土家族麝針療法對(duì)缺血性腦中風(fēng)大鼠的腦保護(hù)作用機(jī)制研究

涂　星　張　燕　向　陽　田春漫　張　棋　郜紅利

1.湖北民族學(xué)院，湖北　恩施　445000；2.浙江科技學(xué)院，浙江　杭州　310002

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土家族麝針療法對(duì)缺血性腦中風(fēng)大鼠的腦保護(hù)作用機(jī)制研究

涂星1張燕1向陽1田春漫1張棋2郜紅利1

1.湖北民族學(xué)院，湖北恩施445000；2.浙江科技學(xué)院，浙江杭州310002

【摘要】目的：觀察土家族麝針療法對(duì)缺血性腦中風(fēng)大鼠的腦保護(hù)作用，并初步探其作用機(jī)制。方法：以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、天然麝香麝針組和人工麝香麝針組。采用線栓法制備大鼠腦缺血性中風(fēng)模型，按照Zea-longa5級(jí)評(píng)分法選取造模成功的大鼠，分別給予相應(yīng)治療措施。采用Garcia復(fù)合評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能；采用全自動(dòng)血液流變學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠全血粘度、血小板最大聚集率、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間；采用Elisa法測(cè)定血清中細(xì)胞因子IFN-β和TNF-α的含量；SP法測(cè)定腦組織中NF-κB p65的表達(dá)情況。結(jié)果：采用線栓法建立的缺血性腦中風(fēng)大鼠Garcia神經(jīng)功能評(píng)分、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間顯著下降，全血粘度、血小板最大聚集率、TNF-α的含量和NF-ΚB p65陽性細(xì)胞表達(dá)顯著升高(P<0.05)；采用土家麝針療法治療后，其神經(jīng)功能評(píng)分、凝血酶原時(shí)間、干擾素-β的含量顯著升高，全血粘度、血小板最大聚集率、TNF-α的含量和NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)顯著降低(P<0.05)，對(duì)凝血酶時(shí)間無顯著影響；天然麝香與人工麝香所制備的麝針療法對(duì)上述指標(biāo)的影響無顯著差異，但前者恢復(fù)神經(jīng)功能起效迅速，持續(xù)作用效果更明顯。結(jié)論：線栓法所致缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)功能損傷可能與血黏度和血小板最大聚集率增加、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的縮短、血清中細(xì)胞因子TNF-α含量的升高及腦組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)增加有關(guān)。土家麝針療法可顯著改善缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)功能，其機(jī)理可能與改善其血液流變學(xué)特征，降低促炎因子TNF-α釋放而增加神經(jīng)保護(hù)因子干擾素-β的釋放、降低腦組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。人工麝香可替代天然麝香作為麝針療法的藥物來源。

【關(guān)鍵詞】土家麝針療法；缺血性腦中風(fēng)；血液流變學(xué)；腫瘤壞死因子-α；干擾素-β；核轉(zhuǎn)錄因子 P65

麝針療法是土家族民間流傳甚久的一種常用治療方法，對(duì)膿皰、癤腫、疔瘡、關(guān)節(jié)扭傷所致腫脹瘀血疼痛、急癥暴癥、傷寒頭痛等均有較好的療效。麝針是用香獐子的門牙制成，抓捕時(shí)扣掉牙(長約5～8cm，呈半圓形，根部稍大，前端尖銳，齒內(nèi)有骨髓填滿)，挑出骨髓，從根部放入麝香，然后將根部扎緊，封閉，將前端磨銳，即得[1]。田琨等[2]采用頭皮麝針治療中風(fēng)病30例，發(fā)現(xiàn)完全恢復(fù)16例，顯效10例，好轉(zhuǎn)3例，總有效率為96.6%。

香獐子又名原麝，主要分布與人跡罕至的針闊混交林帶，香獐子屬于國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，使得土家族麝針療法的發(fā)展受到了極大的限制。研究采用自制麝針替代傳統(tǒng)土家族麝針，探討土家族麝針療法對(duì)線栓法所致腦缺血中風(fēng)模型大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制，促進(jìn)土家族醫(yī)藥的發(fā)展。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠70只，5～7周齡，體重(200±20)g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0001。

