5，7-二甲氧基黃酮下調(diào)FoxMl基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

曾德余，殷先利，李蓉蓉，楊劍鋒

（1.湖南省腫瘤醫(yī)院消化泌尿內(nèi)科，長(zhǎng)沙　410003；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，長(zhǎng)沙　410005）

5，7-二甲氧基黃酮下調(diào)FoxMl基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

曾德余1，殷先利1，李蓉蓉1，楊劍鋒2

（1.湖南省腫瘤醫(yī)院消化泌尿內(nèi)科，長(zhǎng)沙410003；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，長(zhǎng)沙410005）

【摘要】目的：探討5，7二甲氧基黃酮（5，7-DMF）對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及分子機(jī)制。方法：用不同濃度DMF處理人胰腺癌Panc-1細(xì)胞，利用劃痕法檢測(cè)5，7-DMF干預(yù)后Panc-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化；用Westernblot檢測(cè)5，7-DMF干預(yù)后FoxM1蛋白表達(dá)情況；FoxM1siRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌Panc-1細(xì)胞后，用Western blot進(jìn)而檢測(cè)EMT相關(guān)上皮標(biāo)志分子E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果：5，7-DMF以濃度依賴方式顯著抑制Panc-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。5，7-DMF干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后顯著下調(diào)FoxM1表達(dá)水平；FoxM1siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，EMT相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)升高，而N-cadherin表達(dá)降低，且與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：5，7二甲氧基黃酮可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能通過下調(diào)FoxM1水平是其重要機(jī)制之一，但其內(nèi)在的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

胰腺癌（PC）起病隱匿，一旦確診多處于中晚期，能手術(shù)根治性切除者較少。加之，胰腺癌細(xì)胞易對(duì)放、化療抵抗。故研究胰腺癌細(xì)胞治療有效藥物對(duì)于改善胰腺癌臨床治療至關(guān)重要。5，7-二甲氧基黃酮（5，7-Dimethoxyflavone，5，7-DMF）是一種從小花山奈和卡瓦胡椒及其他植物中提取分離的天然黃酮類化合物［1，2］。前期工作中，我們研究發(fā)現(xiàn)DMF具有抗腫瘤的潛力以及它對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)［3，4，5］，有望成為一種有效的抗癌抑制劑。目前，5，7-DMF在胰腺癌細(xì)胞研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者用不同濃度5，7-DMF干預(yù)人胰腺癌Panc-1系，觀察其是否可抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，即上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化變化，并探討了其可能的機(jī)制。

1　資料與方法

1.1材料5，7-二甲氧基黃酮由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院曹建國(guó)教授惠贈(zèng)；人胰腺癌細(xì)胞PANC-1購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院；DMEM、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；鼠抗人FoxM1、E-cad、N-cad單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruzBiotechnology公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化酶藕聯(lián)山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz Biotechnology公司；FoxM1siRNA購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)胰腺癌Panc-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2FoxM1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響FoxM1-siRNA，其序列如下：正義鏈序列：5-GGA GGAAAUGCCACACUUAdTdT-3、反義鏈序列：3-dTdT CCUCCUUUACGGUGUGAAU-5。轉(zhuǎn)染前1天，將濃度為1.0×105/mL的胰腺癌Panc-1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)染。分PC-1、NC、Si-FOXM1三組，6.25 nMol/LFoxMlsiRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，用RPMI1640代替FoxM1-siRNA作為空白對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)7d，10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)。

1.2.3劃痕法檢測(cè)DMF干預(yù)后Panc-1細(xì)胞遷移不同濃度DMF（1.0、2.0和4.0μmol/L）和0.1%DMSO處理人胰腺癌PANC-1細(xì)胞24h；然后用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基以每孔4×105的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞生長(zhǎng)85%融合，然后用tip頭在中央?yún)^(qū)域劃痕制造傷口。PBS沖洗2次，去除漂浮的細(xì)胞和碎片。細(xì)胞孵育24小時(shí)，計(jì)數(shù)在劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)。以0.1%DMSO處理人胰腺癌PANC-1細(xì)胞24h遷移細(xì)胞數(shù)為對(duì)照即100%，計(jì)算相對(duì)遷移細(xì)胞百分率（%）。

1.2.4WesternBlot檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡分析FoxM1 siRNA序列轉(zhuǎn)染后E-cad、N-cad蛋白表達(dá)及DMF干預(yù)前后FoxM1、E-cad、N-cad蛋白表達(dá)。按照文獻(xiàn)［6］描述的方法完成?？笷oxM1、抗E-cad、抗N-cad、和β-actin的兔多克隆抗體作為一抗。用增強(qiáng)型ECL蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)進(jìn)行目的條帶信號(hào)的檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，錄入Spss15.0forwindowsevaluation軟件，行One WayANOVA方差分析；方差齊性檢驗(yàn)后，在方差齊性時(shí)，均數(shù)間比較采用LSD法，在方差不齊時(shí)，均數(shù)間比較采用Studentt檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并用Sigmaplot10.0作圖。

