常壓室溫等離子體誘變高通量篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產(chǎn)突變株

池亞斌，　顧　洋，　劉　龍, 2*，　李江華，　堵國成,2，　陳　堅,2

1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；2. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214122

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常壓室溫等離子體誘變高通量篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產(chǎn)突變株

池亞斌1，顧洋1，劉龍1, 2*，李江華1，堵國成1,2，陳堅1,2

1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；2. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214122

摘要：采用新型常壓室溫等離子體(ARTP)誘變產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6，并應(yīng)用顯色法和96孔板培養(yǎng)方法篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產(chǎn)突變株。研究表明顯色反應(yīng)時添加四硼酸鉀溶液1 μL、PDABA 125 μL、反應(yīng)時間5 min、反應(yīng)溫度96 ℃時，N-乙酰氨基葡萄糖檢測的準(zhǔn)確度最高。通過多輪ARTP誘變及高通量篩選最終獲得突變株(4A12)，3 L罐發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到36.14 g/L，較出發(fā)菌株(BSGN6)提高了65.32%。經(jīng)過50次傳代后性狀穩(wěn)定。ARTP誘變技術(shù)作為獲得產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖高產(chǎn)菌株的有效途徑，與分子生物學(xué)手段相比，本方法更加快捷高效。

關(guān)鍵詞：離子體(ARTP)誘變； N-乙酰氨基葡萄糖； 高通量篩選

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作為氨基葡萄糖(GlcN)的衍生物，被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)化學(xué)品和藥品行業(yè)中[1]。GlcNAc能夠提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)，因此能起到延長細(xì)胞壽命的作用[2]。研究表明，GlcNAc可以維持骨關(guān)節(jié)及軟骨組織的健康，對治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著功效[3]。此外，GlcNAc也可以有效的治療炎癥性腸病[4]。隨著人口老齡化的加劇以及GlcN和GlcNAc應(yīng)用領(lǐng)域的延伸，其全球需求量將會繼續(xù)增加。微生物發(fā)酵法因綠色、環(huán)保、不受原材料限制等優(yōu)點(diǎn)將成為N-乙酰氨基葡萄糖的首選生產(chǎn)方法[5]。本研究室在前期研究中通過代謝工程改造技術(shù)，獲得一株具有較高GlcNAc合成效率的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株BSGN6[2, 6, 7]。

常壓室溫等離子體(ARTP)生物誘變育種技術(shù)，因其具有射流溫度低(25 ℃～35 ℃)、對環(huán)境和人體無害、設(shè)備操作簡單等優(yōu)勢，目前已被廣泛的應(yīng)用于生物誘變育種領(lǐng)域[8]。研究表明，阿維鏈霉菌、發(fā)孢甲基變菌、酵母等微生物通過ARTP誘變，均能夠成功篩選得到高產(chǎn)突變株[8]。

然而目前，尚未有使用ARTP技術(shù)誘變結(jié)合高通量篩選方法誘變篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產(chǎn)突變菌的報道。本研究首次將ARTP誘變技術(shù)與96深孔板高通量篩選方法應(yīng)用于篩選獲得產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖誘變高產(chǎn)菌，建立并優(yōu)化高通量篩選方法，并利用該方法成功篩選得到一株N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量高、氮源轉(zhuǎn)化效率高、葡萄糖轉(zhuǎn)化效率高的突變株(4A12)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6

1.1.2培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌121 ℃，15 min。

(2)種子培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌121 ℃，15 min。

(3)誘變篩選培養(yǎng)基 ① (g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖60(單獨(dú)滅菌)，木糖5(單獨(dú)滅菌)，15 mL微量元素溶液。

誘變篩選培養(yǎng)基 ②(g/L)：酵母粉2，蛋白胨1，硫酸銨1，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3(單獨(dú)滅菌)，葡萄糖60(單獨(dú)滅菌)，木糖5(單獨(dú)滅菌)，15 mL微量元素溶液。

(4)上罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5, MgSO4·7H2O 3，葡萄糖30(單獨(dú)滅菌)，15 mL微量元素溶液。補(bǔ)料：葡萄糖800 g/L。115 ℃滅菌15 min。

(5)微量元素溶液(g/L)：CaCl24.0(單獨(dú)滅菌),MnSO4·5H2O 1.0, CoCl2·6H2O 0.4, NaMoO4·2H2O 0.2, ZnSO4·7H2O 0.2, AlCl3·6H2O 0.1, CuCl2·H2O 0.1, H3BO40.05。

1.1.3培養(yǎng)條件

(1)斜面培養(yǎng)