1.1.2藥品和試劑天然麝香(湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自存，經(jīng)湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院朱敏英副教授鑒定為麝科動(dòng)物雄性林麝Moschus berezovskii Flerov位于肚臍和生殖器之間的腺體中的干燥分泌物)；人工麝香(純麝香粉，批號(hào)：20141025，安徽亳州國藥中藥草堂)；水合氯醛(CP，批號(hào)：150307，廣州化學(xué)試劑廠)；兔抗大鼠多克隆核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB p65)(一抗測(cè)定試劑盒，批號(hào)：BA0610，武漢博士德生物試劑公司；二抗測(cè)定試劑盒，批號(hào)：501101，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TNF-α ELISA 試劑盒(批號(hào)：E013116，美國eBioscience公司)；IFN-β(美國eBioscience公司)等。1.1.3儀器一次性注射針頭(5號(hào)，0.5mm外徑，針頭長度2cm)；全自動(dòng)血液流變學(xué)檢測(cè)儀(天津市冠嘉醫(yī)療設(shè)備有限公司)；BX41 數(shù)碼顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(北京長安科學(xué)儀器廠)；LEICA300脫水機(jī)、LEICA RM2235切片機(jī)、LEICA EG1150石蠟包埋機(jī)(德國徠卡公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；L420臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；低速高溫離心機(jī)(美國Thermo Electron公司)；酶標(biāo)定量測(cè)定儀(德國Thermo公司)；超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

1.2方法1.2.1腦缺血中風(fēng)模型大鼠的制備和評(píng)價(jià)參考文獻(xiàn)[3-4]制備尼龍線：取直徑為0.25mm的尼龍線，剪成50mm長的小段，在線的一端用酒精燈燒成光滑的圓球，并在距球端18.0mm處用紅色記號(hào)筆標(biāo)記，備用。用前以消毒酒精擦拭。

取SD大鼠，隨機(jī)分為模型組(n=60)和假手術(shù)組(n=10)。參考文獻(xiàn)[5-6]，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠腦缺血中風(fēng)模型。用10%水合氯醛0.30g/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸前正中縱形切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，分離出左側(cè)總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，在CCA近心端和遠(yuǎn)心端及ICA掛上手術(shù)線備用，微動(dòng)脈夾夾住ICA，然后在近心端用手術(shù)線結(jié)扎CCA、ICA。在ECA距離ICA分叉處2～3mm處用小剪刀剪開一小口，將上述尼龍線插入ECA 并進(jìn)入CCA，輕扎備線，防止出血，剪斷ECA，松開ICA 的動(dòng)脈夾，牽引ECA，使其和ICA 約成一直線，輕輕回抽尼龍線，使其順入ICA，繼續(xù)向下推進(jìn)約18 mm。松開CCA 動(dòng)脈夾，扎緊備線，外留1 cm 長線頭，縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠同法分離動(dòng)脈后不進(jìn)行線栓栓塞，縫合肌肉和皮膚。

按照Zea-Longa5級(jí)評(píng)分法[7-8]對(duì)造模大鼠進(jìn)行評(píng)分：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈，成追尾狀；3分，爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自然行走，意識(shí)喪失。1～4分大鼠為成功的腦缺血中風(fēng)模型大鼠，選取評(píng)分為1～3分的大鼠開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2麝針的制備和鑒定[2,9]分別稱取天然麝香和人工麝香各10g，溶于100ml 95%乙醇溶液中，待完全溶解呈淡黃棕色溶液后，將5號(hào)一次性注射針頭浸泡入內(nèi)1周。隨機(jī)抽取3～5根針頭，置于載玻片上，滴加10%水合氯醛2滴，10min后顯微鏡下(10×40倍)觀察。

