2mRNA的加poly(A)尾及純化

給240 μg總RNA中的mRNA做特異的加poly(A)尾處理.加尾后的mRNA純化后再溶解在30 μL DEPC處理過的水中，測濃度為326.1 mg/L，取0.5 μg做DNA瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2，mRNA 呈彌散狀分布,前后緣界限明顯,一方面說明分離的mRNA 沒有降解,另一方面也說明總RNA 的完整性比較好, 基本上沒有降解.

圖1　大腸桿菌總RNA的提取　　　　 　　　圖2　mRNA瓊脂糖凝膠電泳　Fig.1　Extracting total RNA from Escherichia coli　　　　Fig.2　Agarose gel electrophoreisis of mRNA

2.3cDNA雙鏈的合成及 cDNA第一條鏈反轉(zhuǎn)錄驗證

mRNA加尾后，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，再用細菌的GAPDH引物做PCR，取2 μL做DNA瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3，PCR產(chǎn)物大小基本吻合且條帶單一(設(shè)計GAPDH引物預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為500 bp)，說明mRNA是成功加上poly(A)尾；cDNA第一條鏈反轉(zhuǎn)錄也是成功的. cDNA第一鏈和第二條鏈合成后，分別取5 μL做DNA瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4，cDNA呈彌散狀分布，且500 bp左右條帶較亮，說明cDNA大小呈不均一分布且片段大小大部分在300 bp以上，而在100 bp以下的部分為短片段的cDNA和EcoRⅠ adapters.

圖3　細菌GAPDH內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳　　　　　　　圖4　cDNA第一鏈和cDNA雙鏈瓊脂糖凝膠電泳　　Fig.3　Agarose gel electrophoreisis PCR production of GAPDH　　　　　　　　Fig.4　Agarose gel electrophoreisis of first-strand cDNA and double-stranded cDNA

2.4cDNA雙鏈的純化

用Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱分級分離純化合成的cDNA片段，結(jié)果如圖5，從圖來看從6號開始洗脫出cDNA，6～9號管的cDNA片段大小基本在300 bp以上，而10～14號管的cDNA片段大小基本在300 bp以下，須丟棄，因為這些小片段的cDNA 會優(yōu)先與載體連接, 所構(gòu)建的cDNA 文庫中均是一些小片段的克隆, 造成cDNA 文庫完整性非常差.收集6～9號管的cDNA溶液，經(jīng)異丙醇和醋酸鈉沉淀后，重新溶解在20 μL無菌水中，測質(zhì)量濃度為84 mg/L.

圖5　SPIN-400 column柱分級分離純化cDNA片段Fig.5　cDNA size fractionated by CHROMA SPIN-400 column

2.5文庫的構(gòu)建和質(zhì)量分析

將原始文庫的菌液涂在52個150 mm四環(huán)素平板上，計算得到的克隆數(shù)達到3×106cfu，即文庫容量的大小.從四環(huán)素平板上隨機挑取20個cfu做菌落PCR，PCR產(chǎn)物做DNA瓊脂糖凝膠電泳，1～20號為隨機挑取的克隆，結(jié)果如圖6，從結(jié)果來看20個克隆中無空載體，片段大小呈不均一分布且大小基本位于300 bp以上，說明文庫質(zhì)量較高.將52個150 mm平板上的菌落全部刮取下來，計算放大文庫的滴度為3.15×1010pfu/mL.

圖6　文庫插入片段檢測Fig.6　The examination results of the insert fragments in the library

3討論

3.1改善提取高質(zhì)量細菌RNA的方法

RNA在提取過程中極容易被降解，細菌的RNA 具有含量少、半衰期短、容易降解等特點，所以與動、植物等真核生物相比較，更難提取出高質(zhì)量的RNA.目前最常使用的RNA 提取方法當(dāng)推1987 年Chomczynski 等提出的“硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”[6], 其優(yōu)點是收獲的非降解RNA產(chǎn)量大、純度高, 不需超速離心或多步酚氯仿抽提[7].但需要長時間在氯化銫柱中超離心且毒性強，費用高.2006發(fā)表在Nature上的一篇文章，研究者們開發(fā)出Trizol試劑，能很方便簡單地提取各種樣本的總RNA[4].目前提取細菌總RNA方法還有：SDS-Phenol 法、CTAB 法、熱硼酸法及改良熱硼酸法等[8].本實驗發(fā)現(xiàn)如果直接用Trizol提細菌總RNA，提出來的RNA質(zhì)量比較差，可能因為Trizol試劑破細菌細胞壁的能力較差.而用含溶菌酶濃度為10 g/L的TE Buffer預(yù)處理除細胞壁后，發(fā)現(xiàn)能夠提出高質(zhì)量的RNA.除此之外，收集過夜菌和對數(shù)期的菌液提RNA，發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期的菌液能提出更高質(zhì)量的RNA[9].分別取1.5,3.0,4.5 mL對數(shù)期菌液提RNA，發(fā)現(xiàn)用3.0 mL菌液能提出質(zhì)量更好的總RNA.

