腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞對(duì)鼻咽癌進(jìn)展和預(yù)后的影響

蔡曼波，曾益新，邵建永，左建宏，3

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，衡陽(yáng)421001；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣州　510060；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，衡陽(yáng)　421001）

腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞對(duì)鼻咽癌進(jìn)展和預(yù)后的影響

蔡曼波1，曾益新2，邵建永2，左建宏1，3

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，衡陽(yáng)421001；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣州510060；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，衡陽(yáng)421001）

【摘要】目的：研究免疫微環(huán)境中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞對(duì)鼻咽癌（Nasopharyngealcarcinoma，NPC）進(jìn)展和預(yù)后的影響。方法：收集2001年1月～2003年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心經(jīng)病理證實(shí)為鼻咽癌的石蠟標(biāo)本557例。所有患者均為初次診斷且未進(jìn)行任何治療，隨訪時(shí)間均超過5年。采用免疫組化雙染色法檢測(cè)Treg細(xì)胞分子標(biāo)志物CD4和Foxp3、Th17細(xì)胞分子標(biāo)志物CD4和IL-17，觀察并計(jì)數(shù)，CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞、CD4+IL-17+Th17細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達(dá)數(shù)目，統(tǒng)計(jì)分析其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與臨床病理特征及與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要在腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)（中位數(shù)：2.0/HPF），然而，在557例鼻咽癌組織石蠟切片染色中均未觀察到CD4+IL-17+雙陽(yáng)性信號(hào)。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，間質(zhì)中的CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與鼻咽癌患者的無(wú)瘤生存時(shí)間顯著正相關(guān)，而與總體生存時(shí)間雖然存在正相關(guān)趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細(xì)胞高數(shù)量組發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)低于數(shù)量較少的患者，能一定程度降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細(xì)胞在NPC間質(zhì)中的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多與鼻咽癌患者預(yù)后呈正相關(guān)，降低局部復(fù)發(fā)，但不能降低死亡風(fēng)險(xiǎn)；在鼻咽癌腫瘤組織中未觀察到CD4+IL-17+雙陽(yáng)性信號(hào)。

【關(guān)鍵詞】腫瘤微環(huán)境；鼻咽癌；CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞；IL-17

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞RegulatoryTcells，Treg）是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，具有明顯的免疫抑制性，該細(xì)胞在維持機(jī)體免疫、預(yù)防免疫性疾病之中起到重要作用［1］。Foxp3分子是賦予Treg細(xì)胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特異性的可靠的標(biāo)志分子［2］。近年來(lái)，關(guān)于Treg腫瘤免疫以及腫瘤免疫治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細(xì)胞亞群，其主要效應(yīng)分子IL-17，具有強(qiáng)烈的促炎癥作用，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用［3］。本研究采用免疫組化雙染色法檢測(cè)CD4+Foxp3+Treg調(diào)節(jié)T細(xì)胞、CD4+IL-17+Th17細(xì)胞，觀察并計(jì)數(shù)雙然陽(yáng)性細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達(dá)數(shù)目與臨床病理特征及與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1臨床樣本選取2001年1月～2003年12月經(jīng)中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科診斷為鼻咽癌并有相應(yīng)臨床隨訪資料的組織標(biāo)本557例。入選條件：（1）所收集蠟塊均為患者首次就診診斷為鼻咽癌的活檢標(biāo)本。（2）觀察HE切片，選擇癌巢較大的鼻咽癌石蠟標(biāo)本。（3）標(biāo)本齊全，有完整臨床隨訪資料。（4）死于其它疾?。ǚ潜茄拾┗蛞馔馑劳龅牟∪吮惶蕹?。

