蕓薹屬栽培種ALS1-3的克隆及序列分析

孫妍妍，曲高平，胡勝武

(西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

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蕓薹屬栽培種ALS1-3的克隆及序列分析

孫妍妍，曲高平，胡勝武

(西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 揭示6種蕓薹屬植物乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的結構特征，為ALS酶的遺傳操作和抗除草劑種質創(chuàng)制奠定基礎。【方法】 利用特異PCR方法，對甘藍型油菜(Brassica napus L.)、甘藍(B.oleracea)、芥菜型油菜(B.juncea)、白菜型油菜(B.rapa)、埃塞俄比亞芥(B.carinata)、黑芥(B.nigra)等6個蕓薹屬16份材料的ALS基因進行擴增、克隆測序及生物信息學分析。【結果】 除1個B.nigra材料未擴增出任何產物外，其余參試材料中均有PCR擴增產物，共成功克隆了30個ALS基因(GenBank登錄號為KM816807～KM816836)，且克隆的基因ALS1、ALS2、ALS3均不含內含子，只有一個開放閱讀框。ALS1基因開放閱讀框長為1 968 bp，編碼655個氨基酸；ALS2基因開放閱讀框長為1 914 bp，編碼637個氨基酸；ALS3基因開放閱讀框長為1 959 bp，編碼652個氨基酸。參試材料中，在ALS1基因中檢測到7個SNP，其中4個導致氨基酸突變；在ALS2基因中檢測到3個SNP，其中2個導致氨基酸突變；在ALS3基因中檢測到25個SNP，其中2個導致氨基酸突變。在3類ALS蛋白中，ALS1和ALS3遺傳距離較近，與ALS2的遺傳距離相對較遠。ALS1基因定位于C01染色體上，ALS2和ALS3基因定位于A01染色體上?！窘Y論】 參試的6個蕓薹屬不同材料間ALS1、ALS2、ALS3基因序列及其編碼的蛋白序列均存在差異。

[關鍵詞]蕓薹屬植物；乙酰乳酸合成酶基因；基因克?。簧镄畔W；基因序列分析

油菜是我國乃至全世界的主要油料作物，隨著我國國民經濟的快速發(fā)展，農村青壯年勞動力向城市大量轉移，輕簡化、機械化已成為油菜產業(yè)發(fā)展的主要方向。雜草的綜合有效治理是實現(xiàn)油菜機械化、輕簡化的重要技術環(huán)節(jié)[1]，選育和推廣抗除草劑油菜品種是克服油菜田間草害最為經濟有效的措施。目前，抗除草劑油菜主要分為兩大類：轉基因抗除草劑油菜(主要抗性基因有抗草胺膦的bar和抗草甘膦的aroA)和非轉基因抗除草劑油菜。Swanson等[2]和Hattori等[3]采用小孢子化學誘變的方法獲得2個抗咪唑啉酮類除草劑的油菜突變體PM1和PM2。PM1和PM2均由ALS基因點突變所致，其中PM1是BnALS1基因上的第653位絲氨酸(Ser)突變?yōu)樘於０?Asn)，PM2是基因BnALS3的第574位色氨酸(Trp)突變?yōu)榱涟彼?Leu)(對應擬南芥序列)。2004年江蘇省農業(yè)科學院在油菜和大豆輪作噴施咪唑啉酮類除草劑的試驗田中，發(fā)現(xiàn)了自然突變的除草劑抗性油菜新種質M9，該突變體抗性穩(wěn)定、抗性效應明顯[4-5]。胡茂龍等[6]研究表明，M9抗性由1個顯性核基因控制，其BnALS1的抗性突變位點是Ser-653-Asn(對應擬南芥序列)。目前，國外生產上大面積使用轉基因抗除草劑油菜品種，而非轉基因油菜主要是由PM1和PM2選育得到的抗咪唑啉酮類油菜。

