Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞及體外檢測

周 華王廣文孔祥騫王 默金 星*吳學(xué)君山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科，濟南 500青州市人民醫(yī)院血管外科，青州 6500

·基礎(chǔ)研究 ·

Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞及體外檢測

周 華1王廣文2孔祥騫1王 默1金 星1*吳學(xué)君1
1山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科，濟南 250021
2青州市人民醫(yī)院血管外科，青州 262500

目的 探討重組腺病毒載體的HGF體外轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可行性，然后利用流式細胞儀檢測目的基因的轉(zhuǎn)染效率，ELISA和免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后外源基因HGF的表達。方法 攜帶HGF（hepatocyte growth factor）基因和綠色熒光蛋白（green fluorescene protein，GFP）的重組腺病毒載體Ad-HGF、Ad-GFP，均由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院哈小琴教授提供。以不同感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）的GFP載體轉(zhuǎn)染BMSCs，流式細胞檢測表達GFP陽性細胞率。以MOI=150時Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs，ELISA檢測和免疫細胞化學(xué)檢測HGF表達；流式細胞儀檢測HGF-BMSC細胞表面標志物和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以確定基因轉(zhuǎn)染后細胞生物學(xué)特性有無變化；同時transwell檢測HGF介導(dǎo)BMSCs細胞遷移能力。結(jié)果 在Ad-GFP以不同MOI轉(zhuǎn)染兔BMSCs 48 h后，GFP的細胞陽性表達率具有明顯差異（P＜0.05）。在MOI=150時，表達GFP陽性細胞率＞98%；在MOI＞150時，表達GFP陽性細胞率不具有明顯差異（P＞0.05）。因此，選擇MOI=150時轉(zhuǎn)染BMSCs。以MOI=150將Ad-HGF轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，ELISA法和免疫細胞化學(xué)法檢測結(jié)果均顯示：HGF蛋白在細胞培養(yǎng)液和胞漿內(nèi)均具有豐富的表達，表明Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs高效，HGF蛋白在BMSCs中高表達。流式細胞儀檢測和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)結(jié)果顯示，腺病毒感染和HGF基因修飾不改變BMSC表型和分化潛能。同時實驗結(jié)果顯示，HGF對BMSC具有極強的趨化作用。結(jié)論 Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs可行，在MOI=150時轉(zhuǎn)染BMSCs，可以獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率＞98%，轉(zhuǎn)染24 h即可見綠色熒光，2～4 d轉(zhuǎn)染率最高；表明重組腺病毒作為載體轉(zhuǎn)染BMSCs，具有高轉(zhuǎn)染率和穩(wěn)定表達。HGF腺病毒表達載體Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs不改變BMSCs的固有特性；經(jīng)過ELISA和免疫組化檢測，BMSCs可以高表達HGF蛋白。HGF對BMSC具有明顯的趨化作用。

骨髓間充質(zhì)干細胞；HGF基因；轉(zhuǎn)染

腺病毒作為基因轉(zhuǎn)染的載體之一，無隨機插入的危險性，具有病毒顆粒穩(wěn)定和宿主范圍廣的特點。基因轉(zhuǎn)染的BMSCs可以將治療性蛋白輸入特定的器官或者組織以滿足基因治療的特定需要，安全性高；它在體內(nèi)同時以治療性材料和持續(xù)輸送靶基因產(chǎn)物，例如促血管新生的生長因子，到缺血組織中載體，2種角色發(fā)揮作用，與單純的細胞治療或者基因治療相比，更具優(yōu)越性。以BMSCs為種子細胞，聯(lián)合基因治療和細胞治療是研究的新思路和趨勢。

肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一個由728個氨基酸構(gòu)成的異構(gòu)二聚體蛋白質(zhì)，通過其受體c-met起作用，具有促新生血管生成、抗血管內(nèi)皮細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞免疫和減輕移植物抗宿主病等重要的生物學(xué)功能［1-10］。HGF促血管生長的作用比VEGF更強［11，12］。研究表明，BMSCs能夠表達HGF的受體（c-met），外源性HGF對BMSCs遷移具有極強的趨化作用［13-15］。BMSCs分泌的HGF是修復(fù)組織損傷的重要作用因子之一［16，17］。為研究聯(lián)合應(yīng)用HGF和BMSC治療肢體缺血性疾病的可行性，應(yīng)用Ad-HGF基因轉(zhuǎn)染BMSC，鑒定轉(zhuǎn)染HGF基因后BMSCs-HGF的生物學(xué)特性和安全性，獲得以下結(jié)論：⑴ HGF腺病毒表達載體Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs，不改變BMSCs的固有特性；⑵ 經(jīng)過ELISA和免疫組化檢測，BMSCs可以高表達HGF蛋白，為相關(guān)后期臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 攜帶HGF基因和GFP重組腺病毒載體