1.2免疫組化方法分子標(biāo)記物CD4、Foxp3和IL-17采用免疫組化雙染法檢測(cè)。將組織芯片置入56℃恒溫箱，烘片30-60min，將切片取出后，常規(guī)脫蠟、脫水；雙內(nèi)源酶阻斷劑阻斷6分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原修復(fù)后，PBS清洗后，滴加一抗（第一種），4℃過夜。PBS清洗后，Polymer/HRP37℃孵育30分鐘，PBS清洗后，滴加顯色劑DAB（DAB用SubstrateBuffer 按1：50稀釋）顯色，自來(lái)水終止。PBS清洗后，雙染阻斷劑室溫孵育4分鐘，PBS清洗后，滴加一抗（第二種），4℃過夜，PBS清洗后，Rabbit/MouseLINK）室溫孵育11分鐘，PBS清洗后，Polymer/AP37℃孵育30分鐘，PBS清洗后，滴加顯色劑PermanentRed（用SubstrateBuffer 按1：100稀釋）顯色，自來(lái)水終止。蘇木素復(fù)染1分鐘，自來(lái)水終止顯色，鹽酸酒精分化，蘇木素復(fù)染，晾干或吹干后中性樹膠封片。

1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判定采用雙盲法，由三名對(duì)病例資料完全不知情的病理醫(yī)生對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，CD4陽(yáng)性信號(hào)定位于淋巴細(xì)胞胞膜，IL-17陽(yáng)性信號(hào)定位于淋巴細(xì)胞胞漿，F(xiàn)OXP3陽(yáng)性信號(hào)定位于淋巴細(xì)胞胞核。所有計(jì)數(shù)均在400倍高倍顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不重復(fù)且具代表性的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取其平均值即為各免疫細(xì)胞亞群的密度。

1.4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用X2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，Kaplan-Meier法比較生存情況（log-rank檢驗(yàn)），Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后的多因素分析，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazardratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），最終得到可以獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后的參數(shù)。所有統(tǒng)計(jì)分析均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CD4、FOXP3、IL-17在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況

在鼻咽癌組織中，CD4表達(dá)于淋巴細(xì)胞胞膜，F(xiàn)oxp3表達(dá)于淋巴細(xì)胞胞核，IL-17表達(dá)于淋巴細(xì)胞胞漿。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要在腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)（箭頭表示）（中位數(shù)：2.0/HPF），極少在腫瘤癌巢中浸潤(rùn)。然而，我們應(yīng)用免疫雙染的方法很少發(fā)現(xiàn)CD4與IL-17的共定位（箭頭表示），故未計(jì)數(shù)CD4+IL-17+TH17細(xì)胞在鼻咽癌微環(huán)境的密度。

圖1　CD4+Foxp3+　Treg細(xì)胞和CD4+Foxp3+TH17細(xì)胞在鼻咽癌癌巢和間質(zhì)中的表達(dá)

2.2CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量與鼻咽癌患者預(yù)后的影響結(jié)合患者的臨床隨訪資料，進(jìn)一步分析這些免疫細(xì)胞是否會(huì)影響患者的預(yù)后。以ROC曲線建立的cutoff值為臨界值，將巨噬細(xì)胞的數(shù)量分為高/低表達(dá)數(shù)量組。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，間質(zhì)中的CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞與鼻咽癌患者的無(wú)瘤生存時(shí)間（P＜0.01）顯著正相關(guān)，而與總體生存時(shí)間雖然存在正相關(guān)趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2　間質(zhì)組織CD4+Foxp3+　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與患者的Kaplan-Meier累計(jì)生存曲線

2.3CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)展的影響采用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)價(jià)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞對(duì)患者治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)比（表1）。腫瘤間質(zhì)中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞高數(shù)量組發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)（HR，0.655；95% CI：0.491-0.875，P=0.009）的風(fēng)險(xiǎn)顯著低于低數(shù)量組的患者，能一定程度上降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR，0.76；95%CI：0.551-1.047，P=0.093）。

表1　CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的總生存和無(wú)瘤生存的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型

2.4間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性腫瘤微環(huán)境中的CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞能顯著影響患者的預(yù)后，浸潤(rùn)數(shù)量增多能明顯降低患者治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)。我們進(jìn)一步分析間質(zhì)中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示，CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞在NPC間質(zhì)中的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)（Pearson’sR=-0.105，P=0.013）。

