釀酒酵母生物合成胞磷膽堿的條件優(yōu)化

易鳳炎，　陳燕妮，　邱蔚然，　周長(zhǎng)林*

1. 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇 南通 226200

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釀酒酵母生物合成胞磷膽堿的條件優(yōu)化

易鳳炎1,2，陳燕妮1，邱蔚然2，周長(zhǎng)林1*

1. 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇 南通 226200

摘要：通過(guò)優(yōu)化胞磷膽堿底物濃度的發(fā)酵條件，提高釀酒酵母發(fā)酵菌濃及胞磷膽堿轉(zhuǎn)化率。 分別以胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等底物和反應(yīng)關(guān)聯(lián)物質(zhì)誘導(dǎo)釀酒酵母，采用單因素變量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。 優(yōu)化后，釀酒酵母C401菌株搖瓶培養(yǎng)的菌濃為70 g/L，胞磷膽堿轉(zhuǎn)化率為53.3%，比誘導(dǎo)前提高了33.5%。30 L發(fā)酵中菌濃可達(dá)90.5 g/L，胞磷膽堿轉(zhuǎn)化率為59%。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母； 胞磷膽堿； 底物誘導(dǎo)； 發(fā)酵

胞磷膽堿(CDPC)全稱(chēng)胞苷-5′-二磷酸膽堿，屬于核酸類(lèi)生化藥物。它是治療腦意識(shí)障礙的首選藥物[1]，對(duì)于腦外傷引起的腦昏迷、腦卒中后遺癥的功能恢復(fù)及老年癡呆等病癥都有獨(dú)特的療效，具有極好的應(yīng)用前景。20世紀(jì)50年代，Kennedy博士等人[2]發(fā)現(xiàn)并確定胞磷膽堿鈉分子結(jié)構(gòu)，稍后Rosseter等[3]闡明其功能。中國(guó)自20世紀(jì)70年代研究了利用酵母細(xì)胞生產(chǎn)胞磷膽堿的方法[4]，牛紅星[5]等利用固定化技術(shù)生產(chǎn)胞磷膽堿的方法，顧復(fù)昌[6]等利用啤酒酵母生物合成胞磷膽堿的方法，宋麗芳[7]等利用東方伊薩酵母生物合成胞磷膽堿的方法。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母CGMCC2.603為出發(fā)菌種，分別利用胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等底物和反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)誘導(dǎo)篩選出C401菌種，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方，30L發(fā)酵罐單因素變量實(shí)驗(yàn)，提高了C401的菌濃，并通過(guò)發(fā)酵后處理提高了CDPC摩爾轉(zhuǎn)化率(以下簡(jiǎn)稱(chēng)轉(zhuǎn)化率)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種

釀酒酵母CGMCC2.603，中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(%)：酵母浸膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖1，瓊脂粉2，pH自然，0.8×105Pa滅菌20 min。

揺瓶和發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，(NH3)2HPO43，pH 5.0。搖瓶培養(yǎng)基0.8×105Pa滅菌20 min，發(fā)酵培養(yǎng)基90 ℃消毒20 min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母篩選方法

取斜面培養(yǎng)菌體2環(huán)接入裝有50 mL含有胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等誘導(dǎo)物的搖瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，將其轉(zhuǎn)接裝有400 mL含有胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，經(jīng)離心處理收集菌體，-40 ℃凍存25 d，測(cè)定釀酒酵母生物合成CDPC的轉(zhuǎn)化率。

1.2.2菌濃測(cè)定方法

用5 mL移液管移取4 mL待測(cè)菌液置入質(zhì)量為m0的空EP管中，12 000 r/min離心4 min，棄去上清液，稱(chēng)重即為m1，則菌濃為(m1-m0)×1 000/4 g/L。

1.2.3CDPC轉(zhuǎn)化率測(cè)定方法

在200 mL、pH 6.5含有30 mmol/L胞苷酸、21 mmol/L磷酸膽堿、25 mmol/L葡萄糖和27 mmol/L硫酸鎂等反應(yīng)液中加入凍存菌體46 g，33 ℃，150 r/min反應(yīng)2.5 h，補(bǔ)葡萄糖3.4 g，繼續(xù)反應(yīng)，4.0 h取樣。12 000 r/min離心4 min，取上清液10 μL在瓊脂糖凝膠板點(diǎn)樣，電泳5 min，切取CDPC條帶加入0.01 mol/L鹽酸溶液5 mL，沸水浴5 min測(cè)定A280nm，利用CDPC瓊脂糖電泳測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算轉(zhuǎn)化率[8]。

1.2.4菌種發(fā)酵方法

種子液以5%接種量接種于30 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通氣量為0.55 m3/h，pH維持在4.0以上，分別改變攪拌槳組合和位置、裝液量、攪拌速度和接種種齡，發(fā)酵11 h，經(jīng)抽濾處理收集菌體，-18 ℃凍存7 d ～10 d，測(cè)定CDPC的轉(zhuǎn)化率。

