激光共聚焦觀測針?biāo)幏▽馓撗鲂椭酗L(fēng)大鼠NSC分化的影響

周海純，莊哲，郭蕊珠，王春霞，李響，董旭，吳迪，馮麗媛，蔡國鋒（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 5000；.哈爾濱市急救中心，哈爾濱 50056）

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·動物實驗·

激光共聚焦觀測針?biāo)幏▽馓撗鲂椭酗L(fēng)大鼠NSC分化的影響

周海純1，莊哲1，郭蕊珠2，王春霞1，李響1，董旭1，吳迪1，馮麗媛1，蔡國鋒1
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.哈爾濱市急救中心，哈爾濱 150056）

【摘要】目的 觀察頭穴叢刺法配合加味補陽還五湯灌胃對氣虛血瘀型缺血性中風(fēng)大鼠NSC分化的影響。方法 選取健康大鼠采用氣虛血瘀證候造模，成功后予DiL染料預(yù)標(biāo)記。隨機(jī)分為A組、B組、C組、D組、E組和F組，F(xiàn)組為4只，其余各組為12只。預(yù)標(biāo)記48 h后行MCAO造模，制備氣虛血瘀型缺血性中風(fēng)大鼠模型，模型建立成功后，A組為模型組，B組采用頭穴叢刺法治療，C組采用補陽還五湯原方灌胃治療，D組采用加味補陽還五湯灌胃治療，E組采用頭穴叢刺法配合加味補陽還五方灌胃治療，F(xiàn)組為假手術(shù)組。在各時間點分別處死取材，以神經(jīng)功能評定、免疫熒光雙染法、激光共聚焦觀測為檢測指標(biāo)，進(jìn)行對比研究，觀察各療法對模型大鼠NSC分化的影響。結(jié)果 B組、C組、D組和E組治療1星期后神經(jīng)功能評分與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組和E組治療2星期后神經(jīng)功能評分與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。E組治療1、2星期后神經(jīng)功能評分與C組和D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。B組、C組、D組和E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)、Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)、Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)及Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組和E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)、Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)、Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)及Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與B組和C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)、Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)、Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)及Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 各種治療方法對模型大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分化均具有一定的促進(jìn)作用，其中以頭穴叢刺法配合加味補陽還五湯灌胃效果最佳。

【關(guān)鍵詞】針刺療法；中風(fēng)；氣虛血瘀；補陽還五湯；針?biāo)幉⒂?；叢刺；大鼠；頭針

腦缺血疾病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，多起病急驟，癥狀多變，發(fā)展迅速，似風(fēng)之善行數(shù)變，因此名之“中風(fēng)”。在長期的治療研究工作中，中醫(yī)學(xué)已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗，其中頭穴叢刺的治療作用已得到廣泛認(rèn)可，而中藥湯劑也長期應(yīng)用于臨床［1-2］。《醫(yī)林改錯》中的補陽還五湯為代表方之一［3］，其作用已得到廣泛認(rèn)可。臨床試驗已經(jīng)證實補陽還五湯對神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）具有促進(jìn)作用［4-5］。但筆者在長期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)缺血性中風(fēng)患者常兼有痰濁，甚或見痰蒙清竅之癥，因此常在補陽還五湯的原方基礎(chǔ)上加減變化，如臨證時加石菖蒲以開竅醒神化痰，加竹茹以清熱化痰，均獲得較理想的療效。然而，筆者查閱大量文獻(xiàn)后，尚未找到相關(guān)報道進(jìn)行理論支持。因此，本實驗通過觀察頭穴叢刺法配合加味補陽還五湯灌胃對氣虛血瘀型缺血性中風(fēng)大鼠NSC分化的影響，為臨床實踐提供可靠的論證。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備與分組

選取健康Wistar大鼠，體重為（180±20）g，實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號為00101006。行氣虛血瘀證候造模，造模方法采用持續(xù)力竭游泳法［6-9］，于氣虛血瘀證候模型大鼠納入成功后，予以DiL染料預(yù)標(biāo)記處理［10］。預(yù)標(biāo)記后繼續(xù)行力竭游泳法維持氣虛血瘀模型狀態(tài)，預(yù)標(biāo)記48 h后參照Zea Longa等建立的大鼠大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷方法，行大腦中動脈阻塞術(shù)（MCAO）［11-12］。