挑取甘油管保藏菌種劃線接種到斜面上進(jìn)行活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h左右。

(2)96深孔板種子培養(yǎng)

用無菌牙簽將種子接至裝有100 μL種子培養(yǎng)基的96淺孔板中，置于96板搖床，600 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng)10 h。

(3)96深孔板發(fā)酵

取2 μL的種子接入裝有600 μL的96深孔板板，置于96板搖床，900 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng)48 h。

(4)搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)

接一環(huán)經(jīng)斜面活化的斜面種子到裝有25 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，8層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，220 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h。

(5)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

5℅的接種量將種子培養(yǎng)基接入裝有95 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，220 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。

(6) 3 L發(fā)酵罐上補(bǔ)料發(fā)酵

以3%(v/v)接種量將活化好的種子液接至3 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為1.5 L，培養(yǎng)溫度為37 ℃。使用3 mol·L-1的鹽酸溶液及25%(v/v)的氨水調(diào)節(jié)pH，使其維持7.0。通氣量為1.5 vvm，初始攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min 。當(dāng)菌體達(dá)到一定濃度(OD600為0.4時)，添加木糖(終濃度5 g·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)酵培養(yǎng)基含20 μg·mL-1的卡納霉素，葡萄糖初始溶度為20 g·L-1，采用反饋式葡萄糖流加(控制葡萄糖濃度在5 g·L-1)[9]。

1.2方法

1.2.1ARTP誘變操作

本研究使用ARTP對產(chǎn)GlcNAc基因工程菌BSGN6進(jìn)行誘變處理，以高純氦氣作為工作氣體。在電源功率100 W、氣流量10 L/min、等離子體發(fā)射源照射樣品距離2 mm對10 μL菌液(106～107)CFU個/mL進(jìn)行處理,分別考察了5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s和60 s時細(xì)胞的致死率[8][10]。

致死率計算公式：

注：其中U為不經(jīng)過誘變處理對照菌的總菌數(shù)；T為誘變處理后的總菌數(shù)。

1.2.2高通量篩選方法的建立

為了快速高效篩選到GlcNAc高產(chǎn)菌株，本研究建立了比色法高通量檢測GlcNAc以及利用96深孔板高通量篩選的方法。高通量篩選方法流程如圖1所示。首先將誘變后涂布平板上長出的菌落接種于96潛孔板中作為種子液，37 ℃培養(yǎng)10 h后，取2 μL轉(zhuǎn)接至96深孔板誘變篩選培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心取2 μL上清液于96 PCR板中，加入43 μL超純水以及1 μL四硼酸鉀溶液(1.5 g四硼酸鉀溶解于25 mL超純水)后于96 ℃金屬浴加熱5 min，結(jié)束反應(yīng)。取10 μL反應(yīng)液于96淺孔板，向其中添加125 μL PDABA溶液(1 g對二甲基苯甲醛溶解于100 mL含1.25%鹽酸的冰醋酸中)，于37 ℃ 96板搖床反應(yīng)10 min，利用酶標(biāo)儀測定A585處吸光值，吸光值與GlcNAc的含量成正相關(guān)。根據(jù)酶標(biāo)儀測定的數(shù)據(jù)，在96淺板中找出最高產(chǎn)量對應(yīng)的突變株，并將其作為下一輪出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理。經(jīng)過多輪誘變后，將最終初篩獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證。

圖1　高通量篩選方法流程圖

1.2.3GlcNAc的檢測方法

GlcNAc的檢測采用高效液相色譜法(HPLC)，檢測條件如表1。

表1　HPLC法測定GlcNAc糖相關(guān)條件

2結(jié)果與討論

2.1高通量篩選方法的建立

綜合國內(nèi)外報道，常用檢測GlcNAc的方法有苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法、DNS法、改進(jìn)的Schales、Elson-Morgan、Reissig等。這些方法已經(jīng)有研究者對其進(jìn)行了深入的研究，研究發(fā)現(xiàn)Reissig方法具有靈敏度高，重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[11]。因此在本研究中采用Reissig方法用來檢測GlcNAc。然而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將Reissig方法終反應(yīng)體系縮小至150 μL時，檢測0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標(biāo)樣線性關(guān)系較差，R2只有0.8。因此本研究需要對該方法進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠在較小的應(yīng)體系也能保證較高的準(zhǔn)確性。

將0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標(biāo)樣線性關(guān)系R2值作為考察因素分別優(yōu)化四硼酸鉀添加量、PDABA添加量、反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度對，之后設(shè)計正交試驗(yàn)設(shè)計以確定最合適反應(yīng)條件。

