王 偉,彭瑞鮮,何林富,樂 飚,渠香云,施國偉,何家揚
(1.復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院泌尿外科、復旦大學泌尿外科研究所、復旦大學循證醫(yī)學中心,上海 200240;2. 上海度微醫(yī)學技術有限公司,上?!?01507)
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·臨床研究·
磁性納米微粒介導的尿前列腺癌抗原3檢測診斷前列腺癌的價值
王偉1,彭瑞鮮1,何林富2,樂飚2,渠香云2,施國偉1,何家揚1
(1.復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院泌尿外科、復旦大學泌尿外科研究所、復旦大學循證醫(yī)學中心,上海200240;2. 上海度微醫(yī)學技術有限公司,上海201507)
摘要:目的探討磁性納米微粒介導的尿前列腺癌抗原3(PCA3)檢測診斷前列腺癌的價值。方法對2014年9月至2015年5月在我院行前列腺穿刺活檢的90例患者行診斷試驗研究。診斷試驗為尿PCA3檢測,分別采用磁性納米微粒介導法和傳統(tǒng)尿沉淀法。診斷的金標準為前列腺穿刺活檢病理。繪制尿PCA3診斷前列腺癌的受試者工作特征曲線,計算曲線下面積(AUC),比較兩種不同檢測方法診斷前列腺癌的價值,計算靈敏度和特異度等。結果90例患者中活檢診斷前列腺癌25例,磁性納米微粒介導法的AUC為0.934(95%CI=0.881~0.986,P<0.001),高于傳統(tǒng)尿沉淀法的0.792(95%CI=0.668~0.915,P<0.001)。磁性納米微粒介導法測得的尿PCA3分值,當臨界點為25時,診斷前列腺癌的敏感度為77.3%,特異度為91.2%。結論磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測,能提高檢測的敏感性,診斷價值優(yōu)于傳統(tǒng)尿沉淀法。
關鍵詞:前列腺癌;診斷試驗;前列腺癌抗原3;磁性納米微粒;尿沉淀
前列腺癌是一種常見的泌尿生殖系腫瘤。在美國,前列腺癌在危害男性健康的腫瘤中已經(jīng)位列首位[1],其在中國近年來的發(fā)病率也逐年上升[2]。但前列腺癌的早期診斷目前仍缺乏理想的腫瘤標記物,血清前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,PSA)、尿前列腺癌抗原3(prostatecancerantigen3,PCA3)雖已廣泛用于前列腺癌的篩查,但其敏感性和特異性并不理想[3-6]。磁性納米微粒是近年來快速發(fā)展且極具應用價值的新型材料[7-8]。利用偶聯(lián)特定探針的功能化磁性納米微粒,能快速高效富集尿液中的靶RNA片段,無需使用尿沉淀物,能減少檢測過程中的損失,可能會提高靶RNA例如PCA3檢測的敏感性。因此,本研究通過前瞻性的診斷試驗研究,探討磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測診斷前列腺癌的價值。
1材料與方法
1.1研究對象將2014年9月至2015年5月在我院泌尿外科行前列腺穿刺活檢的患者納入本項前瞻性的診斷試驗研究。納入研究的患者均有前列腺穿刺活檢的指征,包括以下幾項中的至少一項:直腸指檢陽性,PSA>10ng/mL,PSA4~10ng/mL且游離PSA/總PSA<0.16。入組方式采取連續(xù)性入組。因各種原因不愿納入研究的患者排除出研究。最終共有90例患者納入本研究。采集研究對象的病例信息包括年齡、血清PSA、病理診斷、Gleason評分、腫瘤分期等。
1.2診斷試驗
1.2.1磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測在前列腺穿刺活檢前,采集前列腺按摩(左右葉各3次)之后的初次排尿,量20~30mL,放入含有RNA穩(wěn)定劑的樣本收集管中混勻,-20 ℃保存。采用全程回流法制備磁性納米微粒[7]。從四氧化三鐵出發(fā),通過共聚自組裝技術將聚苯乙烯微、二氧化硅順次包被在超順磁性納米微粒表面,形成多層核殼結構的納米磁性聚合物微球,最后經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷表面改性后賦予其表面富含伯氨基的高分子層。該高分子層與oligoDT偶聯(lián),然后再與含polyA尾并與靶序列互補的捕獲探針結合,形成靶序列特異性的磁性納米微粒核酸提取體系。調節(jié)優(yōu)化磁珠表面的伯氨基含量,以達到最佳的核酸分離效果。檢測時先加入細胞裂解液,再加入偶聯(lián)了PCA3和PSA特定捕獲探針的磁性納米微粒,使PCA3和PSAmRNA結合到磁性納米微粒,外加磁場,吸棄上清液,漂洗液洗脫,完成PCA3和PSAmRNA富集。再采用iScriptcDNASynthesisKit(美國Bio-Rad公司)合成cDNA。最后進行實時熒光定量PCR,儀器采用ABI7500實時定量PCR儀(美國ABI公司),反應體系采用300nmol/L引物,200nmol/LTaqManMGB探針,2μLcDNA,10μLUniversalMasterMix(美國ABI公司),擴增40個循環(huán)。分別測定PCA3和PSAmRNA,采用2-△△CT法求RNA的相對表達程度,最后用PCA3/PSAmRNA×1 000得到尿PCA3分值。