表2　CD4+Foxp3+　Treg細(xì)胞與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3　討論

鼻咽癌是在中國(guó)華南地區(qū)非常常見的一種惡性腫瘤，它與EB病毒（EBV）的感染相關(guān)，其腫瘤組織局部存在大量淋巴細(xì)胞和其它免疫浸潤(rùn)［4］。以往對(duì)腫瘤基礎(chǔ)研究較多注重腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列分子事件。然而，腫瘤的發(fā)生發(fā)展，既緣于細(xì)胞的“內(nèi)因”；但越來(lái)越多的研究表明，該過程不僅涉及腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的分子事件，更重要的是一個(gè)涉及到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜的生物學(xué)行為，包括腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的各種間質(zhì)細(xì)胞的相互作用［5-7］。在腫瘤發(fā)展過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)常常呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞。CD4和CD8是區(qū)分成熟T細(xì)胞亞群的主要表面標(biāo)志。其中CD4+T細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子，對(duì)免疫系統(tǒng)的整體功能具有重要的調(diào)控作用。目前確定的CD4+T細(xì)胞亞群主要包括1型輔助性T細(xì)胞Thelpertype1cells，Th1）、2型輔助性T細(xì)胞Thelpertype2cells，Th2）、17型輔助性T細(xì)胞Thelpertype17cells，Th17）、濾泡輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞regulatoryTcells，Treg）等。其中，Treg細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫抑制功能的重要CD4細(xì)胞亞群。無(wú)論鼠類還是人類Treg細(xì)胞都特征性表達(dá)FOXP3分子，作為核轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix叉頭樣/翼狀螺旋）家族的成員，其編碼基因位于X染色體。Foxp3分子是賦予Treg細(xì)胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特異性的可靠的標(biāo)志分子［1］。

作為腫瘤免疫逃逸的機(jī)制之一，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）主要是通過抑制效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)來(lái)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前，有報(bào)道在多種腫瘤患者外周血和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)目增多和比例升高，且與患者的臨床預(yù)后存在相關(guān)性，但在不同類別腫瘤中情況又有所不同。課題組之前發(fā)現(xiàn)FOXP3+TIL細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目與鼻咽癌患者T分期負(fù)相關(guān)，與總生存期和無(wú)瘤生存期呈正相關(guān)［8］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)鼻咽癌進(jìn)展和預(yù)后的影響僅為初步探討，未針對(duì)鼻咽癌微環(huán)境中CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞進(jìn)行觀察，且當(dāng)時(shí)研究的臨床病例數(shù)較少（106例），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)鼻咽癌患者預(yù)后需進(jìn)一步觀察。因此，在本研究中，我們收集了557例鼻咽癌患者5年完整隨訪資料，首次應(yīng)用免疫組化雙染法檢測(cè)了鼻咽癌組織局部浸潤(rùn)的CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞。通過對(duì)各免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織局部主要是以在腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)的CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞為主，很少有CD4+IL-17+雙陽(yáng)性的Th17細(xì)胞，在癌巢中較少有Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。在我們研究結(jié)果中，CD4+FOXP3+Treg的細(xì)胞數(shù)目與鼻咽癌腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，能降低治療后的鼻咽癌患者的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，一定程度患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，與鼻咽癌患者的無(wú)瘤生存時(shí)間顯著正相關(guān)，而與總體生存時(shí)間雖然存在正相關(guān)趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與課題組之前研究的CD8+FOXP3+Treg對(duì)鼻咽癌患者的預(yù)后一致［8］，也與EBV相關(guān)的濾泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的報(bào)導(dǎo)相同［9］。此外，在少數(shù)實(shí)體瘤中也有類似報(bào)道，如頭頸癌和結(jié)腸癌［10-11］。研究提示，鼻咽癌間質(zhì)浸潤(rùn)的CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞是患者預(yù)后良好的指標(biāo)，其原因可能這類細(xì)胞并不具有免疫抑制功能，而為促進(jìn)腫瘤患者的免疫應(yīng)答功能。

