耐藥癲癇患者和難治性癲癇大鼠腦組織與外周血GST-π蛋白表達(dá)☆

孫志清付慶喜涂麗香車峰遠(yuǎn)蘇全平

耐藥癲癇患者和難治性癲癇大鼠腦組織與外周血GST-π蛋白表達(dá)☆

孫志清*付慶喜*涂麗香*車峰遠(yuǎn)*蘇全平*

目的 考察耐藥癲癇患者和難治性癲癇大鼠腦組織與外周血谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π（glutathione S-transferase π，GST-π）的表達(dá)。方法 臨床收集2010年1月至2014年3月在我院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的耐藥性癲癇患者32例，選擇同期因腦血管畸形手術(shù)切除的10例正常腦組織為對照；動物試驗：收集15只對照組和20只難治性癲癇大鼠組，難治性癲癇依據(jù)鋰-匹羅卡品癲癇模型制備。檢測人與大鼠外周血和腦的GST-π水平表達(dá)，并進(jìn)行組間比較。結(jié)果 耐藥癲癇患者腦組織的顳葉20例，額葉6例，枕葉6例。GST-π在耐藥癲癇患者和難治性癲癇大鼠腦的顳葉、額葉、枕葉中均有表達(dá)，存在于細(xì)胞胞漿，染成淺黃色至棕黃色顆粒，與對照組比，耐藥癲癇患者和難治性癲癇大鼠腦和外周血GST-π表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 GST-π可能參與耐藥癲癇的發(fā)病，檢測外周血GST-π為耐藥性癲癇的治療提供參考。

GST-π耐藥癲癇 難治性癲癇大鼠

【Abstract】Objective To investigate the expression of glutathione S-transferase π（Glutathione S-transferase π，GST-π）protein in peripheral blood and brain of patients with drug-resistant epilepsy and refractory epilepsy rats.Methods From January 2010 to March 2014，the expression of GST-π in the blood and brain of 32 cases of drug-resistant epilepsy underwent neurosurgery and 10 cases of cerebral vascular malformation underwent surgery were studied and compared.The expression of GST-π in the blood and brain in refractory epilepsy rats and normal rats were studied and compared.Results The specimen from 20 temporal，6 frontal and 6 occipital lobes were obtained from drug-resistant epilepsy patients.The expression levels of GST-π in the blood and brain in refractory epilepsy rats and normal rats were higher than those of the control groups（P＜0.05）.Conclusion GST-π may be involved in the process of drug-resistant epilepsy. The GST-π expression in blood may be used as a marker for resistance to anti-epileptic agents.

【Key Words】GST-π Protein Drug-Resistant Epilepsy Refractory Epilepsy

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的發(fā)作性疾病，以短暫性、反復(fù)性和刻板性為發(fā)病特征，臨床中超過1/4的癲癇患者發(fā)展為耐藥性癲癇（drug resistant epilepsy），或稱為難治性癲癇（refractory epilepsy），嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。耐藥性癲癇成為臨床治療中的難點，耐藥性是導(dǎo)致臨床上癲癇治療失敗的重要原因，耐藥的發(fā)生是復(fù)雜的生物過程。由于抗癲癇藥與腫瘤耐藥基因作用的底物相似，腫瘤的耐藥基因可能也參與了耐藥癲癇。研究顯示多藥耐藥基因的主要表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π（glutathione S-transferase π，GST-π）［2］，GST-π是否也參與了耐藥性癲癇的形成，如果GST-π參與耐藥性癲癇，而一般GST-π往往在病理組織中呈高表達(dá)，但組織檢測具有處理麻煩，組織難以獲得等缺點，GST-π在血液的表達(dá)是否也具有參考意義，因此本課題擬考察耐藥性癲癇患者腦組織和外周血中GST-π的表達(dá)，耐藥性癲癇患者與耐藥性癲癇大鼠的GST-π是否呈現(xiàn)高表達(dá)，這種表達(dá)是否在腦與外周血具有同步性，為臨床研究耐藥性癲癇提供參考信息。

