電針、埋線對小鼠嗎啡戒斷和耐受調(diào)整作用的對比研究

王穎，劉文，王俊娟，陳莎莎，熊鵬，賈亞妹，柏燦，薛紅（.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 60075；.陽澄湖鎮(zhèn)度假區(qū)衛(wèi)生院，蘇州 538）

?

·動物實驗·

電針、埋線對小鼠嗎啡戒斷和耐受調(diào)整作用的對比研究

王穎1，劉文2，王俊娟1，陳莎莎1，熊鵬1，賈亞妹1，柏燦1，薛紅1
（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；2.陽澄湖鎮(zhèn)度假區(qū)衛(wèi)生院，蘇州 215138）

【摘要】目的 通過對嗎啡戒斷、耐受小鼠進(jìn)行電針和穴位埋線治療，觀察小鼠海馬和脊髓中 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受體和膽囊收縮素（cholecystokinin， CCK）的表達(dá)水平，探討電針和埋線對嗎啡戒斷后戒斷、耐受小鼠調(diào)整作用的差異。方法 將56只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為戒斷空白組、戒斷模型組、戒斷埋線組、戒斷電針組和耐受空白組、耐受模型組、耐受埋線組、耐受電針組，每組7只。嗎啡戒斷模型根據(jù)“7 d遞增成癮法”皮下注射鹽酸嗎啡注射液，戒斷空白組在相同時間點注射等量生理鹽水，戒斷電針組小鼠每次注射鹽酸嗎啡注射液 15 min 后，使用韓式穴位神經(jīng)刺激儀（HANS-200）電針刺激雙側(cè)腎俞穴；戒斷埋線組于注射鹽酸嗎啡注射液15 min 后，將0.5 cm鉻腸線埋入雙側(cè)腎俞穴內(nèi)。第7天早上10點，腹腔注射鹽酸納洛酮注射液催癮（4 mg/kg），并觀察小鼠戒斷反應(yīng)。根據(jù)阿片依賴戒斷癥狀柳田知司測評量表評分，并以酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（Elisa）檢測海馬和脊髓NMDA受體和CCK含量。按10 mg/kg皮下注射嗎啡建立嗎啡耐受模型。耐受空白組在相同的時間注射10 mL/kg的生理鹽水，耐受埋線組于建立模型第1天在腎俞穴埋線治療，耐受電針組在建立模型第1天起電針腎俞穴。經(jīng)7 d治療后，以Elisa方法檢測海馬和脊髓的 NMDA受體和CCK含量。結(jié)果 戒斷模型組海馬NR2B和CCK表達(dá)與戒斷空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷電針組海馬NR2B表達(dá)與戒斷模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組和戒斷電針組海馬 CCK表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷模型組小鼠脊髓NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與戒斷空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷電針組脊髓NR2A、NR2B表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受模型組海馬NR1、NR2B、CCK表達(dá)與耐受空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組海馬CCK表達(dá)與耐受模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受電針組海馬NR1表達(dá)與耐受模型組和耐受埋線組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組和耐受電針組脊髓CCK表達(dá)與耐受模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 腎俞穴穴位埋線及電針治療對減輕嗎啡耐受及戒斷均有治療效果，且電針治療優(yōu)于穴位埋線。

【關(guān)鍵詞】針刺療法；埋線；電針；穴，腎俞（BL23）；嗎啡依賴；NMDA受體；膽囊收縮素；小鼠；埋藏療法

嗎啡依賴又稱嗎啡戒斷，包括身體依賴和精神依賴［1］，精神依賴表現(xiàn)為患者對阿片類藥物的強(qiáng)烈的心理渴求，軀體依賴是指長期服用戒斷性藥物，突然停止藥物給予而產(chǎn)生嗎啡戒斷癥狀。嗎啡耐受是指長期使用嗎啡后，嗎啡的鎮(zhèn)痛效果降低，為了保持與之前相同的鎮(zhèn)痛效果，需增加藥物的使用量。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受體是離子型谷氨酸受體，包括 NR1、NR2A、NR2B 3個主要亞基，NMDA 受體通道在學(xué)習(xí)記憶中開啟［2］，是學(xué)習(xí)和記憶塑造過程中的極其重要的受體之一。目前研究表明嗎啡鎮(zhèn)痛耐受大鼠的脊髓離子型谷氨酸受體 NMDA 受體的水平增加［3］，腹側(cè)被蓋區(qū)內(nèi)注射 NMDA受體拮抗劑（MK-801）可以明顯緩解嗎啡戒斷大鼠的戒斷癥狀［4］，鞘內(nèi)注射NOS反義寡核苷酸能減少嗎啡戒斷大鼠脊髓和腦干的NR1 mRNA的表達(dá)，從而抑制大鼠的戒斷反應(yīng)［5］，由此說明NMDA受體與嗎啡耐受、戒斷和戒斷的形成有關(guān)。膽囊收縮素（cholecystokinin， CCK）是腦內(nèi)含量最高的神經(jīng)肽之一，也是作用最強(qiáng)的內(nèi)源性抗阿片肽，其廣泛分布于大腦皮層、海馬等神經(jīng)系統(tǒng)中［6-7］，作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)發(fā)揮重要作用［8］，在調(diào)節(jié)焦慮等情感和學(xué)習(xí)認(rèn)知過程中也發(fā)揮著顯著作用［9］。因此，筆者認(rèn)為NMDA受體和CCK均參與了嗎啡戒斷和耐受的形成。

