針刺聯(lián)合黃芪多糖對db/db小鼠胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響

張文奎,李茜,宮翠紅,孫志(南京中醫(yī)藥大學,南京 210023)

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針刺聯(lián)合黃芪多糖對db/db小鼠胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響

張文奎,李茜,宮翠紅,孫志
(南京中醫(yī)藥大學,南京 210023)

【摘要】目的觀察針刺聯(lián)合黃芪多糖對db/db小鼠胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響。方法選用自發(fā)性2型糖尿病動物模型C57BL/Ksj-db/db小鼠為本實驗動物模型。將5周齡db/db小鼠隨機分為模型組、針刺組、藥物組和針藥組,同時將db/m小鼠作為正常組。針刺組大鼠取后三里(相當于足三里)、內庭和胰俞穴予針刺治療,藥物組用黃芪多糖(1400 mg/kg)灌胃,針藥組同時給予針刺和藥物治療,均每日1次,連續(xù)12星期。實驗結束后,采血檢測血糖、胰島素和抵抗素,免疫組化檢測胰島b細胞Bcl-2的蛋白表達。結果在血糖、胰島素和抵抗素水平方面,針藥組、針刺組、藥物組顯著低于模型組,針藥組顯著低于針刺組和藥物組,針刺組顯著低于藥物組;在對胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響方面,藥物組、針刺組及針藥組Bcl-2的表達均高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針藥組Bcl-2的表達高于藥物組(P＜0.01);藥物組與針刺組Bcl-2的表達基本相同,未見明顯差異(P＞0.05)。結論針刺聯(lián)合黃芪多糖能夠顯著降低db/db小鼠血糖、血清胰島素和抵抗素水平,提高胰島b細胞Bcl-2蛋白的表達水平,從而有效抑制胰島b細胞的凋亡,作用強于單一針刺治療和藥物治療。

【關鍵詞】針刺;黃芪多糖;糖尿病,非胰島素依賴型;b細胞;B淋巴細胞瘤蛋白;小鼠

2型糖尿病的發(fā)病率迅速升高,已成為發(fā)達國家中繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。該病常并發(fā)心腦血管病、視網膜病變、糖尿病腎病、神經病變和糖尿病足等病癥,嚴重危害人們的身心健康。臨床和實驗研究表明,針刺聯(lián)合黃芪多糖治療2型糖尿病可顯著提高療效[1-2]。2型糖尿病發(fā)病核心機制是胰島b細胞凋亡,Bcl-2(B淋巴細胞瘤蛋白)是重要的抗凋亡蛋白。為進一步探討針藥結合治療2型糖尿病的機理,筆者進行了本項研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物

選用自發(fā)性 2型糖尿病動物模型 C57BL/Ksj-db/db小鼠為本實驗動物模型,由南京大學模式動物研究所提供。4周齡db/db小鼠40只及db/m小鼠(野生型)10只進入實驗,均雌雄各半,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學清潔級(SPF)動物中心。每籠5只,雌雄分籠喂養(yǎng)。所有小鼠適應飼養(yǎng)1星期進行分組。

1.2分組及處理方法

40只db/db小鼠隨機分為模型組、針刺治療組(簡稱為針刺組)、藥物治療組(簡稱藥物組)、針刺和藥物結合治療組(簡稱針藥組),每組10只,同時將db/m小鼠10只作為正常對照組(簡稱正常組)。

針刺組:將小鼠放入固定器中,用乙醇消毒一側后三里(相當于足三里)、內庭和胰俞穴,用0.20 mm× 13 mm毫針刺入3 mm左右,行捻轉平補平瀉手法5次, 接G6805Ⅰ型電針治療儀(青島鑫升實業(yè)有限公司),強度以動物能耐受為度,連續(xù)波和疏密波交替使用,每次治療15 min。每日治療1次,連續(xù)治療12星期。

藥物組:將黃芪多糖(APS)(由陜西森弗生物技術有限公司提供)用生理鹽水配成 12%水溶液,以1400 mg/kg/d黃芪多糖(APS)溶液灌胃,每日1次,持續(xù)12星期。

針藥組:針刺治療同針刺組,藥物治療同藥物組。

模型組、正常組在針刺組治療的同時,陪同抓取、固定,并予以等容量生理鹽水灌胃,每日1次,均持續(xù)12星期。

記錄治療過程中每天的飲水量及攝食量,每星期稱重1次。

1.3樣本采集

實驗第8星期,每間隔3天定時空腹斷尾采血測定血糖與血清胰島素。實驗結束后,禁食12 h,次日清晨稱重后,10%烏拉坦(氨基甲酸乙酯)1 g/kg腹腔注射麻醉后,摘眼球采血,存于EDAT抗凝管,靜置5 min,4000 ×g離心2 min,留取血漿,﹣20℃凍存待檢。斷頸處死小鼠,剖開腹腔,立即取出胰腺組織,以0.9%冰生理鹽水沖洗,用濾紙吸干殘留水分,稱量組織重量。分別留取標本進行免疫組化及光鏡檢查。