1.2.2傳統(tǒng)尿沉淀法PCA3檢測獲得尿液標本后,4 ℃離心尿液10min,轉速2 500r/min,得到尿沉淀物。用pH值為7.0的冰磷酸鹽溶液沖洗尿沉淀物2遍,-80 ℃保存。尿液標本留取、逆轉錄cDNA合成和實時熒光定量PCR的方法同上。
1.3金標準和質量控制前列腺癌診斷的金標準定義為前列腺穿刺活檢的病理結果。所有前列腺穿刺活檢采取B超引導下經(jīng)直腸途徑,針數(shù)至少12針,并對可疑的前列腺結節(jié)加行穿刺。病理切片由兩位病理科醫(yī)師分別閱片,結果不一致時請第3位高年資醫(yī)師核片。尿PCA3測定和病理切片讀片分別由不同人員進行,互不知曉檢查結果。尿標本的獲取先于前列腺穿刺活檢,且間隔時間不超過1周。PCR測定采取三孔重復。
1.4統(tǒng)計分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。對年齡、PCA3分值、PSA等計量資料采用中位數(shù)和全距為統(tǒng)計量,采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U檢驗,比較前列腺癌和非前列腺癌患者的PCA3分值。描繪尿PCA3診斷前列腺癌的受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線,計算曲線下面積(areaundercurve,AUC)并比較兩種不同PCA3檢測方法診斷前列腺癌的價值。選取合適的臨界值,計算磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測診斷前列腺癌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和似然比。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
2結果
2.1臨床情況納入本研究的90例患者中,中位年齡74 (58~91) 歲,活檢前血清PSA的中位值13.9(3.1~521.2)ng/mL。活檢病理證實前列腺癌25例(27.8%),其余為良性前列腺增生64例(71.1%),高級別上皮內瘤1例(1.1%)。25例前列腺癌患者中,Gleason評分≤6分者8例(32.0%),7分者10例(40.0%),≥8分者7例(28.0%)。局限性前列腺癌10例(40.0%),局部進展性前列腺癌3例(12.0%),轉移性前列腺癌12例(48.0%)。
2.2前列腺癌和非前列腺癌患者PCA3分值的比較90例患者中,傳統(tǒng)尿沉淀法檢測有11例PCA3或/和PSA無擴增,磁性納米微粒介導法有2例無擴增。磁性納米微粒介導法測得的PCA3分值中位數(shù)為19.7(0.2~568.9):其中前列腺癌25例,PCA3分值中位數(shù)為60.4(0.3~568.9);非前列腺癌63例,PCA3分值中位數(shù)為9.3(0.2~179.9)。經(jīng)Mann-Whitney U檢驗,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,圖1)。傳統(tǒng)尿沉淀法檢測出的患者中,前列腺癌22例,非前列腺癌57例,兩組差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
圖1 前列腺癌和非前列腺癌患者尿PCA3分值的比較
2.3兩種尿PCA3檢測方法的比較圖2顯示了兩種尿PCA3檢測方法診斷前列腺癌的ROC曲線。磁性納米微粒介導法的AUC為0.934 (95%CI=0.881~0.986,P<0.001),傳統(tǒng)尿沉淀法的AUC為0.792(95%CI=0.668~0.915,P<0.001),前者的AUC較后者更高,說明磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測診斷準確性更高。而PSA診斷前列腺癌的AUC僅為0.613(95%CI=0.350~0.876),較兩種尿PCA3檢測方法均低,診斷價值不及尿PCA3檢測。通過亞組分析,對其中PSA4~10ng/mL的患者而言,磁性納米微粒介導法的AUC為0.832 (95%CI=0.736~0.928),傳統(tǒng)尿沉淀法的AUC為0.720(95%CI=0.602~0.838),兩者均有診斷前列腺癌的價值,但前者的準確性更高。
圖2 兩種尿PCA3檢測方法診斷前列腺癌的ROC曲線
2.4磁性納米微粒介導尿PCA3檢測的敏感度和特異度當PCA3分值的臨界點選擇為25時,其診斷前列腺癌的敏感度和特異度總體上較高,因此選為截點值。此時敏感度為77.3%,特異度為91.2%,陽性預測值為77.3%,陰性預測值為91.2%,似然比為34.0。此外,當臨界點為35時,敏感度和特異度分別為63.6%和93.0%,當臨界點為20時,敏感度和特異度分別為81.8%和82.5%。
