響應(yīng)面法優(yōu)化蘇云金芽胞桿菌YC-10發(fā)酵培養(yǎng)基

成飛雪，宋志強(qiáng)，王　劍，王忠勇，程菊娥，張德詠*，劉　勇

(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.植物保護(hù)研究所，b.農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙　410125)

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響應(yīng)面法優(yōu)化蘇云金芽胞桿菌YC-10發(fā)酵培養(yǎng)基

成飛雪a，宋志強(qiáng)a，王劍b，王忠勇a，程菊娥a，張德詠a*，劉勇a

(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.植物保護(hù)研究所，b.農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙410125)

摘要為獲得殺線蟲(chóng)Bt菌株YC-10最佳培養(yǎng)基配方，以發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對(duì)YC-10的培養(yǎng)基配方進(jìn)行室內(nèi)搖瓶?jī)?yōu)化篩選.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大豆餅、玉米粉、氯化鈣和磷酸氫二鉀為4個(gè)顯著影響因子，YC-10最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：黃豆餅25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L， MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L，F(xiàn)eSO4 0.25 g/L.

關(guān)鍵詞蘇云金芽胞桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面分析法；伴胞晶體蛋白

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)作為一種安全的生物農(nóng)藥[1]，是目前世界上開(kāi)發(fā)應(yīng)用最成功的微生物殺蟲(chóng)劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏以及衛(wèi)生等多種害蟲(chóng)的防治[2].

Bt菌株的殺蟲(chóng)毒力取決于發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白的產(chǎn)生.而其發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分不僅影響發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)，還直接影響菌株蛋白晶體蛋白的產(chǎn)量，從而決定其殺蟲(chóng)效果，特別是培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無(wú)機(jī)離子的組成及其配比對(duì)伴胞晶體蛋白的產(chǎn)生影響極大[3].而目前生產(chǎn)中常用的Bt發(fā)酵培養(yǎng)基配方并不能適用于所有的Bt菌株，往往會(huì)出現(xiàn)因發(fā)酵培養(yǎng)基中組分及配比不恰當(dāng)而使得Bt菌株的伴胞晶體蛋白含量不高，從而影響其殺蟲(chóng)效果，限制其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用.所以進(jìn)行Bt菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分的選擇和配比優(yōu)化對(duì)提高菌株伴胞晶體蛋白的產(chǎn)量極其重要.

響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是一種優(yōu)化生物過(guò)程的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，是簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程、降低開(kāi)發(fā)成本、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、提高生產(chǎn)效率和解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題的有效方法.目前國(guó)內(nèi)外利用響應(yīng)面分析法在微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化中取得了很好成效[4-5].

Bt菌株YC-10是一種對(duì)植物線蟲(chóng)具有較強(qiáng)殺蟲(chóng)作用的活性菌株[6]，本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，以發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與優(yōu)化，以提高該菌株伴胞晶體蛋白產(chǎn)生量，從而提高其殺線蟲(chóng)效率，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供指導(dǎo).

1材料和方法

1.1供試菌株

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)YC-10菌株，為本實(shí)驗(yàn)室分離保存菌種.

1.2菌種培養(yǎng)方法

將芽孢桿菌單菌落接種到裝有60 mL NA培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)10～16 h，取4 mL轉(zhuǎn)接到裝有100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，相同條件搖瓶培養(yǎng)至鏡檢80%芽孢脫落時(shí)停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵實(shí)驗(yàn)菌種備用.

1.3發(fā)酵效果檢測(cè)

伴胞晶體蛋白提取采用等電點(diǎn)法[6]，含量測(cè)定采用Bradford法.

1.4發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

Bt培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基成分中氮源、碳源、無(wú)機(jī)離子(鋅離子、鎂離子、鉀離子、鈣離子、亞鐵離子、錳離子)質(zhì)量濃度對(duì)伴胞晶體蛋白影響較大[7-9].培養(yǎng)基篩選優(yōu)化各實(shí)驗(yàn)的處理都采用500 mL錐形瓶中裝50 mL培養(yǎng)基， 菌種接種量2%，200 r/min，30 ℃搖瓶培養(yǎng)96 h，以各處理所得伴胞晶體蛋白含量為響應(yīng)值.