攜帶人HGF基因的腺病毒載體（Ad-HGF）和攜帶GFP基因的腺病毒基因載體（Ad-GFP）均由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院哈小琴教授提供，其醫(yī)療團隊通過細胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組的方法構(gòu)建，為El、E3區(qū)缺失的5型重組腺病毒載體。

1.1.2實驗動物

純系新西蘭大白兔購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。動物均為6～8個月齡，體重為（3.0±0.5）kg，雌雄不限，均顆粒飼料，自由飲水，單籠喂養(yǎng)。所有所用新西蘭大白兔均受到實驗者人道主義對待，符合美國NIH頒布的《實驗動物管理和使用指南》要求。此外本實驗方案獲得了山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準。

1.1.3 試劑

驢抗兔Ⅰ型膠原免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、重組人肝細胞生長因子抗體和HGF-ELISA檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測定

取10 ul腺病毒稀釋在990 ul的DMEM中（102倍稀釋），在充分混勻后再取100 ul液體稀釋于900 ul DMEM中（103倍稀釋），依此方法進行一系列稀釋，最后稀釋倍數(shù)為1012。將293細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，數(shù)量為1×106細胞/孔，培養(yǎng)24～36 h，可以細胞長至90%融合，吸出各孔中培養(yǎng)液，各孔中分別滴加102～1012倍病毒稀釋液，在培養(yǎng)2 h后進行細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）分析。具體方法為：從各孔中吸出病毒液稀釋，每孔加入2 m1含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)36～48 h后顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，目標倍數(shù)即為100%發(fā)生細胞病變效應(yīng)的稀釋倍數(shù)，根據(jù)下附公式計算病毒的感染滴度。

計算公式：感染滴度（pfu/ml）=（1×106細胞/孔）×稀釋倍數(shù)×10/病毒液體積。

1.2.2 MOI對轉(zhuǎn)染效率的影響

在Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，流式細胞儀檢測MOI對轉(zhuǎn)染效率的影響如下：

⑴ 取第3代培養(yǎng)的BMSCs，以1.5×105/L的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，在37oC，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；

⑵ 吸棄上清，加無血清培養(yǎng)基1 ml/孔，培養(yǎng)20 min；

⑶ 分別按照10、50、100、150、200和300的MOI加入Ad-GFP，共設(shè)置6個MOI，每個MOI設(shè)置3個復(fù)孔；

⑷ 每個孔中加完全培養(yǎng)基1 ml，37oC孵育2 h；

⑸ 棄去上清，每個孔中加完全培養(yǎng)基1.5 ml，在37oC、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；

⑹ 胰酶消化細胞，每個孔細胞加400 ul 2%甲醛-PBS固定液重懸；

⑺ 流式細胞儀檢測Ad-GFP感染BMSCs的感染效率，選取最佳MOI，在后續(xù)試驗中用此MOI感染細胞。

1.2.3 重組腺病毒Ad-HGF感染兔BMSCs

方法同1.2.2將第3代BMSCs以1.5×105/L的濃度接種于6孔板中，在37oC、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)1.2.2實驗結(jié)果，重組腺病毒Ad-HGF以MOI為150 pfu/細胞感染BMSC，具體過程同1.2.2。

1.2.4 ELISA法檢測感染后HGF表達

取對數(shù)生長期第3代BMSC，接種于6孔板，生長24 h后Ad-HGF以MOI=150 pfu/細胞進行感染，轉(zhuǎn)染后每48 h收集1次培養(yǎng)液上清（-80oC凍存），每次更換新鮮培養(yǎng)基，連取5次，利用HGF-ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中HGF的含量。

