多重PCR-DHPLC快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌

晚觀生，　劉曉玉，　鄭秋月，　徐君怡，　曹際娟*

1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001

?

多重PCR-DHPLC快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌

晚觀生1，劉曉玉1，鄭秋月2，徐君怡2，曹際娟2*

1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001

摘要：應(yīng)用多重PCR(motiplex PCR)結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)建立了快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O111和O157的方法。以基因wzxO111、rfbEO157為靶基因，建立多重PCR-DHPLC方法，進(jìn)行特異性和靈敏度測(cè)試，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)比較靈敏度。該方法具有良好特異性，可以一次PCR擴(kuò)增同時(shí)檢測(cè)O111、O157；靈敏度達(dá)到25 CFU/mL。129份牛肉樣品中檢出1例O111，3例O157陽(yáng)性；74份雞肉樣品中檢測(cè)出O111、O157陽(yáng)性各1例，67份蔬菜樣品中未檢測(cè)到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，適用于產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌篩選檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 變性高效液相色譜； 檢測(cè)； 產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一類危害嚴(yán)重的食源性病原菌，能引起人類嚴(yán)重疾病，如出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒癥(HUS)等，甚至引起死亡,已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。根據(jù)血清型的不同可將STEC分為O157STEC和非O157STEC。除了致病型O157型STEC外，非O157型STEC中O111菌株近年來(lái)成為高致病力菌株，對(duì)人類的健康也存在嚴(yán)重威脅。人類通過(guò)食用被污染的食物和飲水而感染此類病原菌[3-4]。

目前，產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌鑒定仍主要依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定和血清學(xué)方法[5-6]。由于產(chǎn)STEC種屬之間或與其他大腸桿菌生化反應(yīng)極為相似，難于分離，不同的“O”血清型之間還存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致菌株無(wú)法準(zhǔn)確鑒定。而且進(jìn)口血清價(jià)格昂貴，國(guó)產(chǎn)血清效價(jià)不穩(wěn)定，傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，已無(wú)法滿足當(dāng)今食品安全快速發(fā)展的需求[7]。DHPLC方法可以穩(wěn)定準(zhǔn)確從種屬菌株水平鑒別微生物, 彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化鑒定方法的缺陷。本文通過(guò)非變性條件下，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件及DHPLC洗脫梯度，建立了多重PCR-DHPLC快速檢測(cè)O111、O157的方法。具有快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好及敏感性高等特點(diǎn)[11-14]。

1材料

1.1菌種

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)，其他菌株分別購(gòu)自ATCC和中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)，或?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室或其他檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室分離鑒定獲得的分離株。

1.2主要培養(yǎng)基

改良蛋白胨大豆肉湯(TSB+1.5 g/L膽鹽三號(hào)mTSB)；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯；營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面；科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基；3M大腸桿菌/大腸菌群快速檢測(cè)紙片；O111特異診斷血清(寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司)；O157特異診斷血清(丹麥國(guó)立血清研究所)。

1.3主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit)，Multiplex PCR Assay Kit Ver.2等試劑購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司。三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購(gòu)自Transgenomic公司；乙腈(色譜純)購(gòu)自Fisher公司；DHPLC緩沖液：緩沖溶液A為50 mL TEAA、250 μL乙腈定容至1 000 mL；緩沖溶液B為50 mL TEAA、250 mL乙腈定容至1 000 mL；緩沖溶液D為75%乙腈[15]。

表1　試驗(yàn)菌種及其編號(hào)

1.4引物和探針

實(shí)時(shí)熒光PCR特異引物序列及探針由寶生物(大連)工程有限公司設(shè)計(jì)合成， 見(jiàn)表2。多重PCR中wzxO111、rfbEO157引物分別引用文獻(xiàn)16、17，由寶生物(大連)工程有限公司合成(見(jiàn)表3)。

表2　熒光定量PCR引物及探針信息

注：(—)表示無(wú)需標(biāo)記

1.5儀器設(shè)備

普通PCR 儀PE24000(PerkinElmer公司，美國(guó))；變性高效液相色譜儀NAV-99-4500(Transgenomic 公司，美國(guó))； Vii7數(shù)字熒光定量PCR(美國(guó)ABI儀器公司)； VITEK2-30全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)。

表3　普通PCR引物信息

2試驗(yàn)方法

2.1DNA模板提取

取表1中20株所試菌株進(jìn)行普通肉湯增菌培養(yǎng)。提取細(xì)菌基因組DNA, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2RT-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)比對(duì)建立最適反應(yīng)體系:PremixExTaq(Probe qPCR)(2×)12.5 μL；ROX Reference Dye II(50×)0.5 μL；上下游引物(10 μM)各0.5 μL；TaqMan Probe 1 μL； DNA模板2 μL；水8 μL，總體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；56 ℃退火(延伸)34 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.3多重PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