1.2.3頭皮麝針的干預(yù)和治療取Zea-Longa評(píng)分1～3分的模型大鼠，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、天然麝香麝針組和人工麝香麝針組。各組大鼠以俯臥位固定，選取其對(duì)側(cè)頭皮的運(yùn)動(dòng)區(qū)、感覺區(qū)和足運(yùn)感區(qū)。采用自制麝針進(jìn)針，針應(yīng)刺在肌層，以200次/min以上的速度快速捻針，至針刺區(qū)微感發(fā)熱。捻轉(zhuǎn)5min后，留針5min，反復(fù)捻針留針3次后起針，每日進(jìn)行2次，5天為一個(gè)療程，每療程間休息2天，治療3個(gè)療程。

1.2.4療效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究

1.2.4.1神經(jīng)功能評(píng)價(jià)采用Garcia 18分的復(fù)合評(píng)分法[10-11]，在治療前、1、2、3療程結(jié)束后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定，由兩名實(shí)驗(yàn)人員在不知分組情況下進(jìn)行評(píng)價(jià)，取平均值。

表1　Garcia大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4.2血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分別于治療前、1、2、3療程結(jié)束后2h，隨機(jī)抽取各組大鼠6只，頸動(dòng)脈取血(取血大鼠依然存活)，置于盛有肝素鈉的試管中，采用全自動(dòng)血液流變學(xué)檢測(cè)儀按照操作規(guī)程檢測(cè)其切變率為150s-1時(shí)的全血粘度(WBV)、血小板最大聚集率(PMAR)、凝血酶時(shí)間(TT)和凝血酶原時(shí)間(PT)。

1.2.4.3血清細(xì)胞因子IFN-β和TNF-α的含量檢測(cè)分別于治療前和治療3療程結(jié)束后2h，隨機(jī)抽取各組大鼠6只，頸動(dòng)脈取血，置于離心管中，37℃靜置待其凝固后，3000rpm離心10min，取上清液，即得血清，-80℃保存。采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中IL-2和IL-4的含量。取凍存的血清，4℃下融化，待測(cè)；在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50μl，待測(cè)樣品孔加入血清樣本50μl，再分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體100μl，封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫孵育1h，棄去液體，吸水自拍干后加入洗液靜置1min，甩去水液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次；另設(shè)空白孔不予處理作為對(duì)照。所有孔加入底物A、B各50μl，37℃恒溫避光孵育15min。所有孔加入終止液50μl，15min內(nèi)，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。1.2.4.4NF-κB p65的表達(dá)情況取頸動(dòng)脈取血的大鼠，10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，向左心室注射冷0.9%生理鹽水，觀察到大鼠眼球和肺逐漸變白，且右心耳流出無色液體時(shí)，改為灌注pH7.4的4%多聚甲醛緩沖液，固定，立即斷頭取腦。將大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟切片，HE染色，采用SP法按照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。在40倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，精確計(jì)數(shù)單位面積(1個(gè)40倍視野)內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)量。NF-κB p65的陽性表達(dá)細(xì)胞存在于細(xì)胞核或胞漿中，呈棕黃色。另取健康無任何操作大鼠作為空白對(duì)照。

2結(jié)果

2.1土家族麝針的制備和評(píng)價(jià)在400倍顯微鏡下可見，本實(shí)驗(yàn)所制備的天然麝香麝針的針頭表面附著有棕黃色長方形或方形結(jié)晶和油滴，人工麝香麝針的針頭表面無明顯的結(jié)晶。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致。2.2腦缺血中風(fēng)大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)結(jié)果造模時(shí)左側(cè)總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的分離方法見圖1-A。造模結(jié)束后，Zea longa評(píng)分1～3分的模型大鼠共計(jì)有48只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、天然麝香麝針組和人工麝香麝針組各16只。大多數(shù)大鼠出現(xiàn)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈，成追尾狀或爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒的現(xiàn)象(圖1-B)，提尾懸空時(shí)出現(xiàn)右側(cè)上肢的屈曲(圖1-C)。

2.3神經(jīng)功能評(píng)價(jià)由表2可見，腦缺血中風(fēng)模型大鼠Garcia神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，表明其神經(jīng)功能受損，且隨著時(shí)間的延長評(píng)分逐漸降低(P<0.05)；采取土家麝針療法2～3個(gè)療程后，其神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)，且天然麝香與人工麝香所制備的麝針療法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