脊髓、海馬均為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，脊髓是傳導(dǎo)感覺及運動的重要通路，也與痛覺過敏關(guān)系密切；海馬為邊緣系統(tǒng)，參與了情緒、學(xué)習(xí)、記憶等活動，亦為獎賞通路中的組成部分，NMDA受體和CCK受體均廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

針灸作為傳統(tǒng)的中醫(yī)療法，其安全、副反應(yīng)小，易于讓患者接受，但對于嗎啡戒斷和耐受的針灸治療方法目前多局限于電針或者針?biāo)幗Y(jié)合，較少應(yīng)用埋線療法，而埋線是針灸治療的創(chuàng)新模式。故本研究以嗎啡戒斷后戒斷及耐受小鼠模型為基礎(chǔ)，采取電針及穴位埋線兩種方法治療，觀察這兩種方法對小鼠脊髓和海馬中NMDA受體及CCK含量影響，通過了解這兩種方法的治療結(jié)果間的差異，為臨床選擇合適的方法治療嗎啡戒斷、耐受提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

56只健康雄性 C57BL/6J近交系小鼠，清潔級，5周齡，體重（12±2）g，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院提供，小鼠合格批號［SCXK（川）2009-09］。將小鼠分別放在鼠籠，并將籠子放在清潔隔離單元內(nèi)，保持隔音、恒溫（23 ±1）℃、通風(fēng)、相對濕度60%～65%，自由進(jìn)食飲水。

1.2 分組與造模

將56只C57BL/6J近交系小鼠，隨機(jī)分為兩組，分別為嗎啡戒斷組和嗎啡耐受組，每組28只小鼠。

1.2.1 嗎啡戒斷模型

利用隨機(jī)數(shù)字表將 28只小鼠隨機(jī)分為戒斷空白組、戒斷模型組、戒斷埋線組、戒斷電針組，每組 7 只。根據(jù) Gang Lu的 7 d遞增成癮法［10］分別于每日早上8：00和晚上8：00皮下注射嗎啡，其中第1天的劑量為20 mg/kg，第2天為40 mg/kg，第3天為60 mg/kg，第4天為80 mg/kg，第5天、第6天為100 mg/kg，第7天為100 mg/kg（只在早上注射），戒斷空白組每日在相同的時間范圍內(nèi)注射與嗎啡模型等量 0.9% 氯化鈉注射液，并于第7天末次注射2 h后予納洛酮催癮。按照阿片依賴戒斷癥狀柳田知司測評量表觀察小鼠1 h內(nèi)戒斷癥狀并進(jìn)行評分，每15 min記錄1次。

1.2.2 嗎啡耐受模型

利用隨機(jī)數(shù)字表將 28只小鼠隨機(jī)分為耐受空白組、耐受模型組、耐受埋線組、耐受電針組，每組 7只。采用每日 2次，連續(xù) 7 d皮下注射嗎啡，劑量為10 mg/kg，耐受空白組每日注射10 mg/kg的0.9%氯化鈉注射液［11］。

1.3 治療方法

戒斷電針組、耐受電針組于早上注射嗎啡30 min后將小鼠固定并進(jìn)行電針治療。參照《實驗針灸學(xué)》取小鼠“腎俞”穴（BL23）。針尖向內(nèi)下方進(jìn)針約4 mm，然后連接韓式電針儀，采用經(jīng)針模式，頻率為2/15 Hz，電流為0.2 mA，留針15 min，電針后立即將小鼠放回籠內(nèi)。每日1次，連續(xù)治療7 d。

