不同產(chǎn)地鹽益智仁炮制前后白楊素的含量測(cè)定

蘇胄豪　何月云　梁華倫　江秀娟　汪金玉　陳　康*

1.廣東省中醫(yī)院，廣東　廣州　510120；2.廣州市海珠區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣東　廣州　510250；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東　廣州　510515

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不同產(chǎn)地鹽益智仁炮制前后白楊素的含量測(cè)定

蘇胄豪1何月云1梁華倫1江秀娟2汪金玉3陳康3*

1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；2.廣州市海珠區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510250；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510515

【摘要】目的：比較不同產(chǎn)地益智仁鹽炙前后白楊素的含量差異。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Kromasil C18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：2.5%四氫呋喃甲醇-水梯度洗脫；流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：269nm。結(jié)果：白楊素在0～13μg之間呈線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率為87.54%，RSD為1.93%(n=5)；有4個(gè)樣品在炮制后白楊素含量增加，1個(gè)樣品減少。結(jié)論：采用高效液相色譜法測(cè)定益智仁中白楊素含量的方法簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

【關(guān)鍵詞】益智仁；白楊素；含量測(cè)定；HPLC

益智仁為姜科植物益智AlpiniaOxyphyllaMiq．的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于海南和廣東，福建、廣西、云南亦有栽培，是我國(guó)四大南藥之一。益智性溫味辛，歸脾胃經(jīng)，具有溫脾止瀉，攝唾涎，固精縮尿的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，益智仁主要有揮發(fā)油類、二芳基庚酮類、倍半萜類、黃酮類等成分。羅秀珍[1]等從益智仁中分得了黃酮類成分白楊素，但至今仍未見益智仁中白楊素含量測(cè)定方面的相關(guān)報(bào)道。藥理研究證明，白楊素具有很好的抗腫瘤作用[2]，而益智仁也具有很好的抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)的作用。因此，研究率先對(duì)益智仁鹽炙前后白楊素進(jìn)行了含量測(cè)定，建立了測(cè)定益智仁中白楊素含量的HPLC法，測(cè)定采集的5批10份益智仁飲片樣品中白楊素的含量，并對(duì)其測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較，為益智飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及炮制研究提供參考提供參考。

1 儀器及試藥

1.1儀器天美LC2000型高效液相色譜儀(LC 2030檢測(cè)器、LC 2130泵、L-2200自動(dòng)進(jìn)樣器、T2000P色譜工作站)；BP 211D型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司)；藥用粉碎機(jī)LK-400(浙江城關(guān)紅利數(shù)控制造廠)。

1.2材料白楊素對(duì)照品(批號(hào)：111701-200501，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。不同產(chǎn)地的5批益智藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院高明副教授鑒定該5批皆為姜科植物益智AlpiniaOxyphyllaMiq．的干燥成熟果實(shí)，見表1。甲醇為色譜醇，其他試劑均為分析純。

表1　樣品采集信息表

2方法

2.1色譜條件色譜柱：安譜公司Kromasil C18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：2.5%四氫呋喃甲醇-水，梯度洗脫，洗脫條件見表2；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：269nm；柱溫為室溫(26℃)；進(jìn)樣量：30μl。

表2　洗脫條件

1.白楊素；2.益智仁圖1　白楊素對(duì)照品及益智仁樣品HPLC圖

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的白楊素對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，制成每ml含白楊素13μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備將各批益智仁飲片(生品/鹽炙品)用粉碎機(jī)粉碎，過2號(hào)篩。取益智仁樣品粉末約5g，精密稱定，置于100ml圓底燒瓶中，加50ml乙酸乙酯，加熱回流2h，靜置冷卻至常溫，過濾，濾液定容至50ml，取定容后溶液10ml置分液漏斗中，等體積水萃洗三次，取萃洗后乙酸乙酯溶液5ml水浴揮干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3線性關(guān)系考察精密吸取白楊素對(duì)照品溶液0、1、2、5、10ml，分別置于10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取30μl注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，得回歸方程為白楊素Y=183.81X-6.4598，R2=0.9999，表明樣品在0～13μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖2。

圖2　白楊素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行掃描，得白楊素的紫外吸收峰為212nm、269nm、313nm。綜合考慮樣品液的紫外吸收峰特點(diǎn)及色譜圖基線、峰形及信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱，確定269nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2流動(dòng)相的確定分別對(duì)常用的流動(dòng)相系統(tǒng)及其不同比例進(jìn)行等度、梯度洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明采用2.1項(xiàng)下的梯度條件進(jìn)行洗脫效果為佳。2.4.3精密度試驗(yàn)精密吸取白楊素對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次30μl，測(cè)定白楊素的峰面積值，其RSD為0.53%。表明儀器精密度良好。見表3。