2.5不同分級、分期前列腺癌患者尿PCA3分值的比較將25例前列腺癌患者按Gleason評分≤6分、7分和≥8分分為3組,分別比較磁性納米微粒介導法和傳統(tǒng)尿沉淀法測得的尿PCA3分值,經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗,發(fā)現(xiàn)不論采取何種方法檢測,3組差異均無統(tǒng)計學意義。再按疾病進展程度分為局限性、局部進展性和轉移性前列腺癌3組,同法行比較,3組差異亦無統(tǒng)計學意義。
3討論
前列腺癌近年來在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,早期診治前列腺癌顯得日益重要。目前血清PSA檢測被普遍用于前列腺癌的篩查,但其敏感性和特異性仍不理想,需要引進新的前列腺癌腫瘤標記物。隨著研究的深入,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些新的前列腺癌腫瘤標記物,如TMPRSS2:ERG融合基因[9]、[-2]proPSA[10]、長鏈非編碼RNA[11]和miRNA標記物[12]等,但大部分仍處于研究階段。
PCA3由于在前列腺癌組織中呈特異性高表達,因此適宜作為前列腺癌的特異性標記物。它是一種非編碼RNA,基因位于9號染色體短臂(9q21-22),包含4個外顯子,其中第4個外顯子有3個不同的節(jié)段可進行選擇性聚腺苷酸化。由于前列腺癌細胞脫落至尿液中會導致尿PCA3含量增高,因此可通過檢測尿PCA3含量來輔助診斷前列腺癌。通常采集前列腺按摩后的初次排尿,離心后通過RT-PCR檢測尿沉淀物中的PCA3。研究發(fā)現(xiàn)尿PCA3診斷前列腺癌的價值要優(yōu)于PSA,尤其是其特異性較高[4-6]。而且,對血清PSA在2.5~10ng/mL范圍且既往前列腺穿刺活檢陰性的患者,尿PCA3能預測再次前列腺活檢的結果[13]。但研究同時也發(fā)現(xiàn),尿PCA3檢測的敏感性較低,原因可能為PCA3容易降解,檢測前的離心沉淀也會損失一部分RNA,使得尿液中原本就微量的PCA3難以檢出。因此,需要通過其他方法提高尿液中PCA3的獲取率,比如磁性納米微粒。
磁性納米微粒是近年來得到快速發(fā)展的一種新型功能材料。微粒的結構一般由磁性內核及包裹在內核外的高分子殼構成,因此在施加外磁場的情況下,微粒在磁場中做定向運動,輔以微控制和檢測手段可以實現(xiàn)微粒的定位和介質的分離。同時,磁性納米微粒外殼高分子材料可以與核酸等物質結合,因此可以通過磁性納米微粒實現(xiàn)在反應介質中對特定核酸的識別檢測[7-8]。磁性納米微粒是性質優(yōu)良的載體,同時又具有分離功能,能夠大大簡化傳統(tǒng)復雜的生化實驗操作,提高檢測效率,因而在生物醫(yī)學領域得到應用。本研究采用的磁性納米微粒使用全程回流法制備,克服了制備過程的瓶頸即團聚現(xiàn)象,磁性納米微粒與oligoDT偶聯(lián),然后再與含polyA尾并與靶序列互補的捕獲探針結合,形成靶序列特異性的磁性納米微粒核酸提取體系,以此富集靶向核酸片段,能降低信噪比,提高檢測的敏感性。
本研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)尿沉淀法相比,磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測診斷準確性更高。磁性納米微粒介導法的AUC為0.934,傳統(tǒng)尿沉淀法的AUC為0.792,前者的AUC更高,提示診斷前列腺癌的準確性更高。通過使用基因特異性捕獲探針,能更高效富集尿中的PCA3和PSAmRNA,提取的RNA量更高,提高了尿PCA3檢測的靈敏度。研究報道,傳統(tǒng)尿沉淀法測得的PCA3,最佳臨界點時診斷前列腺癌的敏感度為62.9%,特異度為90.6%[14]。而本研究中最佳臨界點時的敏感度和特異度分別為77.3%和91.2%,特異度相近,但敏感度提高了近15%,提示功能化磁性納米微粒介導法的診斷準確性更高,關鍵在于提高了檢測的敏感度。但本研究為初步研究,研究病例數(shù)有限、病例來源于單中心是本研究的不足之處,有待臨床進一步驗證。
綜上所述,功能化磁性納米微粒介導的尿PCA3檢測,能提高檢測的敏感性,進一步增加了尿PCA3診斷前列腺癌的準確性,可用于前列腺癌的早期診斷和篩查,從而減少前列腺癌的漏診和不必要的前列腺穿刺活檢。
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(編輯何宏靈)
收稿日期:2015-11-18修回日期:2015-12-26
基金項目:上海市醫(yī)學重點??苹?No.ZK2012A22);上海市科委自然科學基金(No.14ZR1432900);上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年科研項目(No.20124y197);閔行區(qū)自然科學研究課題(No.2011MHZ36)