模型大鼠建立成功24 h后，參照Bederson 4級評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。0級表現(xiàn)為模型大鼠未出現(xiàn)行為缺陷；1級表現(xiàn)為模型大鼠出現(xiàn)前肢屈曲；2級表現(xiàn)為模型大鼠出現(xiàn)側(cè)向推力實驗陽性，同時伴有前肢屈曲的現(xiàn)象，但是不出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈行為；3級表現(xiàn)為模型大鼠出現(xiàn)側(cè)向推力實驗陽性，同時伴有前肢屈曲及自發(fā)性旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。

依據(jù)評分結(jié)果進(jìn)行篩選剔除，評分≥2分者篩選入組，再隨機(jī)分為A組、B組、C組、D組、E組和F組，其中F組為4只，其余各組為12只。

1.2 方劑制備

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供藥材。補陽還五湯記載于清朝王清任《醫(yī)林改錯》，按原方比例，即黃芪：當(dāng)歸尾：赤芍：地龍：川芎：桃仁：紅花= 40：2：1.5：1：1：1：1。清水浸泡藥材后進(jìn)行一煎、二煎，每次煎汁 60 min。將兩次煎煮液混勻，使之濃縮（2.68 g/mL），再將濃縮液冷藏備用。

補陽還五湯加味方在原方組成比例基礎(chǔ)上，加入 1.5比例石菖蒲和1.5比例竹茹，方劑制備依前法。

1.3 實驗方法

1.3.1 治療方法

A組實驗動物予MCAO造模，術(shù)后單獨普通籠中常規(guī)飼養(yǎng)，予等體積雙蒸餾水灌胃。

B組依據(jù)“大鼠穴位圖譜”，選取百會穴及百會穴左、右側(cè)各旁開2 mm處，共3個穴位。常規(guī)消毒后，采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫針向眼的方向行叢刺法針刺，刺入深度為沿皮平刺約3 mm，快速捻轉(zhuǎn)行針5 min后，留針6 h。每日1次，共治療2星期。

C組采用補陽還五湯灌胃治療，給藥量依據(jù)人體與動物體表面積折算，灌胃劑量約為 5 g/kg/d。灌胃頻次為每日2次。

D組采用加味補陽還五湯灌胃治療，給藥方法及劑量參照C組。

E組采用頭穴叢刺配合加味補陽還五湯灌胃治療。針刺方法同B組，加味補陽還五湯灌胃的給藥方法及劑量參照D組。

F組實驗動物單獨普通籠中常規(guī)飼養(yǎng)，只行動脈分離，不予MCAO，予等體積雙蒸餾水灌胃。

1.3.2 BrdU標(biāo)記［13］

注射前將BrdU標(biāo)記物溶解在0.007 mol/L氫氧化鈉的氯化鈉溶液中，配置成濃度為1%的BrdU標(biāo)記物溶液。脈沖標(biāo)記法在大鼠處死前于大鼠腹腔注射。注射頻次分為 3次注射，每 4 h注射 1次，每次劑量為50 mg/kg。在最后一次注射完成4 h后，將動物處死。

1.3.3 標(biāo)本制作［14］

使用水合氯醛麻醉大鼠，水合氯醛濃度為10%。大鼠麻醉成功后，行手術(shù)開胸，使大鼠心臟暴露，右心房剪口，從左心室向大鼠體內(nèi)注射，用37℃100 mL肝素化生理鹽水配制沖洗液，沖洗全身血管。對實驗大鼠進(jìn)行血管沖洗成功后，選用 4℃濃度為 4%的多聚甲醛溶液200 mL，進(jìn)行灌注固定。在灌注固定完畢后，迅速將實驗大鼠斷頭取腦，然后建立腦組織切片標(biāo)本（在前囟前1.2 mm至前囟后0.3 mm）。第1步，將組織在濃度為50%甲酰胺2Xssc65℃中放置，放置時間為2 h；第2步，將組織在2N鹽酸37℃中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30 min，目的是使組織DNA變性；第3步，在室溫下，使用pH值為8.5、濃度為0.1 mol/L的硼酸漂洗組織10 min；第4步，腦標(biāo)本經(jīng)一抗后，在 4℃下保存過夜，腦組織標(biāo)本經(jīng)二抗后，在室溫下保存2 h；第5步，使用濃度為90%甘油PBS溶液封片，備用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，使用單因素組間方差分析（ANOVA）方法分析。如果P＞0.05，總體方差相等時，采用Tukey's post hoc方法配對比較進(jìn)行事后檢驗；如果 P≤0.05，總體方差不相等時，選擇Brown-Forsythe程序來從新分析。并采用不假設(shè)組間方差相等的事后檢驗，用Dunnett's T3方法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分比較