戒斷埋線組、耐受埋線組根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］，在實驗第1天上午注射鹽酸嗎啡注射液后，采用埋線治療。取小鼠“腎俞”穴（BL23）。將長約0.3 cm的鉻腸線埋入穴位肌層或皮下組織內(nèi)，然后繼續(xù)接受嗎啡注射，不予針刺。

戒斷模型組、耐受模型組造模后于針刺時間捆綁固定，以平衡捆綁刺激等影響。戒斷空白組、耐受空白組每日注射同等量氯化鈉注射液，于注射后捆綁固定，不予其他處理。

1.4 觀察指標(biāo)

嗎啡耐受組測定痛閾采用甩尾法，分別于模型建立前1 d測定基線，模型建立第 1、3、5、7 天注射嗎啡后30 min，將小鼠尾巴后1/3與前2/3的交界處放置于光熱測痛儀散熱孔上，開啟測痛儀，當(dāng)小鼠尾部甩開時，測痛儀自動停止計時，痛閾儀上的時間即為小鼠痛閾，連續(xù)測量3次，取平均值。

1.5 樣本處理

實驗第7天，于電針后3 h，采用頸椎脫臼法處死全部小鼠。參考 George Paxinos［12］小鼠大腦立體定位圖譜，取其腦部海馬，脊髓，迅速放入-80℃冰箱內(nèi)保存。 Elisa操作具體步驟參照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊選用LSD檢驗，方差不齊選用Tamhane's T2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 戒斷組各組嗎啡戒斷評分比較

本實驗嗎啡依賴模型建立是根據(jù)7 d遞增成癮法，在最后一次皮下注射嗎啡后2 h，予腹腔注射4 mg/kg納洛酮進(jìn)行催促戒斷，主要表現(xiàn)有濕狗樣抖、腹瀉、跳躍，并出現(xiàn)了不同程度的舔毛、震顫、激惹狀態(tài)、煩躁不安、咬牙、體重下降等表現(xiàn)，結(jié)果表明嗎啡戒斷和戒斷的動物模型建立成功。

由表 1可見，戒斷模型組嗎啡戒斷評分與戒斷空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組和戒斷電針組嗎啡戒斷評分與戒斷模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組嗎啡戒斷評分與戒斷電針組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 戒斷組各組嗎啡戒斷評分比較 （±s，分）

表1 戒斷組各組嗎啡戒斷評分比較 （±s，分）

注：與戒斷空白組比較1）P＜0.05；與戒斷模型組比較2）P＜0.05

組別 　n 　　嗎啡戒斷評分戒斷空白組 　7 　3.00±5.20戒斷模型組 　7 　24.21±6.751）戒斷埋線組 　7 　18.43±3.692）戒斷電針組 　7 　17.21±3.402）

2.2 電針、埋線對嗎啡戒斷小鼠海馬NR1、NR2B、CCK表達(dá)的影響

由表2可見，戒斷模型組海馬 NR1表達(dá)與戒斷空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷模型組海馬NR2B和CCK表達(dá)與戒斷空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組和戒斷電針組海馬NR1表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷埋線組海馬NR2B表達(dá)與戒斷模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷電針組海馬NR2B表達(dá)與戒斷模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組和戒斷電針組海馬CCK表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組海馬NR1、NR2B、CCK表達(dá)與戒斷電針組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 戒斷組各組海馬NR1、NR2B、CCK 表達(dá)比較 （±s）

表2 戒斷組各組海馬NR1、NR2B、CCK 表達(dá)比較 （±s）

注：與戒斷空白組比較1）P＜0.05；與戒斷模型組比較2）P＜0.05

組別 　n 　NR1 　NR2B 　CCK戒斷空白組 　7 　29.19±2.70 15.57±3.58 　36.86±1.70戒斷模型組 　7 　29.12±2.01 19.30±1.241）　41.83±2.391）戒斷埋線組 　7 　28.26±2.23 17.48±2.78 　36.50±1.722）戒斷電針組 　7 　29.79±1.03 15.51±4.192）　36.20±2.252）

2.3 電針、埋線對嗎啡戒斷小鼠脊髓 NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)的影響

由表3可見，戒斷模型組小鼠脊髓NR1表達(dá)與戒斷空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷模型組小鼠脊髓NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與戒斷空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷埋線組脊髓NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷電針組脊髓 NR2A、NR2B表達(dá)與戒斷模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。戒斷電針組脊髓CCK表達(dá)與戒斷模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。戒斷埋線組脊髓NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與戒斷電針組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 嗎啡耐受空白組和模型組痛閾值比較

