金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

魯湘鄂　吳清和

1.廣東藥科大學(xué)，廣東　廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東　廣州　510006

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金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

魯湘鄂1吳清和2

1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006

【摘要】目的：觀察金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA和蛋白表達(dá)的影響。方法：以多尿自然衰老大鼠為“腎虛多尿”模型，給予金匱腎氣丸4周，采用酶消化和組織塊相結(jié)合的方法原代培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Westernblotting法觀察金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R mRNA和蛋白的表達(dá)；與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-AR mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-ARmRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論：金匱腎氣丸可以減少自然衰老大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞M3RmRNA及其蛋白的表達(dá)和增加自然衰老大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞β3-ARmRNA及其蛋白的表達(dá)，使M3R和β3-AR之間的平衡狀態(tài)維持正常的水平。

【關(guān)鍵詞】金匱腎氣丸；自然衰老大鼠；M3R；β3-AR

金匱腎氣丸由地黃、茯苓、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、桂枝、牛膝、車前子、附子等藥材組成，具有溫補(bǔ)腎陽、化氣行水的功效，用于腎虛水腫、腰膝酸軟、小便不利、畏寒肢冷。膀胱的生理功能是貯存和排尿，尿液在膀胱內(nèi)貯存到一定限度時(shí)，即可及時(shí)自主地排出體外[1]。β3受體直接介導(dǎo)逼尿肌松弛，M3受體直接參與了逼尿肌收縮。膀胱逼尿肌的舒張和收縮功能異?？芍苯訉?dǎo)致下尿路功能癥狀的出現(xiàn)，其發(fā)病率隨年齡增加而上升[2]。研究在自然衰老大鼠模型上觀察M3R、β3-AR mRNA及其蛋白的表達(dá)變化及金匱腎氣丸對其的影響，以揭示金匱腎氣丸影響尿功能的分子機(jī)制。

1儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物SD自然衰老大鼠(15月齡)，SPF級，雌雄各25只，雌鼠體重320～400g，雄鼠體重440～520g；SD大鼠(3月齡)，SPF級，雌雄各5只，雌鼠體重160～180g，雄鼠體重200～220g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0020，合格證號：0089418，0086829，0086847。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物金匱腎氣丸(批號：0030377，北京同仁堂科技股份有限公司)，參照Bios氏原法折算大鼠用藥劑量，以臨床用量折算等效劑量為中劑量，低、中、高劑量分別為0.54、1.08、2.16g/(kg·d)。縮泉膠囊(批號：100302，湖南漢森制藥有限公司)，以臨床用量折算等效劑量為中劑量，為 0.585 g/(kg·d)。

1.3儀器TL-4顯微鏡(Olympus公司)；ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀(愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)；電泳裝置和轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad)；IB高速低溫離心機(jī)(德國eppendorf公司)；AS圖像分析系統(tǒng)(德國Kontron elekronik公司)；核酸蛋白分子儀(德國Beckman公司)；脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；JA1203N型電子天平(上海精密儀器有限公司)。

1.4主要試劑DMEM、雙抗、胎牛血清、Ⅳ膠原酶、胰酶均為美國GIBCO公司產(chǎn)品； D-hank、PBS均為上海吉諾生物公司產(chǎn)品；總RNA抽提試劑Trizol(美國MRC公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑cDNA試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、細(xì)胞裂解液、PrestainTM蛋白質(zhì)預(yù)染Markers均為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品；M3R、β3-AR、GAPDH引物由上海生工生物有限公司提供；BCA蛋白定量試劑盒、SDS、考馬斯亮藍(lán)R250均為廣州美津生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE Tricine蛋白上樣緩沖液均為武漢博士德公司產(chǎn)品；DEPC、甘氨酸、Tris、甘油、溴酚藍(lán)、Tween-20均為美國Amresco公司產(chǎn)品；脫脂奶粉(廣州斯佳生物科技有限公司)；Rabbit Anti-PKA抗體(美國upstate公司)；H-89、Goat anti-Rabbit IgG(H+L)HRP、immobilonTM western、Immobilon-P PVDF膜均為美國millipore公司產(chǎn)品；β-actin抗體(美國santa公司)。