1.4.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，篩選對(duì)Bt伴胞晶體蛋白產(chǎn)生顯著影響的培養(yǎng)基成分.實(shí)驗(yàn)設(shè)8因子、2水平(標(biāo)記為+1，-1)，12個(gè)處理(見(jiàn)表1).各成分的質(zhì)量濃度以Xn表示：黃豆餅(X1)，玉米粉(X2)，硫酸鋅(X4)，硫酸鎂(X5)，硫酸錳(X7)，氯化鈣(X8)，硫酸亞鐵(X9)，磷酸氫二鉀(X10)，X3，X6和X11代表虛擬因子以減少實(shí)驗(yàn)誤差.

1.4.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用最陡爬坡路徑法對(duì)顯著影響B(tài)t菌株YC-10伴胞晶體蛋白產(chǎn)生的因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)研究.以試驗(yàn)結(jié)果中概率值(P-value)小于0.05的黃豆餅、玉米粉、磷酸氫二鉀和氯化鈣4個(gè)培養(yǎng)基組分的質(zhì)量濃度作為主要影響因子、5水平標(biāo)記(-2，-1，0，1，2)進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定培養(yǎng)基中顯著影響因子的濃度范圍.

1.4.3響應(yīng)面分析以最陡爬坡試驗(yàn)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸及誤差分析，獲得回歸方程，并根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，進(jìn)而確定最佳培養(yǎng)基配方，求得最優(yōu)值.

1.4.4實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證用得到的最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取得平均值，與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較以驗(yàn)證模型的可靠性，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果.

1.5結(jié)果統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)以實(shí)驗(yàn)處理組的伴胞晶體蛋白含量為響應(yīng)值，每次試驗(yàn)重復(fù)3次.Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design Expert統(tǒng)計(jì)軟件(Version 8.0.7.1，State-Ease Inc.，USA)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，F(xiàn)檢驗(yàn)(F-test).

2結(jié)果與分析

2.1顯著影響因子分析

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，黃豆餅、玉米粉、磷酸氫二鉀、氯化鈣4個(gè)培養(yǎng)基組分對(duì)Bt菌株YC-10產(chǎn)孢作用影響顯著(P<0.05)，對(duì)伴胞晶體蛋白含量的影響從大到小依次為黃豆餅、磷酸氫二鉀、玉米粉和氯化鈣(表2).

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2　顯著影響因子分析

2.2顯著影響因子最適宜濃度范圍

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可以看出，高水平的黃豆餅和玉米粉對(duì)Bt菌株YC-10伴胞晶體蛋白的產(chǎn)生起促進(jìn)作用，而高水平的氯化鈣和磷酸氫二鉀則對(duì)伴胞晶體蛋白生成產(chǎn)生抑制作用.因此在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中對(duì)4種顯著影響因子的質(zhì)量濃度進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，以尋找能產(chǎn)出最高伴胞晶體蛋白量的培養(yǎng)基組分.最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，能獲得最高伴胞晶體蛋白量的培養(yǎng)基組分初步確定為黃豆餅25.0 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化鈣0.25 g/L，磷酸氫二鉀0.45 g/L.

表3　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3響應(yīng)面法篩選最優(yōu)培養(yǎng)基組分

在爬坡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法中的Box-Behnken方法對(duì)4種培養(yǎng)基成分進(jìn)行最優(yōu)篩選，以黃豆餅25.0 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化鈣0.25 g/L，磷酸氫二鉀0.45 g/L為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析(表4和表5).從表5中可以看到，該回歸模型多元相關(guān)系數(shù)R2為0.973 2，表明僅有2.68%的變異不能由此模型進(jìn)行解釋；同時(shí)，回歸模型P值小于0.000 1，表明模型顯著.經(jīng)回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式方程：Y=171.50+10.80A+3.46B-2.23C-5.61D-6.20AB+3.90AC+1.45AD+2.75BC-1.08BD-0.85CD-16.65A2-13.37B2-8.90C2-8.32D2(其中Y為伴胞晶體蛋白質(zhì)量濃度).