從療程看，土家麝針療法起效時(shí)間在接受治療2個(gè)療程后(P<0.05)，人工麝香麝針組治療2個(gè)療程和3個(gè)療程對(duì)神經(jīng)功能的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而天然麝香麝針組治療3個(gè)療程后其神經(jīng)功能的改善效果較2個(gè)療程更為顯著。

表2　土家族麝針療法對(duì)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分的影響　(分，±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與天然麝香麝針組比較，cP<0.05；與治療前比較，▲P<0.05；與1療程比較，★P<0.05；與2療程比較，●P<0.05。

2.4血液流變學(xué)檢測(cè)結(jié)果由表3、表4可見，治療前各治療組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)與模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明結(jié)果有可比性；頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法所致腦缺血中風(fēng)模型大鼠的全血粘度和血小板最大聚集率顯著升高(P<0.05)，而凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間顯著下降(P<0.05)，提示腦缺血中風(fēng)的發(fā)生機(jī)制可能與血液流變學(xué)密切相關(guān)；給予土家族麝針療法治療后，兩組大鼠的全血粘度和血小板最大聚集率顯著降低(P<0.05)，而凝血酶原時(shí)間顯著升高(P<0.05)，且顯著高于正常水平(P<0.05)，對(duì)凝血酶時(shí)間無顯著影響(P>0.05)；天然麝香麝針組和人工麝香麝針組在對(duì)全血粘度、血小板最大聚集率和凝血酶原時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3　土家族麝針療法對(duì)各組大鼠全血粘度和血小板最大聚集率的影響　±s,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與天然麝香麝針組比較，cP<0.05；與治療前比較，▲P<0.05。

表4　土家族麝針療法對(duì)各組大鼠凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的影響　±s,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與天然麝香麝針組比較，cP<0.05；與治療前比較，▲P<0.05。

2.5血清細(xì)胞因子IFN-β和TNF-α的含量檢測(cè)結(jié)果由表5可見，模型對(duì)照組與假手術(shù)組干擾素-β的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，天然麝香麝針組和人工麝香麝針組干擾素-β的含量均顯著升高(P<0.05)，且兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而模型對(duì)照組TNF-α的含量顯著升高(P>0.05)，給予天然麝香麝針和人工麝香麝針治療后，其含量顯著降低(P<0.05)，且兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5　土家族麝針療法對(duì)各組大鼠血清中IFN-β和TNF-α含量的影響　±s,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與天然麝香麝針組比較，cP<0.05；與治療前比較，▲P<0.05

2.6NF-κB p65的表達(dá)結(jié)果由表6、圖3可見，各組均可見NF-κB p65陽性細(xì)胞，假手術(shù)組較空白組明顯增多(P<0.05)，3療程后其表達(dá)顯著降低(P<0.05)，與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示單純的分離頸動(dòng)脈和縫合操作也能導(dǎo)致腦組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)增加，但隨著傷口愈合而恢復(fù)正常；與空白對(duì)照組比較，造模后NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增高(P<0.05)，提示腦組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)增加可能是腦缺血中風(fēng)的重要發(fā)病機(jī)制之一；經(jīng)給予土家族麝針療法后，天然麝香麝針組和人工麝香麝針組NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均顯著下降(P<0.05)，且兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示土家麝針療法能下調(diào)腦缺血中風(fēng)所致腦組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)，且天然麝香和人工麝香的療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6土家族麝針療法對(duì)各組大鼠腦組織NF-κBp65陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)的影響

組別NF-κBp65陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)治療前3療程后假手術(shù)組24.56±6.28d12.33±4.19▲模型對(duì)照組72.67±12.19ad75.91±5.84da天然麝香麝針組69.89±10.27ad25.27±12.33ab▲人工麝香麝針組74.97±8.67a29.16±13.03ab▲空白對(duì)照組9.33±1.679.18±2.15

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與天然麝香麝針組比較，cP<0.05；與空白對(duì)照組比較，dP<0.05；與治療前比較，▲P<0.05。