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase，ALS)抑制劑類除草劑是發(fā)展最快、品種最多、市場最大的一類選擇性除草劑，該類除草劑由于生物活性高、殺草譜廣、對人和動物十分安全而應用于多種作物[7-9]。乙酰乳酸合成酶(ALS)是控制植物體內合成支鏈氨基酸(包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)公共途徑的關鍵酶，該酶由催化亞基和調控亞基組成[10-16]，它同時催化2個平行反應，催化2分子丙酮酸縮合形成2-乙酰乳酸并釋放出CO2，最終生成纈氨酸和亮氨酸；催化1分子丙酮酸和1分子2-氧丁酸縮合形成乙酰羥基丁酸，最終生成異亮氨酸[17]。細菌、真菌、藻類和植物中均含有ALS，植物ALS由核基因編碼，定位于葉綠體[18]。ALS是磺酰脲類、咪唑啉酮類等5類高選擇性、低毒化學除草劑的作用靶標[19-21]，因此ALS基因是抗除草劑遺傳操作的一個重要候選基因，具有重要的研究價值。

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)基因組內存在5個ALS基因拷貝(ALS1-ALS5)，蕓薹屬植物中ALS基因以多基因家族的形式存在，其多樣性超過煙草和擬南芥中的ALS基因[22]。ALS1和ALS3享有廣泛的同源性，它們可能是編碼植物生長和發(fā)育所必需的ALS酶。ALS2與ALS1和ALS3在DNA序列上差異較大，在成熟蛋白編碼區(qū)、N端葉綠體轉運肽的編碼區(qū)及基因上游非編碼區(qū)具有獨特的特征，并且只在成熟的胚珠和不成熟的種子胚胎中表達，表明ALS2酶可能在種子的發(fā)育中起特殊作用。ALS4和ALS5的編碼區(qū)被打斷，可能是缺失功能ALS基因。分析B.napus的二倍體祖先B.rapa和B.oleracea表明，ALS2、ALS3和ALS4起源于B.rapa，而ALS1和ALS5起源于B.oleracea[22]。

本研究擬對6個不同蕓薹屬植物的ALS基因進行克隆測序及生物信息學分析，以明確這6個主要蕓薹屬植物ALS基因的特征特性，為ALS酶的遺傳操作和抗除草劑種質創(chuàng)制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料包括4個Brassicanapus材料：中雙9號、SH11、秦油3號、新型甘藍型油菜；2個B.oleracea材料：特選中甘11、晚豐；3個B.juncea材料：渭源大黃芥、關中芥菜、黔西牛尾油菜；4個B.rapa材料：金秋66、彬縣義門油菜、Opava、Rapido；2個B.carinata材料：Dodalla、09H2901003；1個B.nigra材料：Sizaja。上述材料均由西北農林科技大學油菜研究中心提供，2013年9月播種于陜西楊凌西北農林科技大學農學院標本區(qū)，10月28日取嫩葉，用于基因組DNA的提取。

ExTap酶、dNTP Mixture、10×ExTapBuffer及pMD 19-T Vector由大連寶生物TaKaRa公司生產；6×DNA Loading Buffer和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞均由天根生化科技(北京)有限公司生產；引物合成和測序均由上海立菲生物技術有限公司完成。

1.2ALS基因的克隆

葉片全基因組DNA采用CTAB法提取。利用胡茂龍等[6]設計的3對引物：BnALS1-F1/BnALS1-R1、BnALS2-F1/BnALS2-R1、BnALS3-F1/BnALS3-R1分別擴增ALS1、ALS2和ALS3基因序列。PCR反應體系：模板DNA 2 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.15 μL，10×ExTaqBuffer 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL，ddH2O補足20 μL。PCR循環(huán)參數：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2.5 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后切下目的條帶，用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化(具體步驟參照試劑盒說明書)?；厥债a物經pMD 19-T Vector連接、DH5α大腸桿菌感受態(tài)轉化、藍白斑篩選、菌落PCR鑒定后，每個材料每個基因分別隨機選取 3～5 個陽性克隆送至上海立菲生物技術有限公司測序。將克隆成功的30條核酸序列提交至GenBank數據庫中，并獲得登錄號。