表4　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表5　響應(yīng)面回歸分析

根據(jù)上述擬合回歸方程做出響應(yīng)面分析圖，見(jiàn)圖1～圖6.從圖1可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中CaCl2為0.25 g/L，K2HPO4為0.45 g/L時(shí)，使黃豆餅從22.5 g/L增加到27.5 g/L，玉米粉從11.5 g/L增加到13.5 g/L，產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，曲面頂點(diǎn)為產(chǎn)生的伴胞晶體質(zhì)量濃度最大值.同樣，圖2和圖3也顯示，隨著黃豆餅和CaCl2以及K2HPO4質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì).而圖4和圖5以及圖6響應(yīng)面分析圖曲面較平坦，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基濃度增加，發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白濃度變化不大.同時(shí)，從圖1到圖6的等高線圖可以看出，培養(yǎng)基4種組分中，K2HPO4與黃豆餅或玉米粉間交互作用顯著，而K2HPO4與CaCl2之間不存在顯著的交互作用.

圖1　黃豆餅與玉米粉響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.1　Response surface plot and contour plot of soybean meal and corn starch

圖2　黃豆餅與CaCl2響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.2　Response surface plot and contour plot of soybean meal and CaCl2

圖3　黃豆餅與K2HPO4響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.3　Response surface plot and contour plot of soybean meal and K2HPO4

圖4　玉米粉與CaCl2響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.4　Response surface plot and contour plot of corn starch and CaCl2

圖5　玉米粉與K2HPO4響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.5　Response surface plot and contour plot of corn starch and K2HPO4

圖6　CaCl2與K2HPO4響應(yīng)面分析圖與相應(yīng)的等高線Fig.6　Response surface plot and contour plot of CaCl2 and K2HPO4

2.4最優(yōu)培養(yǎng)基組分驗(yàn)證

以上回歸模型預(yù)測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中黃豆餅、玉米粉、CaCl2與K2HPO4分別為25.73 g/L，12.57 g/L，0.25 g/L和0.43 g/L時(shí)，培養(yǎng)基達(dá)到最優(yōu)，其發(fā)酵液產(chǎn)伴胞晶體蛋白最多，預(yù)測(cè)可達(dá)179.4 mg/L.為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在培養(yǎng)基配方為黃豆餅25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl20.25 g/L，K2HPO40.43 g/L，ZnSO40.20 g/L，MgSO40.20 g/L，MnSO40.25 g/L和FeSO40.25 g/L時(shí)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示伴胞晶體蛋白為178.2 mg/L(175.6～179.2 mg/L).與預(yù)測(cè)值179.4 mg/L較接近，能很好地?cái)M合模型，說(shuō)明該模型有效.利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行YC-10菌株發(fā)酵培養(yǎng)，與優(yōu)化前發(fā)酵液中伴胞晶體蛋白最高值137.6 mg/L相比，提高了29.5%.