1　研究對象和方法

1.1研究對象

1.1.1臨床患者 經(jīng)院內(nèi)倫理委員會同意，收集2010年1月至2014年3月在我院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的耐藥性癲癇患者32例，男21例，女11例，年齡（25.3±6.4）歲，病程3～15年。陣攣或強(qiáng)直一陣攣性發(fā)作15例，復(fù)雜部分性發(fā)作10例單純部分性發(fā)作7例，所有患者或家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)［3］：①有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征，經(jīng)兩種以上抗癲癇藥正規(guī)治療≥2年，難以控制發(fā)作，每個月發(fā)作至少3次；②無明顯病因，無局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征；③患者資料完整者。選擇同期因腦血管畸形手術(shù)切除的10例正常腦組織為對照，男7例，女3例，年齡（23.9±5.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無癲癇和熱性驚厥史及其家族史；②腦組織檢查無組織學(xué)異常；③家屬簽注知情同意書。

1.1.2動物試驗 SPF級雄性SD大鼠35只，體重250～300 g，購自山東省實驗動物中心，許可證號：SCXK魯20030004，隨機(jī)分為2個組別，15只對照組和20只難治性癲癇大鼠組，難治性癲癇依據(jù)鋰-匹羅卡品癲癇模型制備。

1.1.3難治性癲癇模型制備［4］氯化鋰3 mmol/kg腹腔注射后20 h腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，每隔30 min腹腔注射30 mg/kg鹽酸匹羅卡品，直至現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，當(dāng)癲癇持續(xù)狀態(tài)可持續(xù)60 min，腹腔注射10 mg/kg地西泮，抽搐可緩解或終止，癲癇狀態(tài)后的大鼠24 h，每天腹腔注射5%的糖鹽水，2 次/d，15 d后，采用紅外攝像頭下集中觀察，IV級以上發(fā)作成功為癲癇自發(fā)發(fā)作模型，即難治性癲癇模型，達(dá)不到者棄用。

1.2指標(biāo)檢測

1.2.1免疫組化檢測腦組織中的GST-π表達(dá)腦組織標(biāo)本取出后置于多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，過氧化氫室溫放置15 min，PBS清洗，置于檸檬酸緩沖液121℃高壓抗原修復(fù)1 min，放置至室溫，PBS清洗，山羊血清，室溫封閉放置20 min，滴加一抗GSTP1（1：500）4℃孵育過夜，室溫放置30 min，PBS清洗，滴加鼠二抗，37℃放置10 min，PBS清洗，加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，37℃放置10 min，DAB顯色，鏡下觀察。

1.2.2血清中GST-π水平 取受試者空腹靜脈血3 mL，置于5℃孵育30 min，離心取血清，用ELISA法檢測，試劑盒由背景岳泰生物制品有限公司提供。

1.2.3 Western blot檢測腦組織中GST-π水平提取50 mg腦組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上超聲裂解5 s，重復(fù)4次，低溫離心，收集上清，以紫外分光光度計法定量總蛋白，蛋白定量5 g/ L，每個電泳道上樣50 μg，采用十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移儀將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂奶粉封閉放置2 h，加入一抗GSTP1：500+GAPDH 1：1000，4℃孵育過夜，TBST洗膜，羊抗鼠二抗（1：5000）室溫孵育1.5 h，清洗，以凝膠顯像儀和定量軟件，以GAPDH條帶與電泳條帶的灰度面積比值表示GST-π蛋白質(zhì)的含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用x±s表示，計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，組間比較采用組間方差分析或卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1耐藥癲癇患者GST-π在腦內(nèi)和外周血的表達(dá) 收集到耐藥癲癇患者腦組織的顳葉20例，額葉6例，枕葉6例。GST-π在人腦的顳葉、額葉、枕葉中均有表達(dá)，存在于細(xì)胞胞漿，染成淺黃色至棕黃色顆粒，對照組和與耐藥癲癇組大腦各區(qū)間的GST-π表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（F=1.9，F(xiàn)=2.2，P＞0.05），對照組比，耐藥癲癇組GST-π外周血、腦內(nèi)的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（見表1和圖1）。