1.3生物信息學分析

利用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行核酸和蛋白質的Blast分析，利用Clustal X 2.0.12軟件進行核酸和蛋白質的序列比對，利用MEGA 5.1軟件，采用極大似然法(Maximum-likelihood，ML)構建ALS蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用在線軟件http://brassicadb.org/brad/對ALS基因進行定位。

2結果與分析

2.1ALS基因的克隆

試驗結果顯示，除在1個B.nigra材料中未擴增出任何產物外，其他參試材料中均有PCR擴增產物(圖1～3)。

圖 1　ALS1基因擴增結果 M. Marker Ⅲ；1.中雙9號；2.SH11；3.秦油3號；4.新型甘藍型油菜；5.特選中甘11；6.晚豐；7.Dodalla；8.09H2901003Fig.1　PCR amplification of ALS1 M. Marker Ⅲ；1.Zhongshuang No.9；2.SH11；3.Qinyou No.3；4.New type Brassica napus； 5.Texuanzhonggan No.11；6.Wanfeng；7.Dodalla；8.09H2901003

圖 2　ALS2基因擴增結果 M.Marker Ⅲ；1.中雙9號；2.SH11；3.秦油3號；4.新型甘藍型油菜；5.渭源大黃芥； 6.關中芥菜；7.黔西牛尾油菜；8.金秋66；9.彬縣義門油菜；10.Opava；11.RapidoFig.2　PCR amplification of ALS2 M.Marker Ⅲ;1.Zhongshuang No.9;2.SH11;3.Qinyou No.3;4.New type Brassica napus;5.Weiyuandahuangjie; 6.Guanzhongjiecai;7.Qianxiniuweiyoucai;8.Jinqiu 66;9.Binxianyimenyoucai;10.Opava;11.Rapido

圖 3　ALS3基因擴增結果 M.Marker Ⅲ；1.中雙9號；2.SH11；3.秦油3號；4.新型甘藍型油菜；5.渭源大黃芥；6.關中芥菜； 7.黔西牛尾油菜；8.金秋66；9.彬縣義門油菜；10.Opava；11.RapidoFig.3　PCR amplification of ALS3 M.Marker Ⅲ;1.Zhongshuang No.9;2.SH11;3.Qinyou No.3;4.New type Brassica napus;5.Weiyuandahuangjie; 6.Guanzhongjiecai;7.Qianxiniuweiyoucai;8.Jinqiu 66;9.Binxianyimenyoucai;10.Opava;11.Rapido

在參試的B.napus、B.oleracea、B.carinata中擴增得到ALS1基因(圖1)，在B.napus、B.rapa、B.juncea中擴增得到ALS2(圖2)和ALS3基因(圖3)。對擴增目的片段進行回收、克隆、測序，共成功克隆了30個ALS基因，并在GenBank數據庫中登錄，獲得登錄號KM816807-KM816836(表1)。經過NCBI的Blast分析，結果顯示所克隆基因分別與NCBI上已公開的B.napusALS1(Z11524)、ALS2(Z11525)、ALS3(Z11526)基因的一致率達到99%，證明克隆所得基因與預期結果相符。

表 1　參試材料及成功克隆的ALS基因Table 1　Plant materials and cloned ALS genes

2.2ALS基因的序列分析

利用NCBI網站的ORF Finder軟件對2.1節(jié)克隆得到的基因序列進行分析，結果表明：5種蕓薹屬植物中所克隆的ALS基因均不含內含子，只有1個開放閱讀框。ALS1基因開放閱讀框長為1 968 bp，編碼655個氨基酸；ALS2基因開放閱讀框長為1 914 bp，編碼637個氨基酸；ALS3基因開放閱讀框長為1 959 bp，編碼652個氨基酸。利用Clustal X 2.0.12軟件分析表明，5個蕓薹屬不同種材料的ALS基因核酸序列存在差異(表2～4)，導致由其編碼的氨基酸也存在差異。對8個材料ALS1基因的比對分析發(fā)現(xiàn)了7個SNP，其中4個SNP可導致氨基酸突變，B.napus材料SH11的ALS1基因與其他B.napus材料間存在3個SNP，但只有1個SNP導致氨基酸突變。對11個材料ALS2基因的比對分析發(fā)現(xiàn)了3個SNP，其中2個SNP導致氨基酸突變。對11個材料ALS3基因的比對分析發(fā)現(xiàn)了25個SNP，但僅有2個SNP導致氨基酸突變。從SNP數量來看，在自然條件下ALS3發(fā)生同義突變的概率最大，而發(fā)生錯義突變的概率最??；ALS2序列相對保守，發(fā)生同義突變的概率最小，但最易發(fā)生錯義突變。