1.2.5殘?zhí)菧y(cè)定方法

DNS法測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛萚9]。

2結(jié)果

2.1生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母誘導(dǎo)物優(yōu)化

在揺瓶培養(yǎng)基中加入不同濃度的胞苷酸進(jìn)行底物誘導(dǎo)，由圖1(A)可知，當(dāng)胞苷酸在低濃度時(shí)，隨著其濃度增加，誘導(dǎo)作用明顯提高，但其濃度達(dá)到10 mmol/L以上時(shí)，其誘導(dǎo)作用反而降低，這一現(xiàn)象與該反應(yīng)在CMP一定濃度后存在底物抑制是相符的，故通過(guò)CMP底物誘導(dǎo)提高CDPC轉(zhuǎn)化率必須在較低濃度下才有效，以CMP 10 mmol/L為最佳濃度誘導(dǎo)時(shí)，其CDPC轉(zhuǎn)化率可從19.9%提高到53.3%。在揺瓶培養(yǎng)基中加入不同濃度的磷酸膽堿進(jìn)行底物誘導(dǎo)，由圖1(B)可知，磷酸膽堿濃度10 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)效果最佳，CDPC轉(zhuǎn)化率從19.9%提高到31.2%。在揺瓶培養(yǎng)基中加入不同濃度的硫酸鎂誘導(dǎo)，由圖1(C)可知，硫酸鎂濃度12g/L時(shí)，CDPC轉(zhuǎn)化率可從19.9%提高到23.7%。在揺瓶培養(yǎng)基加入不同濃度的乙醇誘導(dǎo)，由圖1(D)可知，隨著乙醇濃度增加，CDPC轉(zhuǎn)化率基本呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明乙醇有阻遏作用。

圖1　生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母誘導(dǎo)物優(yōu)化

2.2搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化

在酵母浸膏1%～4%，糖蜜1%～5%，磷酸氫二銨0.1%～0.3%的條件下，按六西格瑪DOE(Design Of Experiment，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))表格設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用minitab 15軟件對(duì)菌濃響應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，最佳培養(yǎng)基配方(%)：糖蜜5，酵母浸膏4，磷酸氫二銨0.3，pH 5.0。若用葡萄糖代替糖蜜，結(jié)果如表2，培養(yǎng)基配方(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，磷酸氫二銨0.3，pH 5.0。在培養(yǎng)基中加入不同量的生物素，結(jié)果如圖2。此時(shí)生物素的添加，對(duì)于菌濃無(wú)明顯提升，因此在培養(yǎng)基中不需添加生物素。經(jīng)上述搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化，C401菌種搖瓶培養(yǎng)菌濃為70 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基也沿用此配方。

表1　培養(yǎng)基優(yōu)化的DOE實(shí)驗(yàn)表

表2　用葡萄糖代替糖蜜的培養(yǎng)基表

圖2　生物素量對(duì)菌濃的影響

2.3搖瓶培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌濃和CDPC轉(zhuǎn)化率的影響

將50 mL揺瓶菌液接種到400 mL揺瓶培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每4 h取樣測(cè)定菌濃，培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖3(A)，培養(yǎng)8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌濃為70 g/L，培養(yǎng)至48 h菌濃為81 g/L。分別取不同培養(yǎng)時(shí)間菌體測(cè)定CDPC轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖3(B)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，CDPC轉(zhuǎn)化率明顯提高，但其時(shí)間達(dá)到24 h以上時(shí)，CDPC轉(zhuǎn)化率反而降低，培養(yǎng)24 h的菌體CDPC轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)53%。

圖3　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌濃和CDPC轉(zhuǎn)化率的影響

2.430 L罐的發(fā)酵研究

2.4.1裝液量、攪拌速度、攪拌槳不同間距對(duì)氣液分散狀態(tài)的影響

在30 L罐(示意圖如圖4)上配置三層攪拌槳，其中上層槳和底槳為六平葉Rushton渦輪徑向流槳，中層槳為四斜葉開(kāi)啟渦輪軸向流槳，三層槳槳徑均為D=0.4T，底槳離底距離C1，上層槳離液面距離△H，中層槳離底槳距離C2。攪拌槳不同組合間距如表4所示，在攪拌槳間距為組合1時(shí)，以清水為工作介質(zhì)，攪拌轉(zhuǎn)速在300 r/min以上，常溫下操作，裝液量18 L～20 L時(shí)呈載氣狀態(tài)，裝液量不在此范圍呈氣泛狀態(tài)。在攪拌槳間距為組合2時(shí)，以清水為工作介質(zhì)，攪拌轉(zhuǎn)速在250 r/min以上，常溫下操作，裝液量17 L～21 L時(shí)呈載氣狀態(tài)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，組合2比組合1更好。