多重PCR反應(yīng)體系：2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)25 μL；Multiplex PCR Enzyme Mix 0.25 μL；各引物對(duì)1 μL；模板DNA 2 μL；加水補(bǔ)足50 μL體系。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 60 s；94 ℃變性30 s；57 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

2.4DHPLC分析條件

色譜柱:PS-DVB& C18 DNASep色譜柱(4.6 mm×50 mm, 粒度3 μm)；柱溫：50 ℃。流動(dòng)相：0 min，55 % 緩沖溶液A，45%緩沖溶液B；0.5 min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B；3.6 min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B；6.8 min，38.2%緩沖溶液A，61.8% 緩沖溶液B；9.9 min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B；13 min，35%緩沖溶液A，65%緩沖溶液B；流速：0.9 mL/min。上樣量：PCR產(chǎn)物5 μL[18-19]。

2.5特異性試驗(yàn)

取表1中20株細(xì)菌建立DNA模板庫(kù), 進(jìn)行RT-PCR特異性檢測(cè)，同時(shí)采用2.4中DHPLC方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6靈敏度試驗(yàn)

各取1 mL標(biāo)準(zhǔn)菌株O111、O157增菌液，梯度稀釋，取10-6、10-7兩個(gè)梯度1 mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)梯度兩個(gè)平行，采用GB4789.2-2010進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[20]。分別采用RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。

2.7實(shí)際樣品檢測(cè)

最后隨機(jī)抽取送檢至遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室的129份冷凍牛肉、74份雞肉、67份蔬菜樣品，采用本文建立的RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。

3結(jié)果分析

3.1特異性試驗(yàn)

RT-PCR特異性試驗(yàn)中只有O111、O157目標(biāo)菌株出現(xiàn)特異性陽(yáng)性擴(kuò)增如圖1、圖2，其他參考菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性。多重PCR-DHPLC檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明O111具有特異性吸收峰，O157特異性吸收峰明顯，其他對(duì)照菌株均未出現(xiàn)明顯的吸收峰，表明本文的引物特異性良好。

圖1　O111 RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

圖2　O157 RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

A. O111(ATCC 43887)特異吸收峰； B. O157(CICC 21530)特異吸收峰

C. O111(ATCC 43887)特異吸收峰；

D. O157(CICC 21530)特異吸收峰

3.2靈敏度試驗(yàn)

結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明本文建立的多重PCR-DHPLC方法與RT-PCR方法，最低檢測(cè)限均達(dá)到2.5×101CFU/mL。

表4　mPCR-DHPLC與RT-PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果

+：代表陽(yáng)性-：代表陰性

3.3實(shí)際樣品檢測(cè)

本文建立的多重PCR-DHPLC方法與RT-PCR方法檢測(cè)129份樣品，牛肉樣品中檢出1份O111陽(yáng)性、3份O157陽(yáng)性；74份雞肉中檢出1份O157陽(yáng)性，未檢測(cè)到O111，67份蔬菜中未檢測(cè)到O111及O157如表5。

4討論

本文建立了多重PCR結(jié)合DHPLC準(zhǔn)確快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O111、O157。通過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響多重PCR結(jié)果主要是PCR反應(yīng)的退火溫度及延伸時(shí)間，同時(shí)引物對(duì)的濃度也直接影響方法的特異性和靈敏度。通過(guò)與RT-PCR靈敏度比較發(fā)現(xiàn)，該方法不僅保證與RT-PCR具有相同的靈敏度，還可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，而且省去了探針設(shè)計(jì)的過(guò)程，避免了由探針問(wèn)題造成假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，自動(dòng)化可更好的適用于食品檢測(cè)。本文從實(shí)際樣品中分離出來(lái)的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌陽(yáng)性菌株，通過(guò)血清型鑒定，均證實(shí)為產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，證明多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法具有廣泛的適用性。

表5　mPCR-DHPLC與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

在食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌常為低污染量存在，常規(guī)直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn) 影響了該菌的檢出率，達(dá)不到相關(guān)食品檢驗(yàn)監(jiān)管部門檢測(cè)要求。開(kāi)展不同食品基質(zhì)中目標(biāo)菌分離方法研究，采用免疫磁珠技術(shù)富集分離食品中低污染量產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，是本文下一步研究方向。本文將在現(xiàn)有成果基礎(chǔ)上進(jìn)行樣品中目標(biāo)菌富集方法研究，解決不同基質(zhì)對(duì)菌體活性干擾、降解因素難題，開(kāi)展納米磁珠高效富集分離低污染量產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的方法，解決目標(biāo)菌檢出率低的難題。建立納米磁珠高效富集結(jié)合多重PCR-DHPLC檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的檢測(cè)效率。

參考文獻(xiàn)

[1]米潤(rùn)昭,孫輝臣.產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌感染研究進(jìn)展[J] .華北國(guó)防醫(yī)藥,2002,14(6):392-394.