1.2.5 免疫細胞化學(xué)檢測HGF蛋白的表達

在BMSC中免疫細胞化學(xué)檢測HGF蛋白的表達如下：

⑴ 以1×105/L的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；

⑵ 將Ad-HGF病毒以MOI=150轉(zhuǎn)染細胞；

⑶ 在48 h后胰酶消化細胞，以5×105/L的濃度滴加于硅化玻片上，置于37oC、5% CO2孵箱中過夜；

⑷ 取出玻片，PBS洗滌3 min×3次，用l0%多聚甲醛固定30 min，再用PBS液沖洗3 min，于4oC冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?/p>

⑸ 取出4oC冰箱內(nèi)保存的細胞爬片，每張細胞爬片滴加3% H2O2去離子水以消除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下避光孵育15 min，PBS液沖洗5 min×3次；

⑹ 于爬片表面滴加封閉血清，置入37oC孵箱中孵育15 min，甩去多余液體，不沖洗；

⑺ 每張玻片上滴加50 ul anti-h HGF單克隆抗體，4oC過夜；

⑻ PBS洗5 min×3次，除去PBS，于爬片表面滴加50 ul生物素標記的二抗，37oC孵箱孵育15 min，PBS洗5 min×3次；

⑼ 在去除PBS液后，于爬片表面滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素稀釋液，37oC孵育15 min，PBS溶液洗5 min×3次；

⑽ 除去PBS液，于爬片表面滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下控制DAB顯色，蒸餾水洗滌，終止反應(yīng)；

⑾ 蘇木素復(fù)染3 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍；

⑿ 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；

⒀ 顯微鏡下觀察。

1.2.6 流式細胞儀檢測HGF-BMSCs細胞表面標志

利用重組腺病毒Ad-HGF以MOI=150 pfu/細胞感染第3代對數(shù)生長期BMSCs 48 h后，將HGF-BMSCs細胞用0.25%胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù)，調(diào)整密度為5×107/m1。不同離心管中加0.1 ml細胞懸液，各離心管中分別加入待檢一抗，37oC孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次，加入FITC標記的二抗，37oC孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次，1000 rpm離心5 min，棄上清，0.5 ml PBS緩沖液將細胞重懸備流式細胞儀進行檢測。1.2.7 HGF-BMSCs成骨分化能力鑒定

取對數(shù)生長期第3代BMSC，接種于6孔板，1×105細胞/孔，在生長24 h后Ad-HGF以MOI=150 pfu/細胞進行感染。在感染48 h后進行成骨誘導(dǎo)分化；誘導(dǎo)分化3周后行Ⅰ型膠原免疫組化染色。

1.2.8 HGF介導(dǎo)BMSCs細胞遷移分析

HGF介導(dǎo)BMSCs細胞遷移分析［18］，具體操作如下：⑴ 在遷移孔下槽中加入轉(zhuǎn)移介質(zhì)，將Transwells沉入介質(zhì)中，放置于37oC溫箱孵育30 min；⑵ 用胰蛋白酶消化人BMSCs，將細胞濃度調(diào)整為1×106/ml；取出遷移板，在每個遷移孔上槽中滴加100 ul細胞懸液，37oC孵育1 h；⑶在遷移孔下槽中分別加入不同濃度HGF（0、10、25、50、100 ng/ml），37oC孵育2 h；⑷ 將Transwells轉(zhuǎn)移至加有2%多聚甲醛的孔中，固定10 min；⑸ 用0.5%結(jié)晶紫染10 min；⑹ 輕輕抹去膜上未遷移的細胞，置于光鏡下觀察結(jié)果并且計數(shù)，隨機選取5個視野計數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所用統(tǒng)計軟件為SPSS 11.0版。設(shè)定P＜0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有相關(guān)數(shù)據(jù)以（均值±標準差）表達，以不同MOI的Ad-GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs 48 h后，利用完全隨機資料的方差分析GFP陽性細胞率。

2 結(jié)果

2.1 Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

熒光顯微鏡觀察結(jié)果，綠色熒光表達在Ad-GFP感染BMSCs后24h開始出現(xiàn)，2～4d表達強度最高（圖1）。上述結(jié)果表明腺病毒載體基因能夠有效轉(zhuǎn)染BMSCs。