由表 4可見，耐受模型組治療前痛閾值與耐受空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。耐受空白組小鼠第1、3、5、7天痛閾值與同組治療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。耐受模型組小鼠第1、3、5天痛閾值與同組治療前比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受模型組第7天痛閾值與同組治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明模型組的痛閾值達(dá)到初始水平，提示嗎啡耐受模型成功。

2.5 電針、埋線對嗎啡耐受小鼠脊髓 NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)的影響

由表5可見，耐受模型組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與耐受空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組和耐受電針組脊髓NR1、NR2A、NR2B表達(dá)與耐受模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。耐受埋線組和耐受電針組脊髓CCK表達(dá)與耐受模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)與耐受電針組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 電針和埋線對嗎啡耐受小鼠海馬NR1、NR2B、CCK表達(dá)的影響

由表6可見，耐受模型組海馬NR1、NR2B、CCK表達(dá)與耐受空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組海馬CCK表達(dá)與耐受模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受埋線組海馬NR1、NR2B表達(dá)與耐受模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。耐受電針組海馬NR1表達(dá)與耐受模型組和耐受埋線組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。耐受電針組海馬NR2B、CCK表達(dá)與耐受模型組和耐受埋線組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 戒斷組各組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)比較 （±s）

表3 戒斷組各組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)比較 （±s）

注：與戒斷空白組比較1）P＜0.05；與戒斷模型組比較2）P＜0.05

組別 　n 　NR1 　NR2A 　NR2B 　CCK戒斷空白組 　7 　10.63±3.44 　14.89±1.68 　11.76±1.22 　29.21±5.73戒斷模型組 　7 　10.52±2.18 　 16.89±1.911）　 13.35±1.351）　 34.05±2.371）戒斷埋線組 　7 　11.54±2.09 　15.53±1.25 　12.12±1.50 　30.57±4.12戒斷電針組 　7 　10.25±2.71 　 15.02±1.502）　 11.34±1.082）　31.44±2.99

表4 嗎啡耐受空白組和模型組造模前后痛閾值比較 （±s）

表4 嗎啡耐受空白組和模型組造模前后痛閾值比較 （±s）

注：與同組治造模前比較1）P＜0.05

組別 　n 　　造模前 　　第1天痛閾值 　　第3天痛閾值 　　第5天痛閾值 　　第7天痛閾值耐受空白組 　7 　1.69±0.49 　1.69±0.52 　1.90±0.20 　2.01±0.22 　1.96±0.33耐受模型組 　7 　1.76±0.33 　 3.68±1.961）　 4.50±1.731）　 3.09±0.641）　1.87±0.36

表5 耐受組各組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)比較 （±s）

表5 耐受組各組脊髓NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)比較 （±s）

注：與耐受空白組比較1）P＜0.05；與耐受模型組比較2）P＜0.05

組別 　n 　NR1 　NR2A 　NR2B 　CCK耐受空白組 　7 　13.17±2.85 　13.49±1.60 　10.71±0.89 　26.02±4.70耐受模型組 　7 　 10.44±1.821）　 15.11±1.291）　 11.79±0.531）　 32.56±5.211）耐受埋線組 　7 　11.66±2.67 　15.00±1.22 　11.40±0.66 　 26.02±4.432）耐受電針組 　7 　11.12±2.03 　14.59±1.37 　11.41±1.17 　 25.85±3.582）

表6 耐受組各組海馬NR1、NR2B、CCK 表達(dá)比較 （±s）

注：與耐受空白組比較1）P＜0.05；與耐受模型組比較2）P＜0.05；與耐受埋線組比較3）P＜0.05

組別 　n 　NR1 　NR2B 　CCK耐受空白組 7 30.09±1.62 　14.44±2.56 　36.45±3.27耐受模型組 7 27.96±1.181）　19.41±1.281）　39.43±1.761）耐受埋線組 7 28.50±1.81 　16.16±3.49 　36.76±2.822）耐受電針組 7 30.53±1.552）3）　16.29±3.75 　38.96±0.93

3 討論

嗎啡戒斷反應(yīng)、耐受與依賴均為長期使用嗎啡后對機(jī)體的毒性作用，這與中醫(yī)學(xué)的病因病機(jī)相同［13］。有研究［11，14-15］證實，中藥、針灸在嗎啡耐受和戒斷的治療過程中取得了一定進(jìn)展，且治療手段多樣。