1.4觀察指標與方法

血糖:One TouchⅡ型血糖儀(美國強生公司)和7080型全自動生化分析儀(日本日立公司)檢測。

胰島素:ELISA法檢測(蘇州卡爾文生物科技有限公司檢測)。

抵抗素:ELISA法檢測(蘇州卡爾文生物科技有限公司檢測)。

胰島b細胞功能指數(shù)(Homa-b):Homa-b=20× Fins/(FPG－3.5)。

免疫組化檢測Bcl-2蛋白表達:取新鮮胰腺組織,用10%中性緩沖多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切取5mm厚的切片,順次進行HE和免疫組化染色。免疫組化采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法,按照試劑盒說明書進行。每片選5個高倍(400倍)陽性視野進行光鏡觀察,在CMIAS圖像分析儀(江蘇捷達形態(tài)圖像分析系統(tǒng))下記數(shù)每個視野中的陽性細胞數(shù)和測量分析光鏡下Bcl-2的蛋白表達。

1.5統(tǒng)計學方法

運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,組間比較用獨立樣本t檢驗,多組兩兩比較用單因素方差分析。

2　結果

2.1各組小鼠體重比較

實驗中,因病和操作失誤,造成針刺組脫失3只,藥物組脫失2只,針藥組脫失2只,模型組脫失1只。

治療前除正常組小鼠外,其余各組小鼠體重無顯著性差異(P＞0.05)。治療后觀察體重結果顯示,針藥組和針刺組體重顯著低于模型組,藥物組與模型組相比無顯著性差異(P=0.147);針藥組體重顯著高于針刺組(P＜0.05),與藥物組相比無明顯差異(P＞0.05);針刺組與藥物組相比,針刺組體重顯著低于藥物組(P＜0.05)。詳見表1。

表1　各組小鼠體重比較

表1　各組小鼠體重比較　

注:與模型組比較1)P＜0.05;與藥物組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P ＜0.05

組別　n　　治療前體重　　治療后體重正常組　10　17.30±2.26　19.67±2.83模型組　9　30.20±2.57　37.00±4.50針刺組　7　28.11±2.57　27.43±1.621)2)藥物組　8　29.20±2.35　33.90±4.65針藥組　8　29.90±2.03　31.89±4.261)3)

2.2各組小鼠血糖值比較

經過12星期治療,各組血糖出現(xiàn)明顯不同。統(tǒng)計分析顯示,針藥組、藥物組、針刺組均低于模型組(P=0.000),針藥組和針刺組顯著低于藥物組(P=0.000),針藥組顯著低于針刺組(P=0.000)。同時,針藥組血糖又顯著高于正常組(P=0.002)。說明針藥結合治療降糖作用最強。詳見表2。

表2　各組小鼠血糖比較

表2　各組小鼠血糖比較　

注:與模型組比較1)P＜0.05;與藥物組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與正常組比較4)P＜0.05

組別　n　　血糖正常組　10　6.13±0.23模型組　9　26.57±0.86針刺組　7　8.17±0.191)2)藥物組　8　12.07±0.271)針藥組　8　7.02±0.591)2)3)4)

2.3各組小鼠胰島素比較

各組小鼠血清胰島素檢測結果顯示,模型組胰島素水平顯著高于正常組,說明存在高胰島素血癥;針藥組、藥物組和針刺組顯著低于模型組(P=0.000),針藥組、針刺組顯著低于藥物組(P=0.000);針藥組顯著低于針刺組(P=0.046)。說明針刺、藥物和針藥結合治療均能有效改善高胰島素血癥,降低胰島素抵抗,其中以針藥結合治療的作用最強。詳見表3。

2.4各組小鼠抵抗素比較

各組小鼠血清抵抗素結果顯示,模型組抵抗素水平顯著高于正常組,說明存在胰島素抵抗;針藥組、藥物組和針刺組顯著低于模型組(P=0.000),針藥組、針刺組顯著低于藥物組(P=0.000);針藥組與針刺組相比,針藥組又顯著低于針刺組(P=0.007)。說明針刺、藥物和針藥結合治療均能有效改善胰島素抵抗,而以針藥結合治療的作用最強。詳見表3。

