內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

邱　濤，劉修恒，周江橋，張　龍，汪志順，祝恒成

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院：1.器官移植科；2.泌尿外科，湖北武漢　430060)

?

·基礎(chǔ)研究·

內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

邱濤1，劉修恒2，周江橋1，張龍2，汪志順2，祝恒成2

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院：1.器官移植科；2.泌尿外科，湖北武漢430060)

University,Wuhan430060,China)

摘要：目的觀察不同臨床分期腎透明細(xì)胞癌的內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子(ESM-1)的表達(dá)差異，以探討ESM-1與腫瘤發(fā)生及惡性程度的相關(guān)性。方法收集腎透明細(xì)胞癌組織、正常腎組織以及癌旁組織標(biāo)本，進(jìn)行免疫印跡和免疫組化染色，并根據(jù)蛋白條帶的灰度值和免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量評(píng)分，同時(shí)監(jiān)測(cè)患者血清中ESM-1的表達(dá)水平。結(jié)果免疫印跡顯示腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本中ESM-1表達(dá)灰度為2.12±0.23，免疫組化顯示腎透明細(xì)胞癌中ESM-1陽性染色評(píng)分為2.1±0.94，相比癌旁組織組和正常腎組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ESM-1血清中表達(dá)量較正常組升高。結(jié)論檢測(cè)ESM-1的表達(dá)有助于判斷腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后。

關(guān)鍵詞:腎透明細(xì)胞癌；免疫組化；內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子(ESM-1)

腎癌是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤。早期局限性腎癌可以通過外科手術(shù)切除達(dá)到治愈目的，但晚期腎癌喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，同時(shí)透明細(xì)胞癌對(duì)放療、化療都不敏感。近幾年來出現(xiàn)的激酶抑制劑如索拉菲尼、舒尼替尼等靶向治療藥物可以延緩?fù)砥谀I癌患者的生存期。內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子(endothelialcell-specificmolecule1,ESM1)是血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性表達(dá)的分子標(biāo)志物，在肺和腎臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性表達(dá)，在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤中也呈高表達(dá)[1-2]，但在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)研究不多[3]。本文收集腎透明細(xì)胞癌的組織標(biāo)本檢測(cè)ESM-1的表達(dá)，希望為腫瘤的預(yù)后提供新的分子標(biāo)志。

1資料與方法

1.1一般資料基于納入和排除標(biāo)準(zhǔn)收集到武漢大學(xué)人民醫(yī)院2012年1月至2014年12月進(jìn)行的腎切除術(shù)獲取的腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本34例，統(tǒng)計(jì)患者的基本資料以及腫瘤的分期。腎透明細(xì)胞癌的癌旁組織標(biāo)本和外傷性切除腎組織作為對(duì)照組。二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)試劑盒購自碧云天公司，ESM-1兔抗人抗體，二抗購置SANTCRUZ公司。

納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)病理診斷腎透明細(xì)胞癌，年齡在18歲以上。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除術(shù)前合并其他系統(tǒng)腫瘤，排除術(shù)前進(jìn)行過放療、化療等干預(yù)腫瘤操作，排除病檢合并其他來源的腎癌，排除高血壓、糖尿病。

1.2標(biāo)本收集與處理獲得的新鮮組織，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4～5μm厚切片，HE染色，光鏡觀察，經(jīng)病理科醫(yī)師確診。

1.3ESM-1表達(dá)的檢測(cè)方法

1.3.1免疫印跡分析取300mg標(biāo)本，利用細(xì)胞裂解液冰上裂解，30min后12 000g，離心5min獲得上清液，利用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，-80 ℃保存。取20μg上樣量電泳，轉(zhuǎn)膜，洗滌，封閉，用1∶1 500的兔抗人ESM-1抗體孵育過夜，洗滌后1∶2 000的抗兔二抗孵育1h后洗滌顯影，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。用凝膠圖像分析儀測(cè)量條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參比值。

1.3.2免疫組化分析免疫組織化學(xué)采用SP法，DAB顯色。一抗為兔抗人ESM-1。以正常腎組織標(biāo)本及RCCC癌旁組織標(biāo)本為對(duì)照。結(jié)果分析，ESM-1免疫組化染色以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，依陽性細(xì)胞所占比例不同將染色結(jié)果進(jìn)行計(jì)分統(tǒng)計(jì)，分為4個(gè)級(jí)別，陰性(0～10%)、1(>10%～30%)、2(>30%～60%)、3(>60%)。

1.3.3ELISA分析收集腎癌患者血清和正常對(duì)照組血清，按照ELISA試劑盒進(jìn)行操作檢測(cè)ESM-1的表達(dá)，留存數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)意義。