圖1 Ad-GFP感染BMSCs 48 h后綠色熒光表達

2.2 不同MOI Ad-GFP對BMSCs轉(zhuǎn)染效率的影響

流式細胞術(shù)檢測Ad-GFP以不同的MOI轉(zhuǎn)染兔BMSCs后48hGFP的表達，檢測有GFP表達的陽性細胞率，結(jié)果見（圖2，3）。統(tǒng)計結(jié)果顯示：隨著MOI增加表達GFP細胞陽性率隨之增加，但是當MOI＞150，其表達率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；Ad-GFP以MOI=150轉(zhuǎn)染BMSC陽性率最高，表達GFP陽性率＞98%。因此，選擇150作為轉(zhuǎn)染BMSCs的MOI。

圖2 流式細胞檢測不同MOI值A(chǔ)D-GFP轉(zhuǎn)染后細胞陽性率

2.3 ELISA法檢測感染后HGF表達

Ad-HGF以MOI=150pfu/細胞感染BMSC，HGFELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中HGF含量，結(jié)果如圖4所示。BMSCs-HGF在感染后48h表達量最高，平均值為（98.18±1.38）ng/ml，并且在10d內(nèi)可以持續(xù)表達，其中隨后呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)果表明，感染Ad-HGF可以使BMSCs短時間內(nèi)高表達HGF，同時具有一定的時間變化規(guī)律。

圖3 不同MOI轉(zhuǎn)染兔BMSCs后表達GFP陽性細胞率（均數(shù)±標準差，n=3）

圖4 ELISA法檢測Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs后不同時間表達HGF的量

2.4 免疫細胞化學(xué)檢測HGF蛋白在HGF-BMSCs中的表達

Ad-HGF以MOI=150轉(zhuǎn)染兔BMSCs后制備細胞爬片，免疫細胞化學(xué)染色檢測到BMSC胞漿內(nèi)有HGF蛋白陽性表達，結(jié)果證明Ad-HGF可以有效轉(zhuǎn)染BMSCs，并且有HGF蛋白的高表達（圖5）。

圖5 免疫組化檢測HGF蛋白在HGF-BMSCs中的表達

2.5 流式細胞檢測HGF-BMSCs細胞表面特異抗原結(jié)果

Ad-HGF以MOI=150 pfu/細胞感染BMSC后48 h，應(yīng)用流式細胞儀對HGF-BMSCs的特異細胞表面抗原進行檢測分析顯示，轉(zhuǎn)染Ad-HGF的BMSCs均表達CD44、CD29陽性，而不表達CD34、CD45，這和第1部分結(jié)果相同，說明腺病毒感染和HGF基因修飾不改變BMSC表型。

2.6 HGF-BMSCs誘導(dǎo)分化成骨能力結(jié)果

為了明確Ad-HGF感染對BMSCs細胞分化潛能的影響，對HGF-BMSCs進行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗。誘導(dǎo)3周后行Ⅰ型膠原免疫細胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示Ⅰ型膠原表達陽性（圖6），說明HGF-BMSCs和BMSCs具有相同成骨分化能力，轉(zhuǎn)染HGF基因不影響B(tài)MSCs的分化潛能。

2.7 HGF介導(dǎo)BMSCs細胞遷移能力分析

為了明確Ad-HGF感染的BMSCs移植入體內(nèi)后，過表達分泌的HGF是否對BMSC具有趨化作用，是否能夠?qū)MSCs集聚在局部缺血組織中發(fā)揮治療作用，本研究應(yīng)用Transwells法檢測了HGF對BMSC的趨化作用，結(jié)果顯示在加入HGF后穿過膜微孔的BMSCs數(shù)量比無HGF趨化的對照組明顯增多（圖7）。然后利用直線相關(guān)回歸對相關(guān)細胞計數(shù)進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)r=0.99，P＜0.01，充分說明HGF劑量和遷移的BMSCs數(shù)之間呈正相關(guān)（圖8）。

圖6 HGF-BMSCs成骨誘導(dǎo)后Ⅰ型膠原免疫細胞化學(xué)染色

圖7 Tranwell檢測HGF對BMSC的趨化作用

圖8 HGF趨化的BMSCs計數(shù)與HGF濃度之間的關(guān)系

3 討論

腺病毒載體基因由5個部分組成，包括El（ElA、ElB）、E2A、E2B、E3和E4等，其中El和腺病毒載體復(fù)制有關(guān)，去除El可以引起復(fù)制缺陷，E3區(qū)缺失可以使其能夠逃避宿主的免疫系統(tǒng)。目前基因治療中所應(yīng)用的腺病毒載體為重組腺病毒，去除整個E1A、部分E1B基因和E3后，由外源性DNA代替。重組腺病毒可以在許多細胞中表達外源基因，適用于體內(nèi)基因治療，表達效價高，容納大量的外源基因，并且其DNA不能夠整合于靶細胞DNA中，因此安全性高［19］。重組腺病毒作為重組基因的轉(zhuǎn)染中介，其安全性和有效性在早期臨床實驗中已經(jīng)得到初步證實［20-22］。