表3　各組小鼠胰島素、抵抗素比較

表3　各組小鼠胰島素、抵抗素比較　

注:與模型組比較1)P＜0.05;與藥物組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與正常組比較4)P＜0.05

組別　n　　胰島素(mIU/L)　　抵抗素(ng/mL)正常組　10　20.69±0.96　34.68±1.54模型組　9　40.29±1.28　60.85±1.69針刺組　7　20.37±0.921)2)　39.55±1.711)2)藥物組　8　36.62±1.561)　50.18±1.671)針藥組　8　19.31±0.991)2)3)4)　36.67±1.901)2)3)4)

2.5針刺加黃芪多糖對胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響

Bcl-2主要表達部位在胞漿,以黃色及棕黃色染色為陽性表達。正常組Bcl-2表達呈強陽性,其染色的強度及密度均明顯高于模型組。模型組Bcl-2表達極低,胰島內僅見少許散在的細胞胞漿著色呈淡黃色,同正常組比差異顯著。各治療組Bcl-2表達的情況較模型組有不同程度的增加。詳見圖1。

圖1　針刺加黃芪多糖對胰島b細胞Bcl-2蛋白表達的影響(免疫組化染色,×400倍)

表4　針刺聯(lián)合黃芪多糖對db/db小鼠Bcl-2蛋白表達的影響

表4　針刺聯(lián)合黃芪多糖對db/db小鼠Bcl-2蛋白表達的影響

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01;與藥物組比較3)P ＜0.01

組別　n　Bcl-2表達(平均灰度值)正常組　10　100.99±12.882)模型組　9　140.49±14.431)藥物組　7　131.55±17.451)2)針刺組　8　129.79±14.991)2)針藥組　8　119.74±6.871)2)3)

對各組Bcl-2蛋白表達的評價用均光密度進行統(tǒng)計分析,由表4和圖2可以看出,正常組Bcl-2的蛋白表達高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);藥物組、針刺組及針藥組Bcl-2的表達均高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針藥組Bcl-2的表達高于藥物組(P＜0.01);藥物組與針刺組Bcl-2的表達基本相同,未見明顯差異(P＞0.05)。

圖2　各組小鼠治療后Bcl-2表達平均灰度值比較

3　討論

db/db小鼠是瘦素(leptin)受體基因缺陷導致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠,具有高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特性。db/db小鼠出生后2周內就發(fā)生高胰島素血癥,3～4周發(fā)展為肥胖,4～8周后就發(fā)展為非常嚴重的高血糖癥,其間有胰島素抵抗發(fā)生,胰島b細胞功能衰竭[3]。其發(fā)病過程與人T2DM非常相似,是國際上廣為采用的研究T2DM動物模型。本文采用db/db小鼠作為T2DM動物模型,并于已發(fā)展到高血糖階段的6周齡進行干預治療。

胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)病機制的兩個基本環(huán)節(jié),核心機制是胰島b細胞功能障礙,其誘因是代謝綜合征相關的胰島素抵抗導致對胰島素的長期高需求,其結果是胰島素相對或絕對不足引起的高血糖及相關慢性并發(fā)癥[4]。一旦診斷為2型糖尿病,胰島b細胞功能就已喪失50%。胰島b細胞功能障礙主要是b細胞數(shù)量減少,而b細胞數(shù)量減少的重要原因是過量的b細胞凋亡。因此,改善胰島素抵抗和抑制胰島b細胞凋亡就成為預防及治愈2型糖尿病的關鍵。

近年研究顯示,針灸治療2型糖尿病可顯著降低空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)及體重,同時可有效改善胰島素抵抗[5-7]。我們對針灸改善胰島b細胞功能的作用進行了研究[8-10],結果表明針刺可有效改善胰島b細胞分泌功能,且具有保護胰島b細胞形態(tài)的作用。

黃芪多糖(PAS)是中藥黃芪中主要生物活性成分,具有降低血糖、增加對胰島素的敏感性、改善胰島素抵抗、抑制胰島b細胞凋亡作用,此外還具有提高免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等生物活性[11]。既然針刺和黃芪多糖對2型糖尿病都有較好的治療作用,推測二者聯(lián)合應用可以提高治療效應,因此進行了本研究。

本文研究顯示,模型大鼠血清胰島素和抵抗素水平均高于正常大鼠,說明存在胰島素抵抗。針刺和針刺聯(lián)合黃芪多糖治療后血清胰島素和抵抗素水平顯著降低,且后者作用更強,說明二者均能有效改善胰島素抵抗,針刺與黃芪多糖合用具有增效作用。