3.2制備高效率感受態(tài)

要構(gòu)建一個高質(zhì)量高代表性的文庫，需要高效率的感受態(tài).感受態(tài)可分為化學(xué)感受態(tài)和電轉(zhuǎn)感受態(tài)，化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法很多, 如Hanahan法、氯化鈣法及Inoue法[10].Hanahan法和Inoue法做得仔細的話，其轉(zhuǎn)化效率可以達到108/μg DNA，但由于其操作復(fù)雜, 并且試驗結(jié)果重復(fù)性不理想[5].建庫優(yōu)先考慮電擊轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率至少可以達到8×108～109/μg DNA.文獻報道電場強度和電擊脈沖時間是影響電轉(zhuǎn)化效率的兩個主要因素[11].1988年William等人研究發(fā)現(xiàn)在0.2 cm電擊杯中采用2.5 kV場強、200 Ω電阻和25 μF電容的條件能達到最高的轉(zhuǎn)化效率：109～1010/μg DNA，并且感受態(tài)濃度越高，電擊后立馬加入SOC培養(yǎng)基的時間越短，其轉(zhuǎn)化效率也越高[12].OD600值最好界于0.35～0.4之間，一定不能超過0.4.一般感受態(tài)做好后都是直接放于-80℃凍存或用液氮速凍，作者發(fā)現(xiàn)這會使感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率下降約一個數(shù)量級.

3.3cDNA文庫的構(gòu)建及評價

用Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV試劑盒富集mRNA時，用0.1×SSC漂洗顆粒時mRNA的得率很低，后來發(fā)現(xiàn)采用0.2×SSC漂洗能大幅提高mRNA洗脫得率.cDNA片段的純化普遍采用的是Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱[13]，不過其純化步驟比較繁瑣，采用Promega公司的Sephacryl S-400 Resin也可以達到相同的效果，而且只需過柱一次，操作簡單快捷.

在構(gòu)建的cDNA文庫中，為使低豐度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，一個cDNA文庫至少要包含多少個克隆，可由Clack-Carbon公式計算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n) (N為cDNA文庫中包含的克隆數(shù)；p為要求的概率,通常要求大于99%；1/n為每一種低豐度mRNA占總mRNA的比例).為使某低豐度mRNA概率大于99%，文庫的重組子數(shù)不應(yīng)低于1.7×105個[14]，本實驗構(gòu)建的大腸桿菌cDNA文庫的容量達到3×106個克隆，足以達到所需標準.而且隨機挑取的20個克隆做菌落PCR，結(jié)果重組率達到100%，放大文庫的滴度為:3.15×1010pfu/mL，說明作者成功構(gòu)建了一個完好的cDNA文庫，可用于后續(xù)篩選目的基因、大規(guī)模測序等研究.

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(編輯WJ)

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.04.005

收稿日期：2015-10-08

基金項目：國家973計劃資助項目(2010CB529900)；長沙市科技局資助項目(K1205221-31)

*通訊作者,E-mail：xshlin@hunnu.edu.cn

中圖分類號Q78

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2016)04-0029-05

Construction of a cDNA Library ofEscherichiaColiand Its Quality Analysis

XIAOYe,WANGTing-ting,XIANGShuang-lin*

(College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

AbstractTo investigate the role of RNase Ⅲ in prokaryote, a cDNA library of Escherichia coli was constructed using the cDNA library construction kit purchased from Stratagene, which could be further used for identifying RNase Ⅲ interacting-proteins. In this study, the cDNA library of E.coli was constructed using the following method: the total RNA of E.coli was extracted using Trizol kit, and the poly(A) tail was specifically added to mRNA with E.coli poly(A) Polymerase. After that, mRNA was separated, purified, and reverse-transcripted into double-strand DNA. The ds-cDNA termini was blunted with pfu DNA polymerase. The blunted cDNAs were added to EcoRⅠ adaptors and then digested by XhoⅠ. The cDNA size was fractionated by CHROMA SPIN-400 column. These purified fragments were ligased into the pTRG XR vector and transformed into XL1-BLUE MRF′ competent cells, which generated the oriental unamplified cDNA library. The unamplified library contained about 3×106 recombinants. The PCR results showed that the percentage of positive recombinant clones was 100%. The length of the inserted cDNA fragment was over 300 bp.The titer of the amplified library was 3.15×1010pfu/mL.The quality of the constructed E.coli library was excellent and helpful to screen new genes in the future.

Key wordsEscherichia coli; Bacteria two-hybrid ; cDNA library