本實驗選用El、E3區(qū)缺失的5型重組腺病毒載體，通過檢測其活性滴度達5×1010pf/ml。同時本實驗表明Ad-GFP可以高效率轉(zhuǎn)染BMSCs，綠色熒光在轉(zhuǎn)染后24h開始出現(xiàn)，2～4d熒光強度最強。

HGF是一個由728個氨基酸構(gòu)成的異構(gòu)二聚體蛋白質(zhì)，通過其受體c-met起作用，具有促新生血管生成、抗血管內(nèi)皮細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞免疫和減輕移植物抗宿主病等重要的生物學(xué)功能［1-10］。HGF促血管生長的作用比VEGF更強［11，12］。研究表明，BMSCs能夠表達HGF的受體（c-met），外源性HGF對BMSCs遷移具有極強的趨化作用［13-15］。BMSCs分泌的HGF是組織損傷修復(fù)時重要的作用因子之一［16，17］。HGF半衰期很短，不能夠長時間發(fā)揮效應(yīng)，解決這個問題的有效辦法是應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染將HGF基因轉(zhuǎn)入BMSCs。Ad-HGF所使用的治療基因HGF是人源性，依照基因序列設(shè)計引物，從人胎盤cDNA庫中擴增得到。利用Ad-HGF感染BMSCs，將HGF基因釋放到宿主細胞核中，利用細胞自分泌功能，完成HGF局部高表達，綜合HGF的促血管新生能力、抗細胞凋亡作用和促干細胞趨化聯(lián)合BMSCs的多向分化功能，共同促進血管新生，為治療肢體缺血性疾病提供一條有效的途徑。腺病毒載體HGF（Ad-HGF）基因轉(zhuǎn)染BMSCs移植治療缺血性疾病的理論依據(jù)為：⑴ 將HGF基因?qū)隡SCs細胞內(nèi)，借助細胞作為基因的載體，作為工程細胞的MSCs可以緩慢釋放HGF，使得HGF基因能夠在短時間內(nèi)穩(wěn)定表達，克服了單純的HGF治療時半衰期短，必須反復(fù)用藥的弊端，減少治療所需BMSCs數(shù)量，有利于干細胞的定向分化功能；⑵ 將HGF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植到機體局部缺血區(qū)域，既可以直接誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞促血管新生，又能夠表達血管新生所需相關(guān)生長因子，生長因子除可以直接促血管內(nèi)皮的生長，還有骨髓動員作用，骨髓動員增強了基因的作用，因而多途徑地促進血管新生，對移植的干細胞存活率和改善肢體缺血均具有重要意義；⑶ 減少治療所需MSCs細胞數(shù)量，有利于細胞的定向誘導(dǎo)分化；⑷ 采用腺病毒載體HGF基因轉(zhuǎn)染MSCs后移植，可以有效避免干細胞移植和基因治療分別進行時，由于病毒直接暴露于治療對象的免疫系統(tǒng)，激發(fā)治療對象免疫反應(yīng)而產(chǎn)生毒性；⑸ Ad-HGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植增加了轉(zhuǎn)染效率，增加了可控性。