2.1.1四硼酸鉀添加量的確定

為了確定合適的四硼酸鉀添加量，本文首先單一考察了四硼酸鉀添加量對顯色反應(yīng)的影響，向檢測0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標(biāo)樣反應(yīng)體系中各添加了1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、9 μL、11 μL和13 μL的四硼酸鉀。測定的R2如圖所示，結(jié)果顯示當(dāng)添加3 μL時線性關(guān)系最佳，R2達(dá)到0.9。

2.1.2PDABA添加量的確定

PDABA的添加量對顯色反應(yīng)具有重要的影響，添加量不夠會導(dǎo)致顯色不充分。同時PDABA自身溶液呈黃色，添加過多也會影響吸光值的大小。本研究中考察了添加25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、150 μL和200 μL時對表樣線性關(guān)系的影響。如圖3所示，當(dāng)PDABA添加量為125 μL時，線性關(guān)系最佳，R2達(dá)到0.91。

圖2　四硼酸鉀添加量對R2的影響

圖3　PDABA添加量對R2的影響

2.1.3反應(yīng)時間的確定

不同的反應(yīng)時間也會造成顯色的差異，反應(yīng)時間過短，會造成顯色不充分，測出的數(shù)值偏低。本研究中分別考察了1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min對顯色反應(yīng)的影響，如圖4所示，反應(yīng)時間為3 min左右時，效果最佳，R2達(dá)到0.88。

2.1.4反應(yīng)溫度的確定

Reissig方法中反應(yīng)條件是沸水浴，為了方便操作，在本實(shí)驗(yàn)中我們采用的是96 PCR板金屬浴。因此需要確定最佳反應(yīng)溫度，我們研究了90 ℃、91 ℃、92 ℃、93 ℃、94 ℃、95 ℃、96 ℃、97 ℃、98 ℃、99 ℃和100 ℃對顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為96 ℃時效果較好。

圖4　反應(yīng)時間對R2的影響

圖5　反應(yīng)溫度對R2的影響

2.1.5正交試驗(yàn)設(shè)計

四硼酸鉀添加量、PDABA添加量、反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度4個因素，以R2為指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)[12]，各水平因素見表2-1。設(shè)計9組試驗(yàn)，各組試驗(yàn)結(jié)果及方差分析表見表2-2及表2-3。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最佳組合為：四硼酸鉀添加量1 μL、PDABA添加量125 μL、反應(yīng)時間3 min、反應(yīng)溫度95 ℃，與單因素組合優(yōu)化的產(chǎn)量相比相差不大。

表2-1　各因素水平表

2.2ARTP致死率曲線測定

根據(jù)1.3所述對產(chǎn)GlcNAc工程菌BSGN6的ARTP致死率進(jìn)行測定，致死率曲線如圖6所示。

從圖6可以看出，當(dāng)ARTP誘變處理時間為10 s時，致死率可以達(dá)到98%。有研究表明，將致死率控制在95%～99%之間，可有利于獲得正向突變菌株。因此在本研究中，我們將誘變處理時間設(shè)定為10 s。

表2-2　R2正交試驗(yàn)結(jié)果

表2-3　試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

圖6　BSGN6的ARTP致死曲線

2.3高氮源轉(zhuǎn)化率突變株的篩選

為了篩選獲得氮源轉(zhuǎn)化效率提高的突變菌株，我們設(shè)計了誘變篩選培養(yǎng)基 ②。在該培養(yǎng)基中，碳源(葡萄糖)含量過剩，以保證氮源全部被消耗完。同時根據(jù)材料與方法1.4所述，經(jīng)過多輪誘變處理，初篩共篩選出24株較對照菌提高的正向突變菌株。

隨后我們對這24株菌進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證，搖瓶驗(yàn)證也使用是誘變篩選培養(yǎng)基 ②。搖瓶發(fā)酵48 h后，將發(fā)酵液離心取上清液通過高效液相色譜法檢測GlcNAc含量。如圖7所示，突變菌(5H7)在相同的條件下GlcNAc產(chǎn)量最高達(dá)到了4.75 g/L，較對照菌株BSGN6(3.25 g/L)相比提高了46.15%。

圖7　菌株BSGN6與突變菌株搖瓶發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量對比

2.4高葡萄糖轉(zhuǎn)化率突變株的篩選

我們將之前獲得氮源轉(zhuǎn)化效率最高突變菌(5H7)進(jìn)一步誘變，以期獲得葡萄糖轉(zhuǎn)化效率高的突變菌。在這里我們采用誘變篩選培養(yǎng)基①，該培養(yǎng)基中氮源含量豐富，以保證碳源(葡萄糖)消耗完全。采用與之前相同的誘變條件，經(jīng)過多輪誘變，初篩最終獲得18株正向突變菌株。