表 2　ALS1核酸和蛋白質序列變異Table 2　Mutations of ALS1 DNA and protein sequences

注：Z11524是NCBI上已公開的ALS1序列；黑體表示突變位點；目標基因位置中括弧外為編碼核苷酸，括弧內為引起突變的氨基酸；*表示此位點發(fā)生錯義突變。下表同。

Note:Z11524 is the sequence ofALS1 published in NCBI;Mutations are showed in bold;outside brackets are the coding nucleotides,in brackets are the mutation amino acid.*means missense mutation at this site.The same below tables.

表 3　ALS2核酸和蛋白質序列變異Table 3　Mutations of ALS2 DNA and protein sequences

注：Z11525是NCBI上已公開的ALS2序列。

Note:Z11525 is the sequence ofALS2 published in NCBI.

表 4　ALS3核酸和蛋白質序列變異Table 4　Mutations of ALS3 DNA and protein sequences

注：Z11526是NCBI上已公開的ALS3序列。

Note:Z11526 is the sequence ofALS3 published in NCBI.

2.3ALS蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建

利用MEGA 5.1軟件，采用極大似然法(Maximum-likelihood，ML)對2.1節(jié)成功克隆的30個ALS基因編碼的蛋白質序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果見圖4。圖4表明，ALS1、ALS2、ALS3獨自聚為一類，然后ALS1和ALS3聚在一起，最后與ALS2聚在一起，說明ALS1和ALS3遺傳距離較近，與ALS2的遺傳距離相對較遠。8個材料共編碼了4種不同ALS1蛋白(SH11、晚豐、Dodalla和09H2901003、其他4個材料)。11個材料編碼了2種ALS3蛋白，其中渭源大黃芥、關中芥菜、金秋66編碼的ALS3與基因庫中Z11526編碼的相同；其他8個材料編碼的ALS3相同。11個材料共編碼了2種ALS2蛋白，Opava編碼了1種ALS2，其他10個材料編碼的ALS2相同。

2.4ALS基因的定位預測

利用網站http://brassicadb.org/brad/對B.oleracea和B.rapa材料的ALS基因進行染色體定位，結果表明(1)B.oleracea材料ALS1基因編碼區(qū)序列(第1-1 968堿基)定位于C01染色體上(第17 124 680-17 122 713堿基)；(2)B.rapa材料ALS2基因編碼區(qū)(第199-1 217堿基)定位于A01染色體上(第14 732 437-14 731 422堿基)；(3)B.rapa材料ALS3基因編碼區(qū)(第1-1 959堿基)也定位于A01染色體上(第14 183 751-14 181 793 堿基)。ALS基因編碼區(qū)序列與定位在該染色體區(qū)間內的堿基序列一致率高達99%，說明定位結果真實可靠。

圖 4　5種蕓薹屬植物ALS1、ALS2、ALS3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹 每個分支上的數值為自展檢驗值(1 000次重復)Fig.4　Phylogenic analysis of ALS1,ALS2,and ALS3 proteins from five Brassica species The number for each interior branch is the bootstraps value (1 000 replicates)