本實驗將Ad-GFP以不同MOI感染BMSCs，流式細胞儀檢測表明Ad-GFP可以高效地感染BMSCs，在MOI=150時感染效率最高，可以＞98%。遂將Ad-HGF 以MOI=150感染BMSCs，ELISA法檢測HGF表達量。結(jié)果顯示，HGF-BMSCs在10 d內(nèi)可以持續(xù)表達HGF，其中轉(zhuǎn)染后48 h表達量最高，平均值為（98.18±1.38）ng/ml，其后HGF表達呈現(xiàn)下降趨勢。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Ad-HGF的BMSCs短時間內(nèi)可以高表達HGF，并且其表達具有時間變化規(guī)律。與此同時利用流式細胞法檢測HGFMSCs細胞表面特異性抗原，和未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs相似，仍然表達CD44、CD29陽性，不表達CD34、CD45，說明HGF基因轉(zhuǎn)染不改變BMSCs表性特征。同時又觀察了HGF-MSCs的多向分化潛能，對HGF-BMSCs進行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，行Ⅰ型膠原免疫細胞化學(xué)染色，顯示HGF-BMSCs具有和BMSCs相同成骨誘導(dǎo)分化能力，HGF基因轉(zhuǎn)染不影響B(tài)MSCs的分化潛能。綜合上述2個方面表明，腺病毒載體HGF基因轉(zhuǎn)染不改變BMSCs的生物學(xué)特性。同時為了明確Ad-HGF感染的BMSCs注入體內(nèi)后，過表達分泌HGF是否將BMSC聚集在缺血組織局部發(fā)揮治療作用，檢測HGF對BMSC的趨化作用，發(fā)現(xiàn)HGF可以明顯誘導(dǎo)BMSC遷移，而且存在劑量依賴關(guān)系。

本部分實驗結(jié)果表明，HGF-BMSC保持了BMSCs特性，并且可以高效表達HGF，而HGF又對BMSC具有明顯的趨化作用。由此可以推斷，HGF-BMSC移植后在缺血局部高表達HGF，并且將BMSC遷移聚集在缺血部位發(fā)生作用，促進血管新生。

［1］Bussolino F， Di RM， Ziche M， et al. Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth. J Cell Biol， 1992， 119 （3）: 629-641.

［2］Ma H， Calderon TM， Fallon JT， et al. Hepatocyte growth factor is a survival factor for endothelial cells and is expressed in human atherosclerotic plaques. Atherosclerosis，2002， 164 （1）: 79-87.

［3］Bardelli A， Longati P， Albero D， et al. HGF receptor associates with the anti-apoptotic protein BAG-1 and prevents cell death. EMBO， 1996， 15 （22）: 6205-6212.

［4］Fan S， Ma YX， Mang JA， et al. The cytokine hepatocyte growth factor /scatter factor inhibits apoptosis and enhances DNA repair by a common mechanism involving signaling through phosphatidyl inositol 3' kinase. Onocgene， 2000， 19 （18）: 2212-2223.

［5］Ratajczak MZ， Marlicz W， Ratajczak J， et al. Effect of hepatocyte growth factor on early human haemopoietic cell development. Br J Haematol， 1997， 99 （1）: 228-236.

［6］Ohmichi H， Matsumoto K， Nakamura T. In vivo mitogenic action of HGF on lung epithelial cells: pulmotrophic role in lung regeneration. Am J Physiol， 1996， 270 （6）: 1031-1039.

［7］Kato Y， Yu D， Lukish JR， et al. Influence of luminal hepatocyte growth factor on small intestine mucosa in vivo. J Surg Res， 1997， 71 （1）: 49-53.

［8］Kawaida K， Matsumoto K， Shimazu H， et al. Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice. Proc Natl Acad Sci USA， 1994，91 （10）: 4357-4361.

［9］Yoshimura R， Watanabe Y， Kasai S， et al. Hepatocyte growth factor （HGF） as a rapid diagnostic marker and its potential in the prevention of acute renal rejection. Transpl Int， 2002， 15 （4）: 156-162.

［10］Ueki T， Kaneda Y， Tsutsui H， et al. Hepatoeyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. Nat Med， 1999， 5 （2）: 226-230.

［11］Van BE， Witzenbichler B， Chen D， et al. Potentiated angiogenic effect of scatter factor/hepatocyte growth factor via induction of vascular endothelial growth factor: the case for paracrine amplification of angiogenesis. Circulation，1998， 97 （4）: 381-390.

［12］Hayashi S， Morishita R， Higaki J， et al. Autocrine-paracrine effects of overexpression of hepatocyte growth factor gene on growth of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun， 1996， 220 （3）: 539-545.

［13］Takai K， Hara J， Matsumoto K， et al. Hepatocyte growth factor is constitutively produced by human bone marrow stormal cells and indirectly promotes hematopoiesis. Blood，1997， 89 （5）: 1560-1565.