2結(jié)果

2.1臨床資料特征收集腎癌組織34例，患者男28例，女6例；年齡23～67歲；T1期15例，T2期10例，T3期6例，T4期3例；腎癌根治術(shù)23例，其中腹腔鏡17例，開放手術(shù)6例；腎部分切除術(shù)11例，腹腔鏡腎部分切除術(shù)8例，開放腎部分切除術(shù)3例。以8例切除的外傷性腎組織作為對(duì)照組，患者男7例，女1例，無腎臟相關(guān)疾病病史。

2.2WestenBlot結(jié)果在34例腎癌組織檢測(cè)到ESM-1表達(dá)灰度比值為2.12±0.23，取同一患者腎癌邊界1cm內(nèi)的癌旁組織檢測(cè)ESM-1表達(dá)，其灰度比值為1.45±0.35，對(duì)照組外傷性腎組織中ESM-1灰度比值為0.56±0.26。腎癌組織的ESM-1表達(dá)灰度比值相比癌旁組織組和正常組織明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異性(P<0.05，表1)。

2.3免疫組織化學(xué)在腎癌組織中ESM-1大量表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，癌旁組織中ESM-1呈不同程度表達(dá)，對(duì)照組外傷性腎組織中ESM-1表達(dá)無2、3級(jí)(圖1)。腎癌組織中ESM-1表達(dá)評(píng)分為，相比癌旁組織組和正常組織明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異性(P<0.05，表1)。

圖1免疫組化檢測(cè)不同組ESM-1的表達(dá)(×200)

A:對(duì)照外傷性腎組織；B:腎癌旁組織；C:腎腫瘤組織。

表1不同組織中免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ESM-1表達(dá)的定性、定量結(jié)果

組織例數(shù)定性結(jié)果陰性1級(jí)2級(jí)3級(jí)定量評(píng)分腎癌組織343412152.1±0.94*#癌旁組織34681461.58±0.98對(duì)照腎組織835000.62±0.51

注：同癌旁組織比較,*P<0.05；同對(duì)照腎組織組比較,#P<0.01。

2.4ELISA分析結(jié)果腎癌患者中ESM-1表達(dá)量為(6.97±0.67)ng/mL, 對(duì)照組為(1.15±0.21)ng/mL。腎癌組患者血清檢測(cè)ESM-1表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05，圖2)。

圖2　ELISA檢測(cè)腎癌患者和正常組患者中血清ESM-1表達(dá)

3討論

隨著近年來靶向藥物的逐漸普及，晚期腎癌的生存期得到了顯著延長。靶向藥物索拉菲尼、舒尼替尼等可增加血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)血清濃度，減少血管內(nèi)皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2,3,VEGFR-2,3)濃度，通過檢測(cè)VEGFR-2的濃度可以監(jiān)測(cè)靶向藥物的治療有效性。

ESM-1是1993年被發(fā)現(xiàn)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種特異性糖蛋白，分子質(zhì)量為50ku，含有165個(gè)氨基酸，于137位絲氨酸位點(diǎn)共價(jià)連接的一條硫酸皮膚素單鏈。該皮膚素硫酸鹽蛋白多糖是血管內(nèi)皮表達(dá)的，存在于正常個(gè)體的血液中。越來越多的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)顯現(xiàn)ESM-1在細(xì)胞粘附、炎癥反應(yīng)以及腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，炎癥細(xì)胞因子如TNF-α，前血管源性生長因子如VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblastgrowthfactor2，F(xiàn)GF-2)和肝細(xì)胞生長因子/散射因子(hepatocytegrowthfactor/scatterfactor，HGF/SF)均能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞ESM-1的表達(dá)合成[4]。ESM-1在肺癌患者的血清水平中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，最近研究發(fā)現(xiàn)ESM-1mRNA水平是評(píng)估肺癌進(jìn)展的極為重要的指標(biāo)之一，是極具潛力的標(biāo)記物、治療靶點(diǎn)[3]。

在肺癌的研究中已經(jīng)說明ESM-1特異性的表達(dá)，并且同腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。后續(xù)在肝癌，乳腺癌又得到進(jìn)一步證實(shí)。而腫瘤患者血清中ESM-1的檢測(cè)為腫瘤的預(yù)后提供了良好的分子標(biāo)記物。因?yàn)镋SM-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，因此腫瘤細(xì)胞上是無法檢測(cè)到ESM-1的表達(dá)，而腫瘤血管生成是腫瘤侵襲性增強(qiáng)的主要特征。在我們收集的腫瘤標(biāo)本中檢測(cè)到ESM-1表達(dá)，而癌旁組織，正常腎組織表達(dá)量較低。腫瘤患者血清中ESM-1呈特異性升高，同腫瘤分期呈正相關(guān)。但由于收集病例數(shù)有限，同時(shí)ESM-1的表達(dá)同慢性腎臟病，其他炎癥反應(yīng)相關(guān)，因此尚不能完全指導(dǎo)監(jiān)測(cè)腫瘤的預(yù)后。