NMDA受體的嗎啡鎮(zhèn)痛作用在臨床上應(yīng)用較多，但有證據(jù)表明，嗎啡等阿片類藥物在鎮(zhèn)痛的同時亦可產(chǎn)生痛覺過敏［16］，一次給予阿片類藥物，可以使痛閾升高，但反復(fù)給予則鎮(zhèn)痛效果減弱［17］，為保持與之前相同的鎮(zhèn)痛效果，需增加藥量，此即為阿片耐受。目前對于嗎啡戒斷、耐受機(jī)制的研究包括了阿片受體、神經(jīng)遞質(zhì)、受體后機(jī)制3個環(huán)節(jié)。CCK是腦內(nèi)含量最高的一種神經(jīng)肽，也是作用最強(qiáng)的內(nèi)源性抗阿片肽之一，其廣泛分布于大腦皮層、海馬等神經(jīng)系統(tǒng)中，作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)發(fā)揮重要作用［8］。CCK、CCK受體和內(nèi)源性阿片肽、阿片受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布具有密切關(guān)系［18-19］，且Lee YM等［20］發(fā)現(xiàn)，腦和脊髓的CCK和內(nèi)源性阿片肽的分布有明顯的重疊。長期使用嗎啡后，嗎啡與體內(nèi)阿片受體結(jié)合，從而負(fù)反饋抑制了內(nèi)源性阿片肽，此時停止使用嗎啡，注射納洛酮后，可完全阻斷嗎啡與阿片受體的結(jié)合，加之內(nèi)源性阿片肽匱乏，去甲腎上腺素能系統(tǒng)、乙酰膽堿能系統(tǒng)、多巴胺系統(tǒng)等不能保持正常的運行秩序，從而導(dǎo)致嗎啡戒斷者出現(xiàn)戒斷癥狀［21-22］。

本實驗嗎啡依賴模型建立是7 d遞增成癮法。戒斷模型組的戒斷評分明顯高于空白組（P＜0.05），說明嗎啡戒斷模型成功建立。與戒斷模型組相比，戒斷埋線組和戒斷電針組的戒斷評分明顯降低，提示電針及埋線均可明顯緩解小鼠的戒斷癥狀。嗎啡戒斷模型組小鼠海馬和脊髓 NR1與戒斷空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而海馬 NR2B、CCK的表達(dá)及脊髓NR2A、NR2B、CCK較空白組升高（均P＜0.05）。CCK表達(dá)升高與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致，說明 CCK參與了嗎啡戒斷的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)用嗎啡后NMDA受體各亞型的表達(dá)結(jié)果并不一致，有升高［23-24］、降低［25］或不變［26］，Bajo M等［27］觀察了阿片耐受大鼠邊緣系統(tǒng)中橫核和中央杏仁核NR2A、NR2B mRNA及蛋白水平的變化，亦發(fā)現(xiàn)mRNA及蛋白表達(dá)水平不平衡。本實驗結(jié)果顯示，戒斷模型組脊髓和海馬中NMDA受體亞型NR1表達(dá)與戒斷空白組并無統(tǒng)計學(xué)差異，其可能是 NR1并不參與嗎啡戒斷，亦可能是 mRNA和蛋白表達(dá)不平行所致，但NR2A、NR2B均有明顯的升高趨勢，故NMDA受體參與嗎啡戒斷的形成與文獻(xiàn)報道是一致的。與戒斷模型組相比，戒斷埋線組和戒斷電針組小鼠海馬、脊髓 NR1 表達(dá)均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，戒斷埋線組海馬 CCK表達(dá)較戒斷模型組降低（P＜0.05）；戒斷電針組海馬NR2B、CCK和脊髓NR2A、NR2B表達(dá)較戒斷模型組均顯著降低（P＜0.05）；戒斷埋線組海馬NR1、NR2B 和脊髓 NR1、NR2A、NR2B、CCK表達(dá)較戒斷模型組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），戒斷電針組海馬NR1和脊髓NR1、CCK表達(dá)較戒斷模型組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。說明電針及埋線對嗎啡戒斷小鼠可以通過降低 NMDA受體及 CCK的表達(dá)產(chǎn)生治療作用。