Bcl-2蛋白家族(B淋巴細胞瘤蛋白家族)抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl等)與促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid等)的異常改變導致線粒體外膜通透性改變,內膜中的細胞色素c(cyt-c)釋放入胞質,與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和前caspase-9、ATP形成凋亡體(apoptosome)活化 caspase-9,從 而 激 活 效 應caspase-3,6,7導致凋亡。線粒體是細胞主要的供能場所,越來越多的證據(jù)表明葡萄糖刺激的胰島素分泌需要胰島b細胞具有正常的線粒體功能,線粒體功能失?？赡苁且?型糖尿病的重要原因[12]。研究表明,高糖、高脂肪酸(FFA)濃度下均可引起抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl等和促凋亡基因(如Bax、Bak、Bid等)的異常表達。Bcl-2家族成員可通過改變線粒體外膜通透性而調控線粒體活化,在線粒體誘導的凋亡途徑中起重要作用。Bcl-2家族不僅存在于線粒體上,也定位于內質網(ER)膜上并影響ER的穩(wěn)態(tài)。內質網應急(ERS)時,未折疊蛋白反應(UPR)的信號分子激活CCAAT增強子結合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)和c-Jun氨基末端激酶(JNK),二者均可削弱Bcl-2的抗凋亡功能,從而誘導Bax和Bak的構象變化并寡聚化最終破壞ER膜的完整性,使ER內的Ca2﹢外流,導致胞質內Ca2﹢濃度升高,最終誘導細胞凋亡。

我們以前的研究表明,針刺可有效抑制2型糖尿病大鼠胰島b細胞的凋亡[13]。本文研究結果表明,針刺和針刺聯(lián)合黃芪多糖在有效改善胰島素抵抗、降低血糖的基礎上,均可顯著提高胰島b細胞Bcl-2的蛋白表達,從而有效抑制胰島b細胞的凋亡。這一作用以針藥組最好,提示針刺和黃芪多糖聯(lián)合治療有協(xié)同作用。這一結果提示,針藥結合治療2型糖尿病具有較大優(yōu)勢。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.06.0738

文章編號:1005-0957(2016)06-0738-04

收稿日期2015-12-20

基金項目:江蘇省針灸學重點實驗室(針藥結合實驗室)開放課題(KJA200904)

作者簡介:張文奎(1987-),男,2013級碩士生

通信作者:孫志(1962-),男,教授,博士,主要從事針灸治療內分泌代謝病研究,Email:Sunzhi63@163.com

Effect of Acupuncture plus Astragalus Polysaccharide on the Expression of Bcl-2 Protein in IsletbCells in db/db Mice

ZHANG Wen-kui,LI Qian,GONG Cui-hong,SUN Zhi.
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210023,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture plus astragalus polysaccharide on the expression of Bcl-2 protein in pancreatic isletbcells in db/db mice.MethodC57BL/Ksj-db/db mice as an animal model of spontaneous type 2 diabetes were selected for this experiment.Five-week-old db/db mice were randomized into model,acupuncture,medication and acupuncture ＋medication groups.Meanwhile,db/m mice were selected as a normal group.The acupuncture group received acupuncture at points Housanli(equivalent to Zusanli,ST36),Neiting(ST44)and Yishu(Extra)and the medication group,an oral gavage of astragalus polysaccharide(1400 mg/kg).Both groups were treated once daily,for 12 consecutive weeks.After the end of experiment, blood glucose,insulin and resistin were measured,and the expression of Bcl-2 protein in isletbcells was determined by immunohistochemical method.ResultBlood glucose,insulin and resistin levels were significantly lower in the acupuncture ＋medication,acupuncture and medication groups than in the model group.They were significantly lower in the acupuncture ＋medication group than in the acupuncture and medication groups and significantly lower in the acupuncture group than in the medication group.The expression of Bcl-2 protein in isletbcells was higher in the medication,acupuncture and acupuncture ＋medication groups than in the model group;there was a statistically significant difference(P＜0.01).The expression of Bcl-2 protein was higher in the acupuncture＋medication groups than in the medication group(P＜0.01)and it was basically the same in the medication group as in the acupuncture group;there was no statistically significant difference(P＞0.05).Conclusion Acupuncture plus astragalus polysaccharide can significantly reduce blood glucose and serum insulin and resistin levels and increase the expression of Bcl-2 protein in isletbcells to effectively inhibit apoptosis in isletbcells in db/db mice.Its effect is better than that of acupuncture alone or medication.

[Key words]Acupuncture;Astragalus polysaccharide;Diabetes,non-insulin dependent;bcell;B-lymphocyte tumor protein;Mice