表3　精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0、3、6、12、18、24h注入液相色譜儀，每次30μl，測(cè)定白楊素的峰面積值，其RSD為0.93%。表明供試品穩(wěn)定性良好，在24h內(nèi)檢測(cè)不影響效果。見表4。

表4　穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的樣品6份，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀30μl，測(cè)定白楊素的峰面積值，其含量的RSD為1.07%。表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。見表5。

表5　重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表6　加樣回收率測(cè)定結(jié)果　(n=5)

2.4.6加樣回收率試驗(yàn)稱取已測(cè)得白楊素含量的樣品5份，精密加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液制備方法處理，分別取30μl注入液相色譜儀，測(cè)定白楊素的峰面積值，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為88.40%，RSD為1.76%，見表6。

2.5不同產(chǎn)地益智仁鹽炙前后白楊素含量測(cè)定取各批益智仁飲片(生品/鹽炙品)用粉碎機(jī)粉碎，過2號(hào)篩。取益智仁樣品粉末約5g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，精密吸取各供試品溶液 30μl，注入液相色譜，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，由回歸方程計(jì)算其含量。測(cè)定結(jié)果益智仁飲片中白楊素的含量在24～35μg/g之間。鹽炙品中白楊素的含量除三亞產(chǎn)樣品外，其余四個(gè)產(chǎn)地均較生品有所增加。見表7，圖3。

表7　益智仁飲片中白楊素含量測(cè)定結(jié)果　(μg/g)

圖3　各產(chǎn)地益智仁飲片中白楊素含量比較直觀圖

3討論

HPLC法測(cè)定益智仁飲片中白楊素的含量時(shí)，在樣品制備方法上曾對(duì)三種提取溶媒進(jìn)行了比較研究：甲醇、丙酮、乙酸乙酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯為溶媒，白楊素的提取率較高且峰形較好，干擾成分少。同時(shí)，采用對(duì)回流、超聲、索氏、石油醚脫脂后超聲等不同提取方法也經(jīng)行了優(yōu)選，結(jié)果表明回流法提取率最高。最終確定選用乙酸乙酯回流提取的樣品制備方法。在流動(dòng)相的選擇上，試驗(yàn)選擇了多種流動(dòng)相系統(tǒng)：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水及2.5%四氫呋喃甲醇-水等，同時(shí)對(duì)洗脫程序經(jīng)行了優(yōu)化，結(jié)果采用2.5%四氫呋喃甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫目標(biāo)物質(zhì)色譜峰分離效果最好，且保留時(shí)間短，適用于益智仁中白楊素的含量測(cè)定。

試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)白楊素的分離及出峰時(shí)間都會(huì)有一定的影響，本次實(shí)驗(yàn)只是將儀器室溫度控制在26℃，并沒有對(duì)柱溫的具體影響做詳細(xì)考察，這方面還有待進(jìn)一步的研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)，益智仁經(jīng)過鹽炙后白楊素的含量所增加，但三亞產(chǎn)益智仁出現(xiàn)了相反的結(jié)果，具體原因有待進(jìn)一步的探討。

參考文獻(xiàn)

[1]羅秀珍,余競(jìng)光,徐麗珍,等.中藥益智化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000,35(3):204-207.

[2]康穎,劉紅光,曾谷清,等.白楊素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].腫瘤防治研究,2007,9(34):656-658.

作者簡(jiǎn)介：蘇胄豪(1986-)，男，廣東廣州人，主要從事藥品質(zhì)量及藥品調(diào)配工作。 通信作者：陳康(1958-)，男，廣東陽(yáng)江人，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥飲片炮制規(guī)范化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)11-0014-03

(收稿日期：2016.04.07)

Evaluate the Content of Chrysin in Fructus Alpiniae Oxyphyllae from Different Producing Areas after Processed with Salt

SU Zhouhao1HE Yueyun1LIANG Hualun1JIANG Xiujuan2WANG Jinyu3CHEN Kang3*

1.Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510120，China；2.Guangzhou City, Haizhu District Institute for food and drug control, Guangzhou 510250，China；3.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006，China

Abstract:Objective To evaluate the content of chrysin in fructus alpiniae oxyphyllae from different producing areas after processed with salt. Methods The high performance liquid chromatography was used to detect the content of chrysin, with chromatography column (Kromasil C18, 250×4.6 mm, 5 microns), mobile phase (2.5% of tetrahydrofuran in methanol-water, gradient elution) at 1.0 ml/min of flow rate, 269 nm of the detection wavelength, 26 ℃ of column temperature, and 30 μl of sample quantity. Results The linear range of chrysin was 0～13 μg, RSD was 1.93%(n=5)， and the average recovery rate was 87.54%. And the contents of chrysin of four samples were increased after processed, while one was reduced. Conclusion The high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the determination of chrysin in fructus alpiniae oxyphyllae was simple, rapid, accurate and reliable.

Key words:Fructus Alpiniae Oxyphyllae；Chrysin; Content Determination；HPLC