本實驗結(jié)果表明，嗎啡耐受模型組小鼠海馬、脊髓NR1的表達(dá)較耐受空白組降低，而海馬NR2B、CCK及脊髓NR2A、NR2B、CCK的表達(dá)較耐受空白組升高，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示嗎啡耐受使CCK、NMDA受體亞型NR2A、NR2B上調(diào)，而降低NR1水平。Mao J等［28］研究發(fā)現(xiàn)腰髓使用NMDA受體拮抗劑可以阻斷嗎啡耐受的產(chǎn)生，而頸髓使用卻不能阻斷，故考慮嗎啡耐受的產(chǎn)生部位在脊髓。而嗎啡戒斷和“獎賞通路”有關(guān)，中腦邊緣系統(tǒng)是戒斷藥物發(fā)揮獎賞效應(yīng)的主要神經(jīng)通路，而阿片等戒斷藥物導(dǎo)致神經(jīng)元的可塑性變化是導(dǎo)致戒斷和復(fù)吸的基礎(chǔ)［29］。 故以往研究嗎啡戒斷、戒斷多集中于中腦邊緣系統(tǒng)，而研究嗎啡耐受多集中于脊髓水平。脊髓、海馬均為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而脊髓為較低水平，是傳導(dǎo)感覺及運動的重要通路，也與痛覺過敏關(guān)系密切；海馬為較高水平的邊緣系統(tǒng)，參與了情緒、學(xué)習(xí)、記憶等活動，亦為獎賞通路中的組成部分。本實驗結(jié)果顯示，嗎啡戒斷和耐受模型 NMDA受體和CCK的表達(dá)在脊髓、海馬兩個不同水平的變化趨勢一致，說明慢性嗎啡給予不僅影響了脊髓水平的痛覺傳導(dǎo)，也影響了海馬參與的情緒、學(xué)習(xí)、記憶活動。經(jīng)過電針和埋線治療后，NMDA受體與CCK水平均得到了不同程度的調(diào)整，耐受埋線組海馬和脊髓 CCK表達(dá)較耐受模型組降低（P＜0.05）；耐受電針組海馬NR1升高和脊髓CCK降低（P＜0.05）；耐受埋線組海馬NR1、NR2B和脊髓NR1、NR2A、NR2B表達(dá)較耐受模型組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；耐受電針組海馬 NR2B、CCK和脊髓NR1、NR2A、NR2B表達(dá)較耐受模型組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。說明電針及埋線可以調(diào)整嗎啡耐受小鼠脊髓和海馬中NMDA受體和CCK的水平而產(chǎn)生治療作用。

嗎啡戒斷電針組與埋線組相比，電針組小鼠脊髓和海馬中 NMDA受體及 CCK的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但結(jié)合整體，戒斷埋線組海馬 CCK降低明顯，而戒斷電針組海馬NR2B、CCK和脊髓NR2A、NR2B均明顯降低（P＜0.05），故電針對嗎啡戒斷的調(diào)整在分子水平上較穴位埋線范圍更廣，且戒斷電針組NMDA受體和 CCK整體水平較戒斷埋線組更低，結(jié)合嗎啡戒斷癥狀，電針組的戒斷癥狀評分略低于埋線組，故考慮電針治療嗎啡戒斷的效果比穴位埋線佳。嗎啡耐受電針組小鼠海馬 NR1較耐受埋線組升高（P＜0.05），其余NMDA受體亞型和CCK均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但穴位埋線中所用羊腸線的吸收時間一般為 10～15 d，嗎啡耐受為嗎啡長期作用的結(jié)果，可能經(jīng)短時間治療電針和埋線的效果并不明顯，但從本實驗的結(jié)果來看，電針對嗎啡耐受小鼠的治療效果略優(yōu)于埋線組。因此，在臨床選擇治療嗎啡戒斷和耐受的方法時，可以選擇電針治療。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李倩，劉萍.阿片類藥物依賴性機(jī)制研究進(jìn)展［J］.齊魯藥事，2006，25（9）：548-549.

［2］ 白俊偉，徐波，曹桂霞.記憶儲存的分子機(jī)制［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9（48）：100-102.

［3］ Wong CS， Hsu MM， Chou YY， et a1. Morphine tolerance increases ［3H］ MK-801 binding affinity and constitutive neuronal nitric oxide synthase expression in rat spinal cord［J］. Br J Anaesth， 2000，85（4）：587-591.

［4］ 王惠玲，趙晏，向曉輝，等.腹側(cè)被蓋區(qū)微注射 MK-801對大鼠嗎啡戒斷癥狀的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，25（16）：1448-1451.

［5］ 曹君利，張勵才，曾因明，等.鞘內(nèi)注射 NOS反義寡核苷酸抑制嗎啡戒斷大鼠脊髓和腦干NMDA1A受體mRNA表達(dá)的增加［J］.生理學(xué)報，2001，53（1）：27-31.

［6］ 趙麗，叢斌，吳嬡嬡，等.嗎啡對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元 CCK受體mRNA表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22（4）：479-483.