3討論

腦缺血性中風(fēng)是由于某腦動(dòng)脈供血區(qū)的血流因栓塞或血栓而暫時(shí)或永久地減少所致，其病理過程涉及復(fù)雜的時(shí)間和空間級(jí)聯(lián)反應(yīng)，屬于中醫(yī)“中風(fēng)”、“卒中”、“偏枯”范疇，占中風(fēng)患者的80%，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等危害，是中老年人的常見病、多發(fā)病之一[12]。其病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，氣血陰陽虛衰，在風(fēng)、火、痰、瘀的影響下而發(fā)病，其病變的主要原因是氣虛血瘀，臨床研究發(fā)現(xiàn)中風(fēng)患者的血液多處于粘、濃、凝、聚的病理狀態(tài)，全血粘度、紅細(xì)胞壓積、血小板最大聚集率顯著增加而凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間顯著下降[13-14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，土家族麝針療法可以顯著改善腦缺血性中風(fēng)大鼠的全血粘度，抑制血小板最大聚集率，增加凝血酶原時(shí)間，有效防止缺血腦組織的進(jìn)一步損害，且采用天然麝香或者人工麝香制作的土家族麝針在療效上無顯著差異。

國際腦卒中治療臨床前研究指南(STAIR)指出，在腦缺血藥物研究中，多重指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)很重要，組織學(xué)和行為學(xué)的結(jié)果都應(yīng)評(píng)價(jià)。國內(nèi)主要采用Zea-Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，一定程度上反映了神經(jīng)功能的損傷，但該種方法只關(guān)注了運(yùn)動(dòng)功能和所造模型損傷癥狀，不能全面、細(xì)致的反應(yīng)腦缺血性中風(fēng)的神經(jīng)功能損傷[15]。Garcia JH評(píng)分詳細(xì)評(píng)價(jià)了腦缺血性中風(fēng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能和感覺功能的損傷，建立了較為完整的評(píng)分方法[16,10]。研究中采用Zea-Longa評(píng)分作為神經(jīng)功能損傷的判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用Garcia評(píng)分作為神經(jīng)功能損傷程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用線栓法制備的腦缺血性中風(fēng)模型大鼠不同程度的存在神經(jīng)功能缺損，土家族麝針療法治療能顯著改善其病理狀態(tài)，且天然麝香麝針組的長期療效更佳。

腦缺血后炎性介質(zhì)大量表達(dá)是缺血中心區(qū)和周圍區(qū)神經(jīng)元損傷的重要因素之一。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的過度表達(dá)可加重神經(jīng)功能損傷，擴(kuò)大腦梗死范圍，導(dǎo)致缺血腦組織血流量減少，從而加重血腦屏障的損害，促進(jìn)腦缺血和水腫的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡；干擾素-β(IFN-β)具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，能保護(hù)正常細(xì)胞免受NK細(xì)胞的殺傷，在短暫缺血性中風(fēng)后具有神經(jīng)保護(hù)功能[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，線栓法所致腦缺血性中風(fēng)模型大鼠的腦組織中TNF-α的含量顯著增加，而IFN-β的含量無明顯變化；采用土家麝針療法進(jìn)行干預(yù)治療后，IFN-β的含量顯著增加，而TNF-α的含量顯著降低，且天然麝香麝針組和人工麝香麝針組的治療效果無顯著差異，表明土家麝針療法治療腦缺血中風(fēng)的作用機(jī)制可能是通過上調(diào)IFN-β的表達(dá)、下調(diào)TNF-α的表達(dá)，減少神經(jīng)功能的損傷，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力，改善腦區(qū)血流量。

核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種細(xì)胞中，能與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促使基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，其中p65(RelA)是NF-κB 家族中的一個(gè)重要亞基。在腦缺血損傷時(shí)，NF-κB可被細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)、氧自由基、鈣超載等因素刺激而活化，活化的NF-κB又可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、粘附因子、免疫受體、炎性酶類的表達(dá)及氧自由基形成等，從而加劇腦缺血后繼發(fā)炎性腦損傷[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，線栓法所致腦缺血中風(fēng)模型大鼠腦組織中NF-κB p65的陽性表達(dá)顯著增加，經(jīng)土家族麝針療法干預(yù)和治療后，其陽性表達(dá)量顯著降低，且天然麝香麝針組和人工麝香麝針組之間無顯著差異。