搖瓶驗(yàn)證結(jié)果如圖8所示，其中突變菌(4A12)的GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到9.12 g/L,較出發(fā)菌株(5H7)7.6 g/L相比提高了20%，突變菌(4A12)的葡萄糖轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.169 g GlcNAc/g Glucose。

2.53L罐發(fā)酵考察突變菌(4A12)發(fā)酵特性

我們以出發(fā)菌株BSGN6作為對照菌，在相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h考察突變株4A12在3 L罐發(fā)酵中的培養(yǎng)特性。從圖中可知，突變菌(4A12)最高產(chǎn)量達(dá)到36.14 g/L，較出發(fā)菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。整個發(fā)酵過程來看，突變菌的生物量都要低于發(fā)菌株，突變菌株最大菌體量為21.56 g/L,僅為出發(fā)菌株(25.62 g/L)的84.2%。

圖8　菌株5H7與突變株搖瓶發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量對比

注：菌株BSGN6與突變株4A12在3 L罐中GlcNAc發(fā)酵結(jié)果

注：菌株BSGN6與突變株4A12在3 L罐中菌體生長情況

2.6突變菌遺傳穩(wěn)定性研究

為了考察突變菌4A12的遺傳穩(wěn)定性，我們先將突變菌在固體培養(yǎng)基平板活化，然后轉(zhuǎn)接至液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。同時繼續(xù)傳代，整個過程一共傳代培養(yǎng)50次。突變菌生產(chǎn)GlcNAc能力的穩(wěn)定性結(jié)果如圖10所示。

從圖中可以看出突變菌4A12具有良好的遺傳穩(wěn)定性，搖瓶發(fā)酵GlcNAc的產(chǎn)量維持在9 g/L左右。

3結(jié)論

本研究首次將ARTP誘變技術(shù)應(yīng)用于高通量篩選產(chǎn)GlcNAc突變菌，同時并建立并優(yōu)化了高通量比色法檢測GlcNAc篩選方法，研究表明當(dāng)添加四硼酸鉀溶液添1 μL、PDABA 125 μL、反應(yīng)時間5 min、反應(yīng)溫度96 ℃時，N-乙酰氨基葡萄糖檢測的準(zhǔn)確度最高。

圖10　突變菌株4A12遺傳穩(wěn)定性

同時本研究通過建立的篩選方法利用不同的篩選培養(yǎng)基成功篩選獲得一株GlcNAc產(chǎn)量高、氮源轉(zhuǎn)化效率高、葡萄糖轉(zhuǎn)化效率高的突變株(4A12)，搖瓶發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到9.12 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.169 g GlcNAc/g Glucose。3 L罐發(fā)酵GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到36.14 g/L，較出發(fā)菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。之后我們也考察了突變株遺傳穩(wěn)定性，通過傳代實(shí)驗(yàn)，GlcNAc搖瓶產(chǎn)量維持在9 g/L左右，表明經(jīng)ARTP誘變獲得這株突變菌(4A12)遺傳穩(wěn)定性較好。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.003

基金項(xiàng)目：“江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金-前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目”(項(xiàng)目編號：BY2012054)。

作者簡介：池亞斌(1990～)，男，碩士生。E-mail：1041507916@qq.com。 *通訊作者: 劉龍教授。Tel：0510-85918312，E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn。

High-throughput screening of Bacillus subtilis for N-acetylglucosamine production by ARTP mutation technology

CHI Ya-bin1, GU Yang1, LIU Long1,2, LI Jiang-hua1, DU Guo-cheng1, 2, CHEN Jian1, 2

1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. Key Laboratory of Carbohydrate and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

AbstractA novel atmospheric and room temperature plasma (ARTP) mutagenesis system was used by combining with the high throughput screening of 96-well microplates and chromogenic reaction to obtain high-yielding mutants. The optimum conditions for chromogenic reaction were as follows: otassium tetraborate solution 1 μL, PDABA 125 μL, reaction time 5 min, temperature 96 ℃. Through several rounds of ARTP mutation and high-throughput screening, a mutant (4A12) was obtained. In 3 L fermentor, the maximum GlcNAc production reached 36.14 g/L, which improved 65.32% compared with that of the control strain BSGN6. The results of subculture test showed that the mutant strain had stable hereditary characteristics after 50 generations. ARTP mutagenesis technique as an effective way to obtain high-yielding GlcNAc strains was better than molecular biology methods.

Key wordsARTP; GlcNAc; high-throughput screening