［7］ Greenwood RS， Godar SE， Reaves TA， et al. Cholecystokinin in hippocampal pathways［J］. J Comparat Neurol， 1981，203（3）：335-350.

［8］ Beinfeld MC. An introduction to neuronal cholecystokinin［J］. Peptides， 2001，22（8）：1197-1200.

［9］ Hebb AL， Poulin JF， Roach SP， et al. Cholecystokinin and endogenous opioid peptides: interactive influence on pain， cognition， and emotion［J］. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 2005，29 （8）：1225-1238.

［10］ Lu G， Zhou QX， Kang S， et al. Chronic morphine treatment impaired hippocampal long-term potentiation and spatial memory via accumulation of extracellular adenosine acting on adenosine A1 receptors［J］. J Neurosci， 2010，30（14）：5058-5070.

［11］ 王珂，劉惠芬，周文華.“足三里”和“腎俞”穴位埋線對大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和運動行為敏化的影響［J］.中國針灸，2008，28（7）：509-513.

［12］ George Paxinos， Keith B.J. Franklin. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates［M］. London: Academic Press， 2001.

［13］ 曹陽，王文萍，郭雋馥，等.中藥復(fù)方對小鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受影響的研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15（30）：3554-3556.

［14］ 歐桂珍，崔瑾，鄒陽，等.艾灸“百會”穴對小鼠鹽酸嗎啡成癮行為影響的實驗研究［J］.中國針灸，1998，18（9）：549-550.

［15］ 司馬蕾，劉波濤，厲建春，等.電針對骨癌痛-嗎啡耐受大鼠痛行為和降鈣素基因相關(guān)肽的影響［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2013，22（5）：388-390.

［16］ Laulin JP， Célèrier E， Larcher A， et al. Opiate tolerance to daily heroin administration: an apparent phenomenon associated with enhanced pain sensitivity［J］. Neurosci， 1999，89（3）：631-636.

［17］ Laulin JP， Larcher A， Célèrier E， et al. Long-lasting increased pain sensitivity in rat following exposure to heroin for the first time［J］. Eur J Neurosci， 1998，10（2）：782-785.

［18］ Crawley JN， Corwin RL. Biological actions of cholecystokinin［J］. Peptides， 1994，15（4）：731-755.

［19］ Hebb AL， Poulin JF， Roach SP， et al. Cholecystokinin and endogenous opioid peptides: interactive influence on pain， cognition， and emotion［J］. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 2005，29 （8）：1225-1238.

［20］ Lee YM， Beinborn M， McBride EW， et al. The human brain cholecystokinin-B/gastrin receptor. Cloning and characterization［J］. J Biol Chem， 1993，268（11）：8164-8169.

［21］ Adams WJ， Yeh SY， Woods LA， et al. Drug-test interaction as a factor in the development of tolerance to the analgesic effect of morphine［J］. J Pharmacol Exp Ther， 1969，168（2）：251-257.

［22］ Kayan S， Woods LA， Mitchell CL. Experience as a factor in the development of tolerance to the analgesic effect of morphine［J］. Eur J Pharmacol， 1969，6（3）：333-339.

［23］ 楊明理，錢剛，羅素元，等.嗎啡條件性位置偏愛大鼠紋狀體谷氨酸遞質(zhì)含量和NR2B亞基表達(dá)變化［J］.解剖學(xué)雜志，2012，35（1）：69-71.

［24］ Narita M， Aoki T， Suzuki T. Molecular evidence for the involvement of NR2B subunit containing N-methyl-D-aspartate receptors in the development of morphine-induced place preference［J］. Neuroscience，2000，101（3）：601-606.

［25］ Siggins GR， Martin G， Roberto M， et al. Glutamatergic transmission in opiate and alcohol dependence［J］. Ann N Y Acad Sci， 2003，（1003）：196-211.

［26］ Lim G， Wang SQ， Sung B， et al. Expression of spinal NMDA receptor and PKCgamma after chronic morphine is regulated by spinal glucocorticoid receptor［J］. J Neuroscience， 2005， 25（48）：11145-111 54.

［27］ Bajo M， Crawford EF， Roberto M， et al. Chronic morphine treatment alters expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunits in the extended amygdale［J］. J Neurosci Res， 2006，83（4）：532-537.

［28］ Mao J， Price DD， Zhu J. The inhibition nitric oxide-activated-vated poly（ADP-ribose） synthetase atenuates transsynaptic alteration of spinal cord dorsal horn neurons and neuropathic pain in the rat［J］. Pain， 1997，72（3）：355-366.