表1耐藥癲癇患者GST-π在外周血和腦內(nèi)的表達(dá)

圖1.耐藥癲癇患者GST-π在腦內(nèi)的表達(dá)（200×）注：A：對照組，B：耐藥癲癇病組，淺黃色至棕黃色顆粒即是GST-π

2.3難治性癲癇大鼠GST-π在外周血和腦內(nèi)的表達(dá)GST-π在大鼠腦的顳葉、額葉、枕葉中均有表達(dá)，存在于細(xì)胞胞漿，染成淺黃色至棕黃色顆粒。對照組和與耐藥癲癇組大腦各區(qū)間的GST-π表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.5，F(xiàn)=1.5，P＞0.05），與對照組比，難治性癲癇大鼠GST-π外周血、腦內(nèi)的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（表2和圖2）。

表2難治性癲癇大鼠GST-π在外周血和腦內(nèi)的表達(dá)

圖2.對照組與耐藥癲癇組腦組織的GST-π蛋白表達(dá)的Western blot圖 注：C：正常組，N：耐藥癲癇組，1：外周血；2：顳葉；3：額葉；4：枕葉

3　討論

耐藥性癲癇是臨床中尚未解決，但必須解決的問題，直接影響癲癇患者總體預(yù)后。臨床較為奇怪的現(xiàn)象是，臨床使用的抗癲癇藥多為不同化學(xué)結(jié)構(gòu)、不同作用機(jī)理，但不論對原發(fā)或多種病因所引起的繼發(fā)性癲癇均有不同程度的耐藥性［5］。因而，研究耐藥性癲癇的發(fā)病機(jī)制對于開發(fā)抗癲癇藥具有重要意義。

GST是具有多種生理功能的蛋白質(zhì)超基因家族，家族間成員的功能相互聯(lián)系，形成緊密聯(lián)系的整體，GST-π是該家族的亞型，分子量最小，組織分布廣，分布在消化道、呼吸道和泌尿系統(tǒng)上皮等多種組織中，在正常腦組織中一般不表達(dá)，但在病變腦組織，如膠質(zhì)瘤中則表達(dá)顯著增高［6］。研究顯示，當(dāng)外來有毒有害物進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)I相代謝酶，轉(zhuǎn)化解毒，隨后進(jìn)行與包括GST-π在內(nèi)的II相代謝酶系統(tǒng)結(jié)合，再通過主動/被動轉(zhuǎn)運(yùn)排出體外。在解毒過程中，GST-π以酶或結(jié)合蛋白的形式發(fā)揮作用，作為體內(nèi)重要的生理防線［7］。本課題結(jié)果顯示，GST-π表達(dá)在耐藥性癲癇患者和難治性癲癇大鼠的不同腦區(qū)間沒有明顯差異（P＞0.05），在對照組的不同腦區(qū)也沒有明顯差異（P＞0.05），即便硬化的海馬區(qū)（顳葉）的GST-π表達(dá)與腦的其他區(qū)域相比無統(tǒng)計學(xué)差異，即便MRI結(jié)果顯示耐藥性癲癇患者存在海馬區(qū)硬化現(xiàn)象，提示GST-π表達(dá)與腦區(qū)分布可能無關(guān)；另外耐藥性癲癇患者和難治性癲癇大鼠的腦和血中GST-π表達(dá)較正常對照組高，與DENG XUEJUN等［8-11］的研究結(jié)果相似。體外實驗顯示，丙戊酸鈉和苯巴比妥鈉可誘導(dǎo)培養(yǎng)的胎兒腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GST-π表達(dá)增加，存在GST-π表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可降低卡馬西平在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的藥物水平［12］，可見GST-π表達(dá)增強(qiáng)可能是抗癲癇藥誘導(dǎo)的全身反應(yīng)。另外，臨床中存在相同病因引起同部位的癲癇患者存在不同程度的耐藥差異，如與苯妥英鈉比，丙戊酸的先天耐藥和代謝性耐藥發(fā)生率均較高，那么GST-π表達(dá)增強(qiáng)是否與對藥物的易感基因表達(dá)有關(guān)，或耐藥性存在多靶點，再者，GST-π常在消化道、呼吸道和泌尿系統(tǒng)上皮等多種組織表達(dá)，本課題結(jié)果顯示不僅在腦病理檢查，而且在外周血中也檢測到GST-π，但外周血GST-π水平略低于組織，與DENG X等［13］的研究一致，與劉晶等［14-16］研究認(rèn)為血清GST-π表達(dá)對于食管癌、肺癌和胃癌的藥物敏感性具有預(yù)測價值的觀點相似，筆者認(rèn)為處于外周血的GST-π應(yīng)來自病理組織，具有搬運(yùn)的作用，即攜帶經(jīng)代謝酶解毒有毒有害的物質(zhì)通過血液循環(huán)途徑排出體外，這也解釋了外周血GST-π水平略低于病理組織?？梢娡ㄟ^檢測癲癇患者外周血GST-π水平判斷患者存在耐藥，為更改治療方案提供考，但外周血與中樞GST-π表達(dá)的關(guān)聯(lián)性仍需要進(jìn)一步研究。