2方法

2.1動物分組與給藥取篩選合格的自然衰老大鼠(15月齡)50只，青年大鼠(3月齡)10只，雌雄各半。設(shè)置組別為：正常對照組10只，模型對照組、縮泉膠囊組、金匱腎氣丸高、中、低劑量組 10只/組。縮泉膠囊組、金匱腎氣丸高、中、低劑量組分別按1ml/100g連續(xù)灌胃給藥4周，正常對照組和模型對照組給予等量的生理鹽水。

2.2原代逼尿肌細(xì)胞的培養(yǎng)[3]取SD大鼠，斷頭處死，75%酒精滅菌消毒，無菌條件下取膀胱，放入有PBS和雙抗的培養(yǎng)皿中，于顯微鏡下剔除粘膜及結(jié)締組織，漂洗2次；取400UL的D-hanks液，放入1.5ml的無菌eppendorf管中，將無菌的膀胱放入EP管中，剪成1mm3左右碎塊，1500r離心3min，重復(fù)2次，棄上清液；加1mL0.1%Ⅳ型膠原酶，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h；取出，強(qiáng)力吹打，1500r離心3min，棄上清夜，加入1ml DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞和組織，1500r離心3min，重復(fù)3次，棄上清夜，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞和組織；將培養(yǎng)瓶置于37℃，95%O2和5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱中，3～5d換液一次；細(xì)胞覆蓋大部分表面以后傳代，吸棄舊培養(yǎng)液，沿培養(yǎng)瓶細(xì)胞面對側(cè)加入PBS，清洗細(xì)胞，倒掉PBS，向瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶，輕輕搖動使消化液流遍所有細(xì)胞表面，消化15～30s后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，可發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大；倒掉消化液，加少許培養(yǎng)液終止消化，彎頭吸管反復(fù)輕柔吹打瓶底細(xì)胞后，分裝接種。5天后可再傳代。

2.3逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA表達(dá)取1×107逼尿肌細(xì)胞，PBS漂洗兩遍，按照試劑盒說明書，Trizol法提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物采用Primer Express3.0 軟件設(shè)計(jì)3對引物。引物M3R-F：cggttccactacctacatcattatgaaccg，M3R-R：gacagcgaccgtacttcctcct，擴(kuò)增片段為566 bp；β3-AR-F： atcgagaccctgtgcgccct，β3-AR-R：Tgggtgtcccgactgtggca t，擴(kuò)增片段為427bp。選擇GAPDH為內(nèi)參照，擴(kuò)增片段為273bp。擴(kuò)增程序：預(yù)處理(50℃，2min)，預(yù)變性(95℃，10min)，以上兩步一個循環(huán)。變性(95℃，15s)，退火(60℃，30s)及延伸(72℃，30s)，以上三步為一個循環(huán)，如此進(jìn)行40個循環(huán)。采用7500 system software分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因的Ct值。

2.4逼尿肌細(xì)胞M3R，β3-AR 蛋白表達(dá)取1×107逼尿肌細(xì)胞，PBS漂洗兩遍，棄去，加入300μl蛋白裂解液，輕輕吹打，裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液于1.5ml eppendorf管中，4℃ 14000g離心15min。取上清液可分裝-20℃保存?zhèn)溆?。取上清，過夜轉(zhuǎn)膜后，在搖床上室溫封閉2h，PVDF膜置于新鮮配制的含一抗或內(nèi)參一抗的封閉液孵育 1h，TBST 洗膜3次，加入二抗孵育1h，TBST 洗膜3次，將化學(xué)發(fā)光試劑加于膜上，成像系統(tǒng)下進(jìn)行曝光，使用圖像分析軟件對條帶灰度分析，計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為半定量結(jié)果。

3結(jié)果

3.1金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR mRNA的影響與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R mRNA的表達(dá)明顯增加；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R mRNA的表達(dá)。與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-AR mRNA表達(dá)明顯降低；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-AR mRNA的表達(dá)。見表1。

表1　金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-ARmRNA表達(dá)的影響

注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R、β3-AR 蛋白表達(dá)的影響與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R蛋白表達(dá)明顯增加；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R 蛋白的表達(dá)。與正常對照組比較，自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-AR蛋白表達(dá)明顯降低；與模型對照組比較，金匱腎氣丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞β3-AR mRNA的表達(dá)。見表2，圖1。