［29］ Kalivas PW， O'Brien C. Drug addiction as a pathology of staged neuroplasticity［J］. Neuropsychopharmacology， 2008，33（1）：166-180.

【中圖分類號】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0349

文章編號：1005-0957（2016）03-0349-06

收稿日期2015-09-30

基金項目：四川省教育廳基金項目（2005B005）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金項目（ZRMS201359）

作者簡介：王穎（1988 - ），女，2012級碩士生

通信作者：薛紅（1971 - ），女，研究員，Email：cdxuehong@126.com

Comparative Study of the Regulating Effects of Electroacupuncture Versus Catgut Embedding on Mouse Morphine Withdrawal and Tolerance

WANG Ying1， LIU Wen2， WANG Jun-juan1， CHEN Sha-sha1， XIONG Peng1， JIA Ya-mei1， BAI Can1，XUE Hong1.
1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China； 2.Yangchenghu Town Resort Area Hospital，Suzhou 215138，China

［Abstract］Objective To observe expression levels of N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor and cholecystokinin （CCK） in the hippocampus and spinal cord in morphine withdrawal or tolerance mice treated by electroacupuncture or catgut embedding and explore the difference between the regulating effects of electroacupuncture and catgut embedding on morphine withdrawal and tolerance. Methods Fifty-six male C57BL/6J mice were randomly allocated to withdrawal control， withdrawal model， withdrawal catgut embedding and withdrawal electroacupuncture groups， and tolerance control， tolerance model， tolerance catgut embedding and tolerance electroacupuncture groups， 7 mice in each group. A model of morphine withdrawal was made by subcutaneous injection of morphine hydrochloride using 7-day increasing addiction method. The withdrawal control group was injected with an equal volume of normal saline at the same time points. In the withdrawal electroacupuncture group， electroacupuncture at bilateral points Shenshu was performed using a Han's acupoint nerve stimulation device （HANS-200） at 15 min after an injection of morphine hydrochloride. In the withdrawal catgut embedding group， 0.5 cm chromic catgut was embedded in bilateral points Shenshu at 15 min after an injection of morphine hydrochloride. Addiction was promoted by intraperitoneal injection of naloxone 4 mg/kg at 10 o'clock on the seventh day's morning and Withdrawal reactions were observed in the mice. The score was recorded using the Ryuta Tomoji opioid withdrawal symptoms evaluation scale. NMDA receptor and CCK contents in the hippocampus and spinal cord were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. A model of morphine tolerance was made by subcutaneous injection of morphine 10 mg/kg. The tolerance control group was injected with tolerance normal saline 10 ml/kg at the same time. In the tolerance catgut embedding group， catgut was embedded in point Shenshu at the first day after model making. In the tolerance electroacupuncture group， point Shenshu was given electroacupuncture at the first day after model making. After seven days of treatment， NMDA receptor and CCK contents in the hippocampus and spinal cordwere measured by ELISA. Results There were statistically significant differences in hippocampal NR2B and CCK expressions between the withdrawal model and withdrawal control groups （P＜0.05）. There was a statistically significant difference in hippocampal NR2B expression between the withdrawal electroacupuncture and withdrawal model groups （P＜0.05）. There was a statistically significant difference in hippocampal CCK expression between the withdrawal catgut embedding or withdrawal electroacupuncture group and the withdrawal model group （P＜0.05）. There were statistically significant differences in spinal cord NR2A， NR2B and CCK expressions between the withdrawal model and withdrawal control groups （P＜0.05）. There were statistically significant differences in spinal cord NR2A and NR2B expressions between the withdrawal electroacupuncture and withdrawal model groups （P＜0.05）. There were statistically significant differences in hippocampal NR2A， NR2B and CCK expressions between the tolerance model and tolerance control groups （P＜0.05）. There was a statistically significant difference in hippocampal CCK expression between the tolerance catgut embedding and tolerance model groups （P＜0.05）. There was a statistically significant difference in hippocampal NR1 expression between the tolerance electroacupuncture group and the tolerance model or tolerance catgut embedding group （P＜0.05）. There was a statistically significant difference in spinal cord CCK expression between the tolerance catgut embedding or withdrawal electroacupuncture group and the tolerance model group （P＜0.05）. Conclusions Both catgut embedding and electroacupuncture at point Shenshu have a reducing effect on morphine tolerance and withdrawal. The therapeutic effect of electroacupuncture is better than that of catgut embedding.

［Key words］Acupuncture therapy； Catgut embedding therapy； Electroacupuncture； Point， Shenshu； Morphine dependence；NMDA receptor； Cholecystokinin； Mice； Embedding therapy