3結論與討論

在以輕簡化、機械化為油菜產業(yè)發(fā)展主要方向的大環(huán)境下，抗除草劑油菜品種的選育和推廣工作勢在必行，而乙酰乳酸合成酶(ALS)基因作為抗除草劑遺傳操作的一個重要候選基因得到了人們的日益重視。本研究對6個不同蕓薹屬16個植物材料ALS基因進行PCR擴增，其中15個材料的ALS基因克隆成功，僅1個B.nigra材料未擴增成功，其原因可能是ALS1基因定位于C基因組中，ALS2和ALS3基因定位于A基因組中，而B.nigra材料只包含B基因組。本研究所用的ALS1、ALS2、ALS3基因特異引物在B.nigra中均無PCR擴增產物，因此B.nigra的ALS基因有待進一步研究。

對15個不同材料ALS1、ALS2、ALS3基因的分析發(fā)現(xiàn)，ALS1和ALS3同源性較高(達到95%以上)，這2個基因中的突變位點較多，其中一部分形成錯義突變；而ALS2與ALS1和ALS3同源性較低，在DNA序列上差異較大，相對保守，極少出現(xiàn)核苷酸的突變。Rutledge等[22]認為，ALS1和ALS3可能是編碼植物生長和發(fā)育所必需的ALS酶，而ALS2在成熟蛋白編碼區(qū)、N端葉綠體轉運肽的編碼區(qū)及基因上游非編碼區(qū)具有獨特的特征，可能具有不同于ALS1和ALS3的功能。本研究結果與Rutledge等[22]的上述觀點相符合。經過對15種材料ALS蛋白的比對分析，未發(fā)現(xiàn)以往報道的對抗除草劑有貢獻的SNP位點。以往報道的對除草劑抗性有貢獻的位點主要為Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Trp574和Ser653[23-24](以擬南芥序列為參照)。本研究所發(fā)現(xiàn)的ALS突變位點是否對除草劑有貢獻，尚有待于進一步研究。

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DOI：網絡出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.015

[收稿日期]2014-12-05

[基金項目]現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-13)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2010BAD01B02)

[作者簡介]孫妍妍(1988-)，女，吉林長春人，在讀碩士，主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail:15929800833@163.com [通信作者]胡勝武(1966-)，男，陜西柞水人，教授，博士生導師，主要從事油菜遺傳育種研究。 E-mail:swhu83251@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類號]S503.53

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0101-08

Cloning and sequence analysis ofALS1-3 genes from cultivatedBrassicaspecies

SUN Yanyan,QU Gaoping,HU Shengwu

(CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study revealed the acetolactate synthetase (ALS) genes from six Brassica species to lay foundation for genetic manipulation of ALS and creation of herbicide resistant materials.【Method】 Specific PCR method was used to isolate ALS genes from 16 accessions of six Brassica species,including Brassica napus L.,B.oleracea,B.juncea,B.rapa,B.carinata,and B.nigra.Bioinformatics and the isolated ALS genes and their encoding products were also analyzed. 【Result】 Except for one B.nigra accession,ALS genes from other 15 accessions were successfully amplified.In total,30 ALS genes were cloned and their GenBank numbers (from KM816807 to KM816836) were obtained.ALS1,ALS2 and ALS3 had no introns and only one open reading frame (ORF).ORF of ALS1 was 1 968 bp in length,encoding a peptide of 655 amino acids.ORF of ALS2 was 1 914 bp in length,encoding a peptide of 637 amino acids.ORF of ALS3 was 1 959 bp in length,encoding a peptide of 652 amino acids.Seven single nucleotide polymorphisms (SNP) were detected among ALS1,and four of them resulted in amino acid change.Three SNPs were detected among ALS2,and two of them resulted in amino acid change.Twenty-five SNPs were detected among ALS3,and two of them resulted in amino acid change.Genetic distance between ALS1 and ALS3 was relatively closer than that with ALS2.ALS1 was located in C01 chromosome,while ALS2 and ALS3 were located in A01 chromosome.【Conclusion】 Nucleic acid differences in ALS1,ALS2,and ALS3 were detected among six Brassica species,resulting in changes of several amino acids of the encoded proteins.

Key words:Brassica species;acetolactate synthetase (ALS) gene;gene cloning;bioinformatics;sequence analysis

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.030.html