[2]羅霞,徐建國(guó).產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌的研究進(jìn)展[J].疾病檢測(cè), 2006,21(4):217-220.

[3]Mathusa EC, Chen YH, Enache E,etal.Non-O157 Shiga Toxin ProducingEscherichiacoliin Foods[J].Journal of Food Protection,2010,73(9):1721-1736.

[4]周勇,陳守義.產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌流行病學(xué)和stx基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011,27(12):1130-1132 .

[5]孫洋,馮書(shū)章,郭學(xué)軍等.腸出血性大腸桿菌O157膠體金免疫層析試紙條的研制[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2008, 24(4):356-359.

[6]宋宏新,馬冬,薛海燕等. 雙抗夾心ELISA法定量檢測(cè)食品中大腸桿菌O157:H7初探[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 528-530.

[7]李夢(mèng),韓國(guó)成,劉又.年用于分離大腸桿菌O157:H7的免疫磁珠的制備與表征[J].應(yīng)用化工,2012, 41(6):1043-1047.

[8]樊杰,伏小平.O157:H7型大腸桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008,38(01): 15-19.

[9]胡慧,陳雅君,段志剛等.大腸桿菌O157:H7特異基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J].食品科學(xué),2011,32(12):278-282.

[10]徐德順,沈月華,程平慶.大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,21(4):174-177.

[11]徐君怡,曹際娟,鄭秋月等.變性高效液相色譜檢測(cè)食品中致瀉性大腸桿菌[J].微生物學(xué)報(bào), 2008,48(11):1526-1531.

[12]Coombes BK, Wickham ME, Mascaerhas M,etal. Molecular analysis as an aid to assess the public health risk of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli stains[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(7):2153-2160.

[13]EAVES DJ, LIEBANA E, WOODWARD ML,etal. Detection of gyrAmutations in quinolone-resistantSalmonellaentericaby denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(11): 4121-4125.

[14]William H, Elizabeth B, Rebecca SK. Use of denaturing high-performance liquid chromatography to ident- ify Bacillus anthracis by analysis of the 16S-23S rRNA Interspacer Region and gyrA Gene[J].Journal of Clinical Microbiology, 2003,41(10): 4758-4766.

[15]徐義剛,崔麗春,李蘇龍等.多重 PCR-DHPLC檢測(cè)4種主要致腹瀉性大腸埃希氏菌方法的建立與應(yīng)用[J].食品科學(xué),2010,31(20):293-296.

[16]Paddock Z, Shi X, Bai J,etal.Applicability of a multiplex PCR to detect O26,O45,O103,O111,O121,O145 and O157 serogrous ofEscherichiacoliin cattle feces.Veterinary,2012,156(3):381-388.

[17]徐君怡,曹際娟,鄭秋月等.變性高效液相色譜檢測(cè)沙門氏菌、空腸彎曲菌和腸出血性大腸桿菌[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,3:128-137.

[18]徐君怡,曹際娟,鄭秋月等.多重PCR-變性高效液相色譜檢測(cè)食品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(3):208-212.

[19]Franciosa G, Pourshaban M, De Luca A,etal.Identification of type A,B,E,and F botulinum neurotoxin genes and of botulinum neurotoxigenic clostridia by denaturing high-performance liquid chromatography.Appl Environ Microbiol,2004,70:4170-4176.

[20]GB4789.2-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.008

基金項(xiàng)目：質(zhì)檢總局課題(2015IK168)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201210043)。

作者簡(jiǎn)介：晚觀生(1990～)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭称钒踩c檢驗(yàn)檢疫。E-mail:wanguansheng@126.com。 *通訊作者：曹際娟，女，博士，研究員，主要研究方向?yàn)槭称钒踩c檢驗(yàn)檢疫。E-mail:caojijuanlnciq@163.com。

Rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli by multiplex PCR and DHPLC

WAN Guan-sheng1, LIU Xiao-yu1, ZHENG Qiu-yue2, XU Jun-yi2, CAO Ji-juan2

1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China, Dalian 1160001, China

AbstractThe method of multiplex PCR combined with denaturing high-performance liquid chromatography was established for rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 in food. The multiplex PCR assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 was developed using primers with specifically amplifing segments of wzxO111 and rfbEO157 genes. The method was carried out for specificity and sensitivity testing and its sensitivity was compared with RT-PCR method at the same time. Results indicated that the multiplex PCR-DHPLC had good specificity; a PCR amplification could detect both O111 and O157 simultaneously. The detection limit of the mPCR was 25 CFU/mL for sensitivity. One of O111 and three of O157 were detected in 129 beef meat samples. In 74 chicken meat samples contained one of O111 and one of O157. Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 were not detected in 67 vegetables. As a result, the multiplex PCR-DHPLC detection method for O111, O157 was simple, specific and suitable for Shiga toxin Escherichia coli screening test.

Key wordsmultiplex polymerase chain reaction (mPCR); denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC); detection; Shiga toxin-producing Escherichia coli