通訊作者:施國偉,主任醫(yī)師.E-mail:dr.sgw@189.cn
作者簡介:王偉(1979-),男(漢族),碩士,副主任醫(yī)師.研究方向:泌尿系腫瘤與結石.E-mail:ericwang79@126.com
中圖分類號:R737.25
文獻標志碼:A
DOI:10.3969/j.issn.1009-8291.2016.04.006
Diagnostic accuracy of urinary PCA3 test by magnetic nanoparticle mediated approach for prostate cancer
WANG Wei1, PENG Rui-xian1, HE Lin-fu2, LE Biao2, QU Xiang-yun2, SHI Guo-wei1, HE Jia-yang1
(1.DepartmentofUrology,FifthPeople’sHospitalofShanghai,FudanInstituteofUrology,CenterforEvidence-basedMedicine,FudanUniversity,Shanghai200240; 2.ShanghaiDowellMedicalTechnologyCo.Ltd,Shanghai201507,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the diagnostic accuracy of urinary prostate cancer antigen 3 (PCA3) test by magnetic nanoparticle mediated approach for prostate cancer. MethodsAltogether 90 patients who received prostate biopsy in our department during Sept. 2014 and May 2015 were enrolled in this prospective study. All patients had indications of prostate biopsy due to elevated prostate specific antigen or abnormal results of digital rectal examination. The index tests were urinary PCA3 tests, either by magnetic nanoparticle mediated approach or urinary sediment approach. The gold standard of diagnosis for prostate cancer was prostate biopsy. The receiver operating characteristic curves of PCA3 were drawn and area under curve (AUC) was calculated to compare the diagnostic accuracy of the two different approaches. Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and likelihood ratio were calculated. ResultsAmong the 90 cases, 25 were diagnosed as prostate cancer. The AUC obtained by the magnetic nanoparticle mediated approach was 0.934 (95%CI, 0.881~0.986, P<0.001), higher than that by the traditional sediment approach, which was 0.792 (95%CI, 0.668~0.915,P<0.001). For nanoparticle mediated approach, when the cutoff value of PCA3 score was 25, the sensitivity was 77.3%, and the specificity was 91.2% for the diagnosis of prostate cancer. ConclusionThe diagnostic accuracy of urinary PCA3 test by magnetic nanoparticle mediated approach is superior to that by urinary sediment approach.
KEY WORDS:prostate neoplasm; diagnostic accuracy test; prostate cancer antigen 3; magnetic nanoparticle; urinary sediment