2　結(jié)果

2.1FOXM1siRNA干擾對(duì)胰腺癌PACN-1細(xì)胞增殖作用分PC-1、NC、SiRNA-FOXM1三組，連續(xù)觀察7天，第1～4d各組細(xì)胞增值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第5d Si-FOXM1組細(xì)胞增值受到抑制，與PC-1、NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第6～7d細(xì)胞抑制更明顯（P＜0.01）。而PC-1組和NC組細(xì)胞增值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1　FOXM1　siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖影響

2.2FOXM1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞E-cad、N-cad蛋白表達(dá)影響分別以3.15、6.25、12.5nmol/LFOXM1 siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞72h后。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，各轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞E-cad表達(dá)水平升高、N-cad蛋白表達(dá)水平下降，且與FOXM1siRNA濃度有關(guān)。1為對(duì)照組，2，3，4分別為3.15，6.25，12.5nmol/LsiRNA組（圖2）。

圖2　FOXM1　siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞E-cad、N-cad蛋白表達(dá)影響

2.3DMF抑制胰腺癌細(xì)胞FoxM1蛋白表達(dá)以1.0、2.0和4.0μmol/L不同濃度DMF干預(yù)處理Panc-1細(xì)胞24h，Westernblot分析各組FoxM1表達(dá)情況，人胰腺癌PANC-1細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)水平降低（圖3），說明：5，7-DMF能有效抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)錄因子FoxM1蛋白表達(dá)。

圖3　不同濃度DMF抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)

2.45，7-DMF抑制胰腺癌細(xì)胞遷移以1.0、2.0和4.0μmol/L不同濃度5，7-DMF干預(yù)Panc-1細(xì)胞，劃痕法檢測(cè)DMF干預(yù)后Panc-1細(xì)胞遷移率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5，7-DMF可抑制Panc-1細(xì)胞遷移，且隨濃度增加抑制效果更明顯（圖4）。

圖4　DMF對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞體外遷移能力的影響（100×）與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與1.0　μmol/L5，7-DMF組比較，#P＜0.05

2.5DMF干預(yù)對(duì)胰腺癌細(xì)胞E-cad、N-cad蛋白表達(dá)影響Westernblot分析不同濃度5，7-DMF（1.0、2.0和4.0μmol/L）和0.1%DMSO處理人胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明：5，7-DMF（1.0、2.0和4.0μmol/L）處理24h，人胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cad蛋白表達(dá)水平降低，E-cad蛋白表達(dá)水平升高（圖5），說明：5，7-DMF能有效逆轉(zhuǎn)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型。

圖5　5，7-DMF干預(yù)對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cad、N-cad蛋白表達(dá)影響與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與1.0　μmol/L5，7-DMF組比較，#P＜0.05

3　討論

胰腺癌起病隱匿，一旦確診多處于中晚期，能手術(shù)根治性切除者較少，胰腺癌患者平均生存時(shí)間為6個(gè)月，5年生存率低于5%［7，8］。早期診斷難、臨床標(biāo)志物缺乏、晚期治療手段抵抗等因素是胰腺癌預(yù)后差的主要原因，尋找有效治療新藥物是目前胰腺癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)oxMl）是Fox蛋白家族的成員，是典型的增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。該家族包括50多個(gè)成員，均具有一段保守的“翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”［9］。眾所周知，F(xiàn)OXM1是一種關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1到S及G2到有絲分裂轉(zhuǎn)變的過程［10］。越來越多的研究表明FOXM1在大多數(shù)惡性腫瘤，如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等過表達(dá)，并在腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-14］。