3結(jié)論和討論

在微生物發(fā)酵中，培養(yǎng)基的優(yōu)化常采用單因素法和正交實(shí)驗(yàn)法.單因素法只是針對(duì)某一因素的影響，沒(méi)有考慮培養(yǎng)基中多種成分之間的交互作用，很難獲得最佳優(yōu)化結(jié)果，同時(shí)，該方法也較費(fèi)時(shí)費(fèi)力.正交實(shí)驗(yàn)雖然可以考慮因子中的交互作用，但實(shí)驗(yàn)次數(shù)多，同時(shí)不能明確得到一個(gè)組分中所有因子和響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá)式，因此難以確定整個(gè)組分中各因子的最佳組合[10].響應(yīng)面分析法是一種集統(tǒng)計(jì)、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)多學(xué)科的用于因子優(yōu)化的綜合性方法，常用于研究多因子系統(tǒng)中各因子交互作用達(dá)到最大響應(yīng)值時(shí)所對(duì)應(yīng)的最佳條件[11].Sumant等人利用響應(yīng)面分析法對(duì)一株產(chǎn)堿性蛋白酶的芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使其堿性蛋白酶產(chǎn)量提高了2.6倍[12].本研究通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，快速有效地從8個(gè)能影響B(tài)t產(chǎn)生伴胞晶體蛋白的因子中篩選出4個(gè)顯著性影響因子.利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)法確定了4種重要影響因子的質(zhì)量濃度范圍，并結(jié)合響應(yīng)面分析法快速確定了培養(yǎng)基最佳濃度組合：黃豆餅25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl20.25 g/L，K2HPO40.43 g/L，ZnSO40.20 g/L， MgSO40.20 g/L，MnSO40.25 g/L和FeSO40.25 g/L.在最佳培養(yǎng)基組合下，Bt菌株YC-10伴胞晶體蛋白產(chǎn)量可達(dá)178.2 mg/L，比優(yōu)化前提高了29.5%，與理論預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行Bt菌株YC-10發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是合理可靠的.

有關(guān)Bt培養(yǎng)優(yōu)化方面的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，但基本都以發(fā)酵液中菌株生長(zhǎng)濃度或孢子產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)[13～15]，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的篩選，而以Bt伴胞晶體蛋白產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)報(bào)道很少.盡管Bt菌株發(fā)酵中芽胞的產(chǎn)生與晶體蛋白含量具有相關(guān)性，但是活芽胞數(shù)量卻并不能反映出發(fā)酵液的毒力.Bt對(duì)害蟲(chóng)的毒殺作用取決于其產(chǎn)生的伴胞晶體毒素蛋白，伴胞晶體蛋白產(chǎn)量直接決定其殺蟲(chóng)效價(jià).所以，利用發(fā)酵液中產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白濃度作為培養(yǎng)基篩選優(yōu)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)，能可靠地反映其毒力.伴胞晶體蛋白的產(chǎn)生直接受到培養(yǎng)基中碳源、氮源、鹽離子等因素的影響，所以通過(guò)調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基配方以提高Bt產(chǎn)生伴胞晶體蛋白的能力，對(duì)該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有重要意義.

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(編輯WJ)

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.04.004

收稿日期：2015-09-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171826)；行業(yè)科技專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201103018)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13JJ3127)

*通訊作者,E-mail：haosliu@163.com;dyzhang78@163.com

中圖分類號(hào)Q936

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1000-2537(2016)04-0023-06

Optimization of Fermentation Medium ofBacillusThuringiensisYC-10 by Response Surface Methodology

CHENGFei-xuea,SONGZhi-qianga,WANGJianb,WANGZhong-yonga,CHENGJu-ea,ZHANGDe-yonga*,LIUYonga*

(a.Institute of Plant Protection, b. Hunan Agricultural Economy and Regional Planning Research Institute,Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

AbstractThe optimization of fermentation medium for crystal protein production by strain YC-10 of Bacillus thuringiensis was investigated. Firstly, four of the most significant influence factors were screened by the method of Plackett-Bunnan design as soybean meal, corn starch, CaCl2 and K2HPO4. Then, the optimal combined concentration and mutual effect of four factors were optimized by response surface methodology. Our results showed that the best medium composition was soybean meal 25.73 g/L, corn starch 12.57 g/L, CaCl2 0.25 g/L, K2HPO4 0.43 g/L, ZnSO4 0.20 g/L, MgSO4 0.20 g/L, MnSO4 0.25 g/L and FeSO4 0.25 g/L.

Key wordsBacillus thuringiensis; media optimization; response surface methodology; parasporal crystals