匹羅卡品所致癲癇大鼠模型的病理特征與人類顳葉癲癇非常相似，經(jīng)歷急性期、潛伏期、自發(fā)性發(fā)作而后進(jìn)入慢性期，近1/2的動物成為難治性癲癇，可見匹羅卡品所致難治性癲癇大鼠模型模型是理想的用于研究人類耐藥癲癇的工具［17］。

本課題不足和研究方向有研究認(rèn)為癲癇病程＞10年患者腦中GST-π的表達(dá)較病程＜10年者高［18］，但本課題結(jié)果顯示GST-π可能參與了耐藥性癲癇后期耐藥機(jī)制，但GST-π表達(dá)與病程無關(guān)，即病程長和短間的表達(dá)無顯著差異，可能原因有以下幾點：①雖然臨床顯示病程長者耐藥可能性更大，但研究證實多藥耐藥基因的主要表達(dá)產(chǎn)物除了GST-π，還存在P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白和拓樸異構(gòu)酶基因等都參與了難治性癲癇耐藥機(jī)制的形成，因此耐藥的發(fā)生可能與多種蛋白表達(dá)異常有關(guān)；②體外實驗顯示誘導(dǎo)腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GST-π表達(dá)增加不僅與時間有關(guān)也與誘導(dǎo)藥物的濃度相關(guān)；③可能與納入樣本較少有關(guān)。因此進(jìn)一步的研究除了納入更多樣本，還需要納入P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白和拓樸異構(gòu)酶基因進(jìn)行綜合評估。GST-π作為難治性癲癇的研究靶點之一，為難治性癲癇的治療開辟了新思路：通過下調(diào)GST-π可以增強(qiáng)抗癲癇藥物的作用。但GST-π底物的多樣性和GST-π作為細(xì)胞本身的一種防御機(jī)制的下調(diào)是否會產(chǎn)生潛在的危險，如循環(huán)中的毒性物質(zhì)人腦或細(xì)胞自穩(wěn)機(jī)制削弱帶來的副作用等尚不清晰。因此，進(jìn)一步闡明GST-π的調(diào)控機(jī)制，GST-π與抗癲癇藥物的結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，是迫切需要解決的問題。

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（責(zé)任編輯：李立）

The expression of GST-π protein in peripheral blood and brain of patients with drug-resistant epilepsy and refractory epilepsy rats.

SUN Zhiqing，F(xiàn)U Qingxi，TU Lixiang，CHE Fengyuan，SU Quanping.Shandong Province People's Hospital，Linyi 276003，China.Tel：0539-8077569.

R735.2

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.004
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*山東省臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（臨沂276003）

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2014-10-05）