由表1可見，各組大鼠治療前神經(jīng)功能評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示治療前各組模型大鼠在神經(jīng)功能缺損程度方面不具有明顯差異。在治療后各時間點，各組大鼠神經(jīng)功能缺損均有所恢復(fù)，提示模型大鼠腦損傷的程度均有所改善，因此推測神經(jīng)元的數(shù)量均有所增加。其中B組、C組、D組和E組治療1星期后神經(jīng)功能評分與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組和E組治療2星期后神經(jīng)功能評分與 A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。E組治療1、2星期后神經(jīng)功能評分與C組和 D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分比較 （±s，分）

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分比較 （±s，分）

注：與 A組比較1）P＜0.01，2）P＜0.05；與B組比較3）P＜0.01，4）P＜0.05；與C組比較5）P＜0.01；與D組比較6）P＜0.05

組別 　n 　　治療前 　　治療1星期后 　　治療2星期后A組 　12 　2.92±0.29 　2.75±0.63 　1.50±0.67 B組 　12 　2.83±0.40 　1.83±0.721）　0.75±0.62 C組 　12 　3.00±0.02 　1.83±0.721）　0.83±0.58 D組 　12 　2.83±0.39 　1.58±0.511）　0.58±0.512）E組 　12 　2.75±0.45 　0.83±0.581）3）5）6）　0.15±0.071）4）5）6）

2.2 預(yù)標(biāo)記細(xì)胞檢測

對預(yù)標(biāo)記后的室管膜下區(qū)細(xì)胞檢測，同時檢測Dil標(biāo)記的F組細(xì)胞，觀察預(yù)標(biāo)記48 h后Dil染色的細(xì)胞層，確定在SVZ無明顯擴(kuò)散。詳見圖1。

圖1 預(yù)標(biāo)記48 h后Dil染色的細(xì)胞層

2.3 免疫熒光分析

由于SVZ的NSC在細(xì)胞的增殖分裂時有可能丟失了標(biāo)記的Dil，或者局部的干細(xì)胞增殖分化不攜帶Dil，因此我們同時計數(shù)了雙標(biāo)細(xì)胞，進(jìn)而觀察各組調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用。

2.3.1 各組不同時間點Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較

由表2可見，B組、C組、D組和E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示各治療方法對 Brdu+/NeuN+陽性細(xì)胞的表達(dá)均具有較好的促進(jìn)作用。D組和E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)與B組和C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。E組治療1、2星期后Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組不同時間點Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表2 各組不同時間點Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與A組比較1）P＜0.01；與B組比較2）P＜0.01；與C組比較3）P＜0.01；與D組比較4）P＜0.01

組別 　n 　　治療1星期后 　　治療2星期后A組 　6 　11.17±1.17 　12.25±1.54 B組 　6 　17.50±0.551）　20.08±2.571）C組 　6 　18.17±1.671）　20.25±2.381）D組 　6 　20.50±1.051）2）3）　25.42±1.311）2）3）E組 　6 　24.50±1.871）2）3）4）　44.58±2.151）2）3）4）

2.3.2 各組不同時間點Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較

由表3可見，B組、C組、D組和E組治療1、2星期后 Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示各治療方法對 Brdu+/GFAP+陽性細(xì)胞的表達(dá)均具有較好的促進(jìn)作用。D組和E組治療1、2星期后 Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與B組和C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。E組治療1、2星期后 Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 各組不同時間點Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表3 各組不同時間點Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與A組比較1）P＜0.01；與B組比較2）P＜0.01；與C組比較3）P＜0.01；與D組比較4）P＜0.01