在腫瘤組織中，ESM-1與血管新生關(guān)系密切。1日齡SD大鼠經(jīng)缺氧處理后，在不同恢復(fù)時(shí)間段，其未成熟的視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1以及Clautin-5 的mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，而ESM-1表達(dá)顯著升高[5]。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ESM-1能夠下調(diào)ZO-1以及clautin-5，從而可能增加了單層內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，利于單核細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。通過沉默ESM-1的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤的進(jìn)展[6-7]，為晚期腫瘤的治療提供新的策略。免疫組化圖片顯示腎癌組中ESM-1高表達(dá)在腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞中，包括腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上。

本研究結(jié)果表明，腎透明細(xì)胞癌中ESM-1呈高表達(dá)，可能成為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

[1]LIUN,ZHANGLH,DUH,etal.Overexpressionofendothelialcellspecificmolecule-1 (ESM-1)ingastriccancer[J].AnnSurgOncol,2010,17:2628-2639.

[2]KIMJH,PARKMY,KIMCN，etal.Expressionofendothelialcell-specificmolecule-1regulatedbyhypoxiainduciblefactor-1alphainhumancoloncarcinoma:impactofESM-1onprognosisanditscorrelationwithclinicopathologicalfeatures[J].OncolRep,2012,28:1701-1708.

[3]LEROYX,AUBERTS,ZINIL,etal.Vascularendocan(ESM-1)ismarkedlyoverexpressedinclearcellrenalcellcarcinoma[J].Histopathology, 2010,56:180-187.

[4]YANGJ,YANGQ,YUS,etal.Endocan:Anewmarkerforcancerandatargetforcancertherapy[J].BiomedRep. 2015,3:279-283.

[5]RATHNASAMYG,SIVAKUMARV,FOULDSWS,etal.Vascularchangesinthedevelopingratretinainresponsetohypoxia[J].ExperiEyeRes, 2015, 130: 73-86.

[6]KANGYH,JINY,LEECI,etal.ESM-1silencingdecreasedcellsurvival,migration,andinvasionandmodulatedcellcycleprogressioninhepatocellularcarcinoma[J].AminoAcids，2011,40:1003-1013.

[7]KANGYH,JINY,HANSR,etal.ESM-1regulatescellgrowthandmetastaticprocessthroughactivationofNF-kappaBincolorectalcancer[J].CellSignal,2012,24:1940-1949.

(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-09-06修回日期：2015-11-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No.81400753)，武漢市科技局項(xiàng)目(No.2013062301010808)

通訊作者：劉修恒，教授.E-mail:drliuxh@hotmail.com

作者簡介:邱濤(1984-)，男(漢族)，主治醫(yī)師，博士學(xué)位，從事腎臟病研究. E-mail: mdqiutao@yahoo.com

中圖分類號(hào):R737

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.04.019

Expression and significance of ESM-1 in renal clear cell carcinoma

QIU Tao1, LIU Xiu-heng2, ZHOU Jiang-qiao1, ZHANG Long2, WANG Zhi-shun2, ZHU Heng-cheng2

(1.DepartmentofOrganTransplantation; 2.DepartmentofUrology,People’sHospitalofWuhan

ABSTRACT:Objective To explore the various expressions of ESM-1 in clinical renal clear cell carcinoma (RCCC) of different stages, in order to investigate its correlation with tumorigenesis and malignancy. MethodsRCCC specimens, para-carcinoma tissues and normal kidney tissues were obtained. The ESM-1 expressions were detected with Western blot and immunohistochemical staining. The expression of ESM-1 in serum was detected with ELISA. ResultsThe results of Western blot showed that ESM-1 expression in RCCC was 2.12±0.23, which was statistically different from that in para-carcinoma tissue and normal kidney tissue (both P<0.05). The results of immunohistochemical staining showed that the ESM-1 score in RCCC was 2.1±0.94, which was statistically different from that in para-carcinoma tissue and normal kidney tissue (both P<0.05). ESM-1 expression in the serum of RCCC patients was higher than in normal controls. ConclusionDetection of ESM-1 expression can provide evidence for the prognosis of RCCC.

KEY WORDS:renal clear cell carcinoma; immunohistochemistry; ESM-1