表2　金匱腎氣丸對自然衰老大鼠逼尿肌細(xì)胞M3R，β3-AR 蛋白表達(dá)的影響

注：與正常對照組比較，ΔP<0.05。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4討論

與排尿活動相關(guān)的受體：腎上腺素能受體分為α-受體和β-受體，膽堿能受體。α-受體主要分布于膀胱底部、頸部和后尿道平滑肌，其受刺激引起膀胱頸和后尿道收縮，阻止尿液排出。β-受體主要分布于膀胱體部平滑肌，受刺激后使膀胱弛張，便于尿液貯存，且以β3-AR為主。膽堿能受體分布于整個膀胱及后尿道，受到刺激后增加膀胱逼尿肌收縮力，促使排尿，且以M3受體為主。Nishimoto[4]等報(bào)道老年大鼠膀胱β-AR的密度隨年齡增加而逐漸降低，說明β-AR可能與老齡膀胱功能障礙有關(guān)。Kolta[5]等報(bào)道自然衰老大鼠M3R mRNA的表達(dá)隨著年齡的增加而增加，膀胱儲存尿液容量減少，導(dǎo)致尿液不自主的排泄，產(chǎn)生多尿、尿頻等癥狀。金匱腎氣丸顯著增加了自然衰老大鼠膀胱逼尿肌上β3-AR mRNA及其蛋白的表達(dá)，抑制自然衰老大鼠膀胱逼尿肌中M3R mRNA及其蛋白的表達(dá)，可以有效地舒張膀胱逼尿肌，增加膀胱的有效容量，從而減少尿量的排出。自然衰老大鼠M3R的增加能夠抑制β3-AR產(chǎn)生一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，即M3R的上調(diào)削弱了β3-AR的舒張效應(yīng)，導(dǎo)致M3R功能相對亢進(jìn)，逼尿肌不自主的收縮，引起老年大鼠多尿。因此M3受體和β3-AR受體之間的平衡狀態(tài)對于維持正常的膀胱功能極為重要。

本研究從分子水平說明自然衰老大鼠多尿可能與膀胱逼尿肌細(xì)胞M3R的增加和β3-AR的減少有關(guān)，而金匱腎氣丸可以減少自然衰老大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞M3R mR NA及其蛋白的表達(dá)和增加自然衰老大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞β3-AR mRNA及其蛋白的表達(dá)，使M3R和β3-AR之間的平衡狀態(tài)維持正常的水平，恢復(fù)膀胱的貯尿和排尿兩個重要的生理功能。

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[5]Kolta MG,Wallace LJ,Gerald MC.Age-related changes in sensitivity of rat urinary bladder to autonomic agents[J].Mech Ageing Dev,1984,27(2):183-188.

基金項(xiàng)目：廣東省科學(xué)技術(shù)廳-廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合科研項(xiàng)目(2014A020221056)。

作者簡介：魯湘鄂(1979-)，女，湖北枝江人，博士，主要從事中藥新藥的篩選與藥理研究。E-mail；lxe_0710@sina.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)12-0050-03

(收稿日期：2016.04.25)

Impacts of Jinkui Shenqi pill on Expression of M3R and β3-AR mRNA andcorresponding proteins in the Bladder detrusor cells of Natural aging rat

LU XiangeWU Qinghe

1.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China

Abstract:Objective To observe the impacts of “Jinkui Shenqi pill” on the expression of M3R and β3-AR mRNA and corresponding proteins in the Bladder detrusor cells of Natural aging rat. Methods Natural aging rats were used as “kidney deficiency and urinary” model, then were treated with “Jinkui Shenqi pill”. for 4 weeks and Detrusor cells were cultured by the combination of Enzyme digestion and tissue.The expression of M3R and β3-AR mRNA in the bladder detrusor cells by realtime fluorescence quantitative PCR method was investigated. The expression of M3R and β3-AR proteins in the bladder detrusor cells by Westernblotting was investigated.Results In model rats, the expression of M3R mRNA and corresponding proteins increased and the expression of β3-ARmRNA and corresponding proteins decreased in the Bladder detrusor cells. “Jinkui Shenqi pill” could decreased the expression of M3R mRNA and corresponding proteins,increased the expression of β3-AR mRNA and corresponding proteins in the bladder detrusor cells of Natural aging rat.Conclusion Jinkui Shenqi pill”could make M3R mRNA and corresponding proteins expression of detrusor cells of the natural aging rats decreased,and β3-AR mRNA and corresponding proteins expression of detrusor cells of the natural aging rats increased.

Key words:Jinkui Shenqi pill; natural aging rat ; M3R；β3-AR