EMT是指細(xì)胞失去上皮特性逐漸向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，在此過程中，細(xì)胞極性消失，連接松散，更易于經(jīng)血流轉(zhuǎn)移，在分子學(xué)上表現(xiàn)為上皮標(biāo)志蛋白E-鈣黏蛋白等表達(dá)下調(diào)或缺失，而N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)升高［15］?，F(xiàn)今的研究認(rèn)為EMT是惡性或者良性腫瘤惡性程度增加的一個(gè)過渡形態(tài)，發(fā)生EMT的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物耐藥性、更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲能力，還有研究顯示發(fā)生EMT的癌細(xì)胞有腫瘤干細(xì)胞樣特性［16］；上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin是腫瘤細(xì)胞EMT過程中最重要的標(biāo)志蛋白，它是一種廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞并介導(dǎo)細(xì)胞間連接的鈣依賴性跨膜蛋白，它的表達(dá)缺失伴隨著上皮細(xì)胞表型的喪失，使細(xì)胞粘附能力下降，易于脫落發(fā)生轉(zhuǎn)移，而間質(zhì)標(biāo)志N-cadherin表達(dá)升高使得細(xì)胞易于發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)用FoxMl siRNA干擾PANC-1細(xì)胞FoxMl表達(dá)，PANC-1細(xì)胞增殖受抑制，進(jìn)一步檢測(cè)N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)N-cadherin表達(dá)下降、E-cadherin蛋白表達(dá)升高，說明FoxMl在人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮了重要作用。

FoxMl在胰腺癌過表達(dá)，在侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。以不同濃度5，7-DMF處理PANC-1細(xì)胞，westernBlot檢測(cè)FoxMl表達(dá)水平，跟對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組顯著下降，且隨5，7-DMF濃度增加FoxMl表達(dá)水平下降程度更大，組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)說明5，7-DMF可抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，即有效逆轉(zhuǎn)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能與5，7-DMF靶向抑制FoxMl表達(dá)相關(guān)。

5，7-二甲氧基黃酮（5，7-dimethoxyflavone，5，7-DMF）系山柰屬等多種植物中存在一種多甲氧基黃酮類化合物［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)5，7-DMF對(duì)多種人類惡性腫瘤具有抑制增殖和生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［3，4，5］。然而，5，7-DMF是否具有抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度5，7-DMF干預(yù)胰腺癌PANC-1細(xì)胞，通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5，7-DMF干預(yù)后PANC-1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。Westernblot分析不同濃度5，7-DMF（1.0、2.0和4.0μmol/L）和0.1%DMSO處理人胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平。人胰腺癌PANC-1細(xì)胞間質(zhì)性標(biāo)記N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，上皮性標(biāo)記E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，且隨濃度增加作用效果更明顯，說明5，7-DMF能有效逆轉(zhuǎn)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型。本實(shí)驗(yàn)也首次證實(shí)5，7-DMF可抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，體現(xiàn)了良好的藥效學(xué)特性。

5，7-DMF以濃度依賴方式顯著抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞系胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能與5，7-DMF靶向抑制FoxMl表達(dá)相關(guān)，其涉及多種分子機(jī)制需進(jìn)一步研究，還需要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

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【中圖分類號(hào)】R575.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-016X（2016）03-0007-04

收稿日期：2016-01-10

基金項(xiàng)目：湖南省科技廳基金（2013FJ3013）

通訊作者：楊劍鋒，Email：yjfbl@sohu.com

Effect of FoxMl down-regulation by 5,7-Dimethoxyflavone on epithelial-mesenchymal transitions of pancreatic cancer cell line PANC- 1

Zeng De-yu1, Yin Xian-li1, Li Rong-rong1, Yang Jian-feng2
（1. Department of Medical Oncology ,Hunan tumor hospital； 2. Department of Pathology, Medical College , Hunan Normal University, Changsha 410006, China）

［Abstract］Objective To investigate the effect of 5,7-Dimethoxyflavone（5,7-DMF） on epithelial-mesenchymal transitions（EMT） of pancreatic cancer cell line PANC-1. Methods Different concentrations of 5,7-DMF treated human pancreatic cancer Panc-1 cells. Wound scratch assay were employed to evaluate the cell invasion and metastasis after treatment of5,7-DMF. Western blotting was used to detect changes in the expressions of FoxM1 in the cells. After FoxM1siRNA transfection of human pancreatic cancer Panc-1 cells, Western blotting was used to observe changes in the expressions of E-cadherin, and N-cadherin in the cells. Results 5,7-DMF significantly suppressed the invasion and metastasis of Panc-1 cells in a concentration dependent manner. 5,7-DMF significantly reduced the expression of FoxM1 in pancreatic cancer cells after intervention. FoxM1 SiRNA transfection of pancreatic cancer cells.5,7-DMF could down-regulate the FoxMl expression in a dose-dependent manner.FoxM1 SiRNA significantly increased E-cadherin expressions, lowered N-cadherin expressions, and And compared with the control group were statistically significant. Conclusion 5,7-DMF can reverse the epithelial mesenchymal transition of pancreatic cancer cells. It is the one of the important mechanisms through down-regulate FoxM1 levels，but the molecular mechanism need to be explored further.

［Key words］pancreaticcarcer；forkhead box protein M1；epithelial mesenchymal transition