組別 　n 　　治療1星期后 　　治療2星期后A組 　6 　11.83±0.75 　4.33±0.52 B組 　6 　16.83±1.471）　11.33±1.211）C組 　6 　16.50±1.641）　11.50±1.051）D組 　6 　19.67±0.821）2）3）　14.33±1.211）2）3）E組 　6 　22.50±1.381）2）3）4）　18.50±1.051）2）3）4）

2.4 激光共聚焦觀測

各組Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞均能夠向缺血周邊的紋狀體和缺血區(qū)皮質(zhì)遷移，同時在缺血損傷區(qū)周邊區(qū)能夠發(fā)現(xiàn)Dil/BrdU/NeuN或Dil/BrdU/GFAP標(biāo)記的細(xì)胞的共同表達(dá)，說明了Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞從神經(jīng)發(fā)生區(qū)向缺血損傷區(qū)遷移，分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，證明了各種療法均能調(diào)控SVZ細(xì)胞NSC的增殖、遷移、分化。

2.4.1 各組大鼠不同時間點Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較

Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)體現(xiàn)NSC分化為神經(jīng)元的三重標(biāo)記的細(xì)胞，從而體現(xiàn)了各法對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的調(diào)控作用。由表4可見，Dil+/ Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)在各治療組各時間點均有表達(dá)，治療1星期后陽性細(xì)胞表達(dá)到高峰，之后開始回落。B組、C組、D組和E組治療1、2星期后 Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)與 A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組和E組治療1、2星期后 Dil+/Brdu+/ NeuN+細(xì)胞計數(shù)與B組和C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。E組治療 1、2星期后 Dil+/Brdu+/ NeuN+細(xì)胞計數(shù)與 D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 各組不同時間點Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表4 各組不同時間點Dil+/Brdu+/NeuN+細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與A組比較1）P＜0.01；與B組比較2）P＜0.01；與C組比較3）P＜0.01；與D組比較4）P＜0.01

組別 　n 　　治療1星期后 　　治療2星期后A組 　6 　5.50±0.55 　1.00±0.63 B組 　6 　6.83±1.031）　4.83±0.751）C組 　6 　8.17±0.751）　4.67±0.521）D組 　6 　10.33±1.211）2）3）　6.50±1.051）2）3）E組 　6 　13.00±1.671）2）3）4）　8.33±1.201）2）3）4）

2.4.2 各組大鼠不同時間點Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較

Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)三組增殖遷移的細(xì)胞同時表達(dá)了 GFAP，體現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而體現(xiàn)各治療方法對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的調(diào)控作用。由表5可見，B組、C組、D組和E組治療1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組和E組治療1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與B組和C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。E組治療1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)與 D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表 5 各組大鼠不同時間點 Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較 （±s）

表 5 各組大鼠不同時間點 Dil+/Brdu+/GFAP+細(xì)胞計數(shù)比較 （±s）

注：與A組比較1）P＜0.01；與B組比較2）P＜0.01；與C組比較3）P＜0.01；與D組比較4）P＜0.01

組別 　n 　　治療1星期后 　　治療2星期后A組 　6 　6.00±0.89 　2.67±0.82 B組 　6 　9.50±1.041）　6.50±0.551）C組 　6 　9.67±1.031）　6.33±1.031）D組 　6 　11.50±0.551）2）3）　8.33±0.521）2）3）E組 　6 　14.17±0.751）2）3）4）　11.50±0.551）2）3）4）