總之，土家族麝針療法對(duì)腦缺血性中風(fēng)具有較好的腦保護(hù)作用，尤其對(duì)其所致的腦神經(jīng)功能損傷具有較好的保護(hù)和恢復(fù)作用，其作用機(jī)理可能與降低全血粘度、抑制血小板最大聚集率、增加凝血酶原時(shí)間、上調(diào)IFN-β的表達(dá)、下調(diào)TNF-α的表達(dá)、抑制NF-κB p65細(xì)胞陽性表達(dá)等有關(guān)。天然麝香制備的麝針雖然在改善凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間上具有一定的優(yōu)勢(shì)，但其他指標(biāo)均無顯著差異，提示可采用人工麝香作為替代品，達(dá)到臨床效果相同而減小治療成本的目的。但土家麝針療法治療腦缺血中風(fēng)發(fā)揮作用的是針灸還是麝香中的主要成分尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：湖北民族學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(MY2015B048)。

作者簡(jiǎn)介：涂星(1987-)，男，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事民族醫(yī)藥治療心腦血管病的研究。E-mail：kuangsheng1234@126.com.

【中圖分類號(hào)】R29

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)10-0002-06

(收稿日期：2016.02.26)

Study on protective effect of Tujia Medicine Musk needle therapy on ischemic stroke in rats

TU Xing1ZHANG Yan1XIANG Yang1TIAN Chunman1ZHANG Qi2GAO Hongli1

1.Hubei University for Nationalities, Hubei Enshi, 445000;2.Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310002,China

Abstract:Objective To observe the protective effect of Tujia medicine Musk needle therapy on ischemic stroke in rats and preliminary explore the mechanism of the effect.Methods Male Sprague Dawley rats was used as the research object, and all rats were randomly divided into sham-operation group, model group, natural musk needle group and synthetic musk needle group. The ischemic stroke model was prepared by thread approach, screened the ischemic stroke rats according to Zea-longa scoring method. Rat in natural musk needle group and synthetic musk needle group were given needle therapy twice a day, 5 days for a period of treatment, for a total of 3 period of treatment; rats in sham-operation group and model group were fetched and bind fixed without needle therapy as the same time. Then Garcia scoring method was used to evaluate the neurological function; automatic hemorheology detector was used to analysis the whole blood viscosity(WBV), platelet maximum aggregation rate(PMAR), thrombin time(TT) and prothrombin time(PT); enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA) method was used to detect the levels of interferon factor beta(IFN-β) and tumor necrosis factor alpha(TNF-α); SP immunohistochemical method was used to detect the positive expression of nuclear factor-κB(NF-κB) p65 in brain tissue. Results Garcia score, PT, TT decreased significantly while WBV, PMAR, level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65 increased significantly in ischemic stroke model rats. The Garcia score, PT, increased significantly while WBV, PMAR, level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65 decreased significantly after treating by Tujia medicine musk needle therapy, but it had no effect on TT. There no difference of these indexes between natural musk needle group and synthetic musk needle group, but it showed that the natural musk needle worked more quickly and continued for a long time. Conclusions Theneurological deficit of ischemic stroke caused by thread approach may have something to do with the increasing of WBV and PMAR, decreasing of TT and PT, increasing level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65. Tujia medicine musk needle therapy has a goodneuronal function restoration effect on theischemic stroke rats. The mechanism may be related to improve the blood rheology characteristic, reduce the release of pro-IFNlammatory factors like TNF-α while increase the release of the nerve protection factor like IFN-β and lower the positive expression of NF-κB p65 cells in brain. Synthetic musk could use as a alternative source of natural musk in Tujia medicine musk needle therapy.

Key words:Tujia medicine musk needle therapy;ischemic stroke; blood rheology characteristic; TNF-α; IFN-β; NF-κB p65