［14］Neuss S， Becher E， Woltje M， et al. Functional expression ofHGF and HGF receptor/c-met in adult human mesenchymal stem cells suggests a role in cell mobilization，tissue repair，and wound healing. Stme Cells， 2004， 22 （3）: 405-414.

［15］Qian LW， Mizumoto K， Maehara N， et al. Co-cultivation of pancreatic cancer cells with orthotopic tumor-derived fibroblasts: fibroblasts stimulate tumor cell invasion via HGF secretion whereas cancer cells exert a minor regulative effect on fibroblasts HGF production. Cancer Lett， 2003， 190 （1）: 105-112.

［16］Chen X， Li Y， Wang L， et al. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology， 2002， 22 （4）: 275-279.

［17］Chen X， Katakowski M， Li Y， et al. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. J Neurosci Res， 2002， 69 （5）: 687-691.

［18］Tarui T， Majumdar M， Miles LA， et al. Plasmin-induced migration of endothelial cells. A potential target for the antiangiogenic action of angiostatin. J Biol Chem， 2002， 277（37）: 33564-33570.

［19］Mah C， Byrne BJ， Flotte TR. Virus-based gene delivery systems. Clin Pharmacokinet， 2002， 41 （12）: 901-911.

［20］Losordo DW， Vale PR， Symes JF， et al. Gene Therapy for Myocardial Angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF 165 as sole therapy for myocardial ischemia. Circulation， 1998， 98 （98）: 2800-2804.

［21］Rosengart TK， Lee LY， Patek SR， et al. Angiogenesis gene therapy: phase I assessment of direct intra myocardial administration of an adenovirus vector expressing VEGF 121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease. Circulation， 1999， 100 （5）: 468-474.

［22］Mack CA， Patel SR， Schwarz EA， et al. Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for vascular endothelial growth factor 121 improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart. J Thorac Cardiovasc Surg， 1998， 115 （1）: 168-177.

Preparation of BMSCs transduced with Ad-HGF and invitro experiment

ZHOU Hua1WANG Guang-wen2KONG Xiang-qian1WANG Mo1JIN Xing1*WU Xue-jun11Department of Vascular Surgery， Provincial Hospital affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China
2Department of Vascular Surgery， People's Hospital， Qingzhou 262500， China

Objectives Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） were causing transdution with hepatocytegrowth factor （HGF） by adenovirus vector. With the fowing of cytometry， transduction efficiency could be detected. Transgene expression of HGF invitro were evaluated by using ELISA and immunohistochemical methods. Methods BMSCs were plated and cultivated in 6 holes plate by using a density of 1.5×105/per hole after digested with pancreatic enzyme. 50 ul Ad-GFP with 6 different MOI （multiple of infection） was put into each hole to transduce BMSCs，with 3 duplicated holes for each MOI. BMSCs were transduced with Ad-hgf at MOI=150. BMSCs were added to silicificated slice and cultivated after digested with pancreatic enzyme. Afterwards BMSCs were detected with ELISA and immunohistochemical methods. Furthermore， transwell was used to detect the efficiency of BMSC migration mediated by HGF. Results 48 h after BMSCs transduction with Ad-GFP at different MOI， percentage of GFP-positive cells showed significant difference （P＜0.05）. Percentage of GFP-positive cells increased as MOI increased. However there was no significant difference （P＞0.05） when MOI was bigger than 150. When MOI=150， GFP-positive cells were over 98%. Consequently MOI=150 was ideal for BMSCs transduction. When BMSCs were transduced with Ad-HGF at MOI=150， the results of ELISA and immunohistochemistry indicated that Ad-HGF might effectively transducer BMSCs. Besides， the transduced BMSCs revealed that the high HGF expression was of great efficiency. The result indicated that the migration of BMSCs was promoted by HGF as well. Conclusions Ad-GFP transduced BMSCs is feasible. As MOI=150， GFP-positive cells were bigger than 98%. There were GFP-positive cells only 24 h after transduction with peak percentage from 2 d to 7 d. The results turn out that adenovirus vector possesses high effieiency transduction and stable gene expression. Results of ELISA and immunohistochemitry testify that Ad-HGF could effectively transduce BMSCs and that transduce BMSCs possesses high efficiency of HGF gene expression invitro.

bone mesenchymal stem cells； HGF； transfection

Q78

A

2096-0646.2016.02.03.19

金星，E-mail：jinxing_888@163.com