圖4　30 L罐示意圖

表3　攪拌槳不同間距組合方式

2.4.2發(fā)酵研究

在攪拌槳間距為組合2，接種量為5%的條件下，研究了不同攪拌轉(zhuǎn)速、裝液量和接種種齡對(duì)菌濃的影響。攪拌轉(zhuǎn)速如圖5(A)所示，400 r/min 的溶氧(DO)較好，菌濃最高達(dá)36 g/L。裝液量如圖5(B)所示，裝液量20 L的DO較好，在2.4.1所述的17 L～21 L載氣狀態(tài)范圍內(nèi)，與15 L氣泛狀態(tài)相比，18 L、20 L裝液量發(fā)酵狀態(tài)的DO均高于15 L裝液量發(fā)酵狀態(tài)的DO。在17 L～21 L載氣狀態(tài)時(shí)，18 L要優(yōu)于20 L，此時(shí)菌濃可達(dá)40 g/L。接種種齡如圖5(C)所示，接種種齡為26 h較好，此時(shí)比生長(zhǎng)速率大，菌濃可達(dá)41 g/L。

由2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)確定30 L罐發(fā)酵最優(yōu)條件為：在攪拌槳間距為組合2，接種量為5%的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，裝液量為18 L，接種種齡為26 h。

2.530 L罐補(bǔ)糖發(fā)酵

在2.4最優(yōu)發(fā)酵條件下雖參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行葡萄糖流加實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，方案1，起始葡萄糖濃度為20 g/L，殘?zhí)菨舛鹊陀?0 g/L時(shí)流加葡萄糖，菌濃可達(dá)42 g/L，與未補(bǔ)糖發(fā)酵比較菌濃無(wú)明顯提高。方案2，起始葡萄糖濃度減為10 g/L，殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時(shí)流加葡萄糖，菌濃可達(dá)68 g/L。方案3，起始葡萄糖濃度為10 g/L，殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時(shí)流加葡萄糖，菌濃可達(dá)90 g/L。由上述實(shí)驗(yàn)可知，起始葡萄糖10 g/L，殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時(shí)補(bǔ)糖效果最好。

2.6發(fā)酵后處理

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]無(wú)氧狀態(tài)下酶系比有氧狀態(tài)下酶系更利于生物合成CDPC，因此發(fā)酵后抽濾收集菌體，分別用2%葡萄糖溶液低溫浸泡不同時(shí)間。由圖7可知，隨著菌體浸泡時(shí)間從0 d增加到4 d，CDPC轉(zhuǎn)化率先增后減，其中菌體浸泡2 d時(shí)，CDPC轉(zhuǎn)化率最高為59%，比未浸泡組提高了6%。

圖5　發(fā)酵研究圖

3討論

經(jīng)10 mmol/L胞苷酸誘導(dǎo)篩選菌種C104，在葡萄糖4%、酵母浸膏4%、磷酸氫二銨0.3%、pH 5.0條件下，C104搖瓶菌濃可達(dá)70 g/L，底物轉(zhuǎn)化CDPC的轉(zhuǎn)化率為53.3%，比出發(fā)株提高了33.5%。在接種種齡26 h，裝液量18 L，攪拌速度400 r/min，三層攪拌槳間距0.55 T，下層攪拌槳到攪拌釜底距離0.36 T的條件下，30 L發(fā)酵液呈載氣狀態(tài)，流加葡萄糖發(fā)酵，菌濃可達(dá)90.5 g/L，發(fā)酵后將菌體用2%葡萄糖溶液低溫浸泡2 d，CDPC轉(zhuǎn)化率為59%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果已可應(yīng)用于CDPC產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，下階段任務(wù)將進(jìn)一步優(yōu)化CDPC反應(yīng)條件，進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化率。

圖6　30 L補(bǔ)糖發(fā)酵進(jìn)程曲線

圖7　30 L發(fā)酵后處理

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.007

基金項(xiàng)目：江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(NO.BA2012090)。

作者簡(jiǎn)介：易鳳炎(1992～)，女，碩士在讀生。E-mail：yifengyan@yeah.net。 E-mail:cl_zhou@cpu.edu.cn。

*通訊作者：周長(zhǎng)林(1964～)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域?yàn)槲⑸锎x調(diào)控和藥物生物合成。電話：025-83271323，

Optimization of fermentation conditions for citicoline biosynthesis bySaccharomycescerevisiae

YI Feng-yan1,2, CHEN Yan-ni1, QIU Wei-ran2, ZHOU Chang-lin1

1. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2. Nantong QZU Bioscience & Biotechnology Co. Ltd, Nantong 226200, China

AbstractIn order to increase fermentative cell concentration of Saccharemyces cerevisiae and to improve citicoline conversion rate, the substrates and fermentation conditions were optimized. Saccharomyces cerevisiae cells was induced by substrates and related reactants such as cylidylicacid(CMP), choline phosphate, magnesium sulfate and ethanol, respectively and the fermentation conditions were optimized by single factor variable experimental tests. The results showed that after optimization, the cell concentration of Saccharomyces cerevisiae C401 reached 70 g/L in the shake flask cultures, which was 33.5% higher than before. In 30 L fermentation test, the cell concentration was up to 90.5 g/L and the citicoline conversion rate reached 59%, respectively.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; citicoline; substrate induction; fermentation