3 討論

在本實驗過程中遇到了諸多問題，首先在造模開始之前，我們探討中風(fēng)的發(fā)病過程，缺血性中風(fēng)雖其本為虛，但急性期同時存在痰阻血瘀，痰濁和瘀血同時作為一種病理產(chǎn)物，也具有致病因素的含義，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用溶栓措施可迅速消除瘀血，再通復(fù)流，但同時發(fā)現(xiàn)隨之而來的再灌注損傷可致炎癥反應(yīng)加劇、血管滲出增加、腦水腫加重。從中醫(yī)學(xué)角度來看，這些均為非外顯之痰。在臨床上也觀察到患者常有喉中痰鳴、嘔吐甚至咳嗽咳痰的外顯痰癥表現(xiàn)。筆者認(rèn)為痰濁病理因素在腦缺血損傷過程也發(fā)揮了重要作用。在造模過程中，我們對缺血性中風(fēng)病證結(jié)合大鼠模型的建模思路、造模方法及模型評價體系進(jìn)行了積極的探索，但根據(jù)中醫(yī)學(xué)的間接研究，“證”是疾病的病因、病邪性質(zhì)等的概括，動物模型實驗只是一種外延法，只可能在一個局部或幾個方面與人類疾病相似。在實驗中，我們查閱大量文獻(xiàn)，選用以神經(jīng)功能評分評價宏觀表征，以 MCAO操作完善腦缺血的形成，建立了病證結(jié)合的評價體系。然而宏觀表征的觀測主觀性較強(qiáng)，而且有形之痰與無形之痰難于把握，捕捉到的該模型的表征有限，雖然我們經(jīng)過大量努力，并且研究大量國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，仍未獲得理想解決方法，所以我們下一步研究工作重點在于設(shè)計更具體、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋碚饔^察方案以期待得到更完善的表征體系。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0355

文章編號：1005-0957（2016）03-0355-04

收稿日期2015-11-11

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12531659）

作者簡介：周海純（1980 - ），男，副主任醫(yī)師

Laser Scanning Confocal Microscopical Study of the Effect of Acupuncture and Medicine on NSC Differentiation in Rats with Stroke of qi Deficiency and Blood Stasis Type

ZHOU Hai-chun1， ZHUANG Zhe1， GUO Rui-zhu2， WANG Chun-xia1， LI Xiang1， DONG Xu1， WU Di1， FENG Li-yuan1， CAI Guo-feng1.
1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Harbin 150001，China； 2.Harbin Emergency Center，Harbin 150056，China； 3.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China

［Abstract］Objective To investigate the effect of cluster needling at scalp points plus gavage of modified Buyang Huanwu decoction on NSC differentiation in rats with ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis type. Methods A model of qi deficiency and blood stasis syndrome was made using healthy rats. Dil dye was given for pre-labelling after the success of model making. The rats were randomized into groups A， B， C， D， E and F. Group F consisted of 4 rats and each of the other groups，of 12 rats. A rat model of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis type was made by MCAO at 48 hrs after pre-labelling. After the success of model making， group A was the model group， group B was treated by cluster needling at scalp points， group C was treated by an oral gavage of Buyang Huanwu decoction， group D was treated by an oral gavage of modified Buyang Huanwu decoction， group E was treated by cluster needling at scalp points plus an oral gavage of modified Buyang Huanwu decoction and group F was the sham operation group. The rats were sacrificed at various time points respectively and the materials were taken. By nerve function assessment， double immunofluorescence staining and laser scanning confocal microscopy， a comparative study was conducted to investigate the effects of different treatments on NSC differentiation. Results There was a statistically significant difference in the nerve function score between group B， C， D， E or F and group A after one week of treatment （P＜0.01），between group B or E and group A after two weeks of treatment （P＜0.05，P＜0.01） and between group E and group C or D after one and two weeks of treatment （P＜0.01，P＜0.05）. After one and two weeks of treatment， there were statistically significant differences in Brdu+/NeuN+ cell count， Brdu+/GFAP+ cell count， Dil+/Brdu+NeuN+ cell count and Dil+/Brdu+/GFAP+ cell count between group B， C， D or E and group A （P＜0.01）， between group D or E and group B or C （P＜0.01） and between groups E and D （P＜0.01）. Conclusions Various treatments have a promoting effect on nerve stem cell differentiation in the rats. Of various treatments， cluster needling at scalp points plus gavage of modified Buyang Huanwu decoction has the best therapeutic effect.

［Key words］Acupuncture therapy； Stroke； Qi deficiency and blood stasis； Buyang Huanwu decoction； Combined acupuncture and medicine； Cluster needling； Rats； Scalp acupuncturee