在某些腫瘤患者的外周血、腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)內(nèi)可以檢測(cè)到Th17細(xì)胞［3］。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的數(shù)量與患者的預(yù)后呈正相關(guān)，而與疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［12］；肝癌中也有報(bào)道Th17細(xì)胞的數(shù)量與患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)［13］。本研究首次在鼻咽癌芯片組織中檢測(cè)了CD4+IL-17+雙陽(yáng)性Th17細(xì)胞的表達(dá)數(shù)目，但在腫瘤癌巢和間質(zhì)均未檢查到明顯CD4+IL-17+雙陽(yáng)性Th17細(xì)胞浸潤(rùn)。

本研究是首次在鼻咽癌中應(yīng)用免疫組化雙染法來(lái)檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+FOXP3+Treg細(xì)胞和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞亞群的表達(dá)情況，分析其各自的表達(dá)數(shù)目與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響，在一定程度上切實(shí)反映了鼻咽癌局部腫瘤微環(huán)境中免疫狀況及其對(duì)患者臨床轉(zhuǎn)歸的影響。免疫微環(huán)境中的CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞在間質(zhì)中的浸潤(rùn)在鼻咽癌中傾向于促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這為臨床研究鼻咽癌的免疫治療提供了新思路。

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【中圖分類號(hào)】R739.63

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-016X（2016）03-0001-04

收稿日期：2016-01-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB910301）,國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81272960）,湖南省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（B2014-051）,湖南省自然基金項(xiàng)目（S2016J504B）和湖南省重點(diǎn)項(xiàng)目（2013WK2010）

通訊作者：左建宏,E-mail:632138414@qq.com

Influence of Treg and Th17 Cell in the Tumor Microenvironment on Progression and Prognosis
of Nasopharyngeal Carcinoma

Cai Man-bo1, Zeng Yi-xin2, Shao Jian-yong2, Zuo Jian-hong3
（1. The First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, China； 2. State Key Laboratory of Oncology in South China, Cancer Center, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510060, 3. Institute of Oncology, School of Medicine of University of South China, Hengyang 421001）

［Abstract］Objective This study was to investigate the influence of Treg and Th17 Cell on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma NPC）. Methods 557 nasopharyngeal carcinoma paraffin specimens were collected from January 2001 and December 2003 in cancer center of Sun yat-sen university. All the patients without treatment and with 5 yeas followup were included. Double immunohistochemical staining was performed with CD4/FOXP3 and CD4/IL-17 in 557 patients, statistis analyzed the relationship between the positive cells from different parts with the clinical pathological characteristics and the prognosis of NPC patients. Results We found that CD4+Foxp3+ Treg cell infiltration mostly in the stroma of nasopharyngeal carcinoma median: 2.0/HPF）. No co-expression of IL-17 and CD4 was found in NPC TILs by double immunohistochemical staining. Kaplan-Meier survival curve and the log-rank statistical analysis results show that the number of CD4+Foxp3+ Treg cell in stroma were significantly positive correlation with disease-free survival time. Although there is positive correlation with overall survival time trend, but did not reach statistical significance. Single factor Cox proportional hazards model shows that the recurrent and metastasis transfer risk is lower with the more infiltration of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma than a small number of patients after treatment. CD4+Foxp3+ Treg cell reduce the risk of death to a certain extent in patients, but didnot reach statistical significance. More number of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma has lower recurrence and metastasis of transfer of patients after treatment in patients than a small number. Conclusion The number of CD4+Foxp3+Treg infiltration in the and stroma of the immune microenvironment was positively related with the prognosis of NPC patients, and it reduce the risk of local recurrence and distant metastasis.

［Key words］the tumor microenvironment； Nasopharyngeal carcinoma； CD4+Foxp3+Treg cell； IL-17