甘草內(nèi)生真菌多樣性及群落結構

趙 翀，廖 萍，張瀚能，楊雅琳，張 琴，李艷賓，張利莉，趙 珂，張小平

(1.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院應用微生物系，四川 成都 611130；2.新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

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甘草內(nèi)生真菌多樣性及群落結構

趙 翀1，廖 萍1，張瀚能1，楊雅琳1，張 琴2，李艷賓2，張利莉2，趙 珂1，張小平1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院應用微生物系，四川 成都 611130；2.新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

摘要：以新疆塔里木盆地的光果甘草(Glycyrrhiza glabra)和脹果甘草(G. inflate)為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術研究甘草內(nèi)生真菌的多樣性及群落結構。結果顯示，光果甘草和脹果甘草間及同一種類不同組織間的內(nèi)生真菌多樣性和群落結構均存在明顯差異。其中，脹果甘草根(B1)的內(nèi)生真菌多樣性最豐富，光果甘草果(L4)的內(nèi)生真菌多樣性最差。對DGGE條帶進行回收測序，共獲得25條序列，歸于枝頂孢屬(Acremonium)、綠僵菌屬(Metarhizium)、綠僵蟲草屬(Metacordyceps)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢屬(Cladosporium)、錘舌菌屬(Leotiomycetes)、鏈格孢屬(Alternaria)、帚枝霉屬(Sarocladium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、曲霉屬(Aspergillus)11個真菌屬，其中鏈格孢屬為優(yōu)勢菌屬，占總數(shù)的32%。甘草根、莖、葉、果、皮組織的內(nèi)生真菌存在豐富的多樣性，其中根與莖組織多樣性最豐富。研究結果表明，新疆塔里木盆地藥用植物甘草蘊藏著豐富的內(nèi)生真菌資源，可作為一種較理想的分離內(nèi)生真菌的植物來源。

關鍵詞：光果甘草；脹果甘草；內(nèi)生真菌；多樣性和群落結構；DGGE

甘草為豆科甘草屬(Glycyrrhiza)多年生草本植物，喜干燥氣候，耐寒，多生長于干旱、半干旱的荒漠草原，是新疆荒漠區(qū)最主要的植被物種之一[1]，具有防風固沙、保持水土的作用[2]。脹果甘草(Glycyrrhizainflate)和光果甘草(G.glabra)是塔里木盆地具代表性的甘草種類[3]，國內(nèi)外已對甘草的化學成分，藥理作用開展了廣泛的研究[4-7]，表明甘草含有黃酮類化合物，具有保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、抗瘧、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)解、降糖和抗血小板凝集等多種活性。內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指在其生活史的某個階段或全部階段生活在植物組織內(nèi)，其存在不會引起植物病害癥狀的真菌[8]。由于內(nèi)生真菌長期以來以寄生或共生等方式與宿主植物共存，特別是內(nèi)生于某些藥用植物中的真菌，在與宿主植物協(xié)同進化的過程中，參與到藥用植物的新陳代謝或某類活性化合物的合成過程，而能產(chǎn)生相同或相似的化合物[9]，是獲得新天然產(chǎn)物的重要來源[10-13]。近年來，多數(shù)研究者均以可培養(yǎng)方法分析甘草內(nèi)生真菌的組成，但由于傳統(tǒng)分離方法的局限性而缺少對不同類型甘草內(nèi)生真菌群落的全面了解。因此，了解甘草內(nèi)生真菌類群組成，對合理開發(fā)利用甘草內(nèi)生真菌資源具有重要意義。本研究采用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術結合DNA測序技術對新疆塔里木盆地光果甘草和脹果甘草內(nèi)生真菌多樣性及群落結構進行分析，探究不同種不同組織間甘草內(nèi)生真菌多樣性的差異，深入挖掘甘草藥材中的微生物資源，為潛在的抗病資源的篩選提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

從塔里木盆地(40°33′51″ N,80°19′55.3″ E)采集光果甘草和脹果甘草植物樣品，放入無菌塑料袋中，4 ℃保存。

1.2試驗方法

1.2.1植物樣品表面消毒將樣品分成根、莖、葉、果實、皮5個部分，按照Hallmann等[14]的方法進行表面消毒。將處理好的樣品用無菌濾紙吸干植物組織表面的水,用無菌粉碎機把植物組織粉碎后備用。同時取0.2 mL 最后一遍清洗植物樣品的水涂布于PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)3～7 d，觀察是否有菌長出，進行消毒效果檢測。

1.2.2樣品總DNA提取和18S rRNA PCR擴增采用小量法[15-16]提取樣品總DNA后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用巢式PCR對目標片段進行擴增。第1輪PCR擴增引物為ITS1-F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)[17]。反應體系(20 μL)：Mix緩沖液10 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足20 μL。第2輪PCR擴增引物為ITS1-F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2-GC(GCTGCGTTCTTCATCGATGCGCCGCCCGCCGCGCGC

GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)[17]。反應體系(50 μL)：Mix緩沖液25 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，第1輪PCR產(chǎn)物1 μL，ddH2O補足50 μL。同時設置不添加模板的陰性對照。為減少非特異性產(chǎn)物，采用Touch-down PCR程序，第1、2輪反應程序均為：95 ℃預變性6 min，94 ℃變性1 min，65-55 ℃退火45 s(每個循環(huán)溫度降低0.5 ℃)，72 ℃延伸45 s，共20個循環(huán)，然后在其它條件不變的情況下，在55 ℃的退火溫度下擴增15個循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃恒溫保存。最后將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。

1.2.3PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳DGGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)在Dcode系統(tǒng)(Bio-Rad)上進行，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑梯度濃度范圍為30%～60%，其變性方向與電泳方向一致。在1×TAE緩沖液中，50 V預跑30 min，然后160 V，60 ℃恒溫恒壓電泳5.5 h。電泳完畢后將剝離的聚丙酰胺凝膠置于EB(0.5 μg·mL-1)溶液中染色15 min，然后在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)下成像[18-19]。

1.2.4PCR-DGGE圖譜分析采用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)對光果甘草和脹果甘草各組織樣品DGGE圖譜電泳條帶進行多樣性分析。多樣性指數(shù)(H)、豐富度(S)、辛普森指數(shù)(D)、優(yōu)勢度指數(shù)(C)[20-22]等指標被用來比較各個植物樣品的內(nèi)生真菌多樣性。其中，H用于描述種群的個體出現(xiàn)紊亂和確定性，不確定性越高，多樣性就越高。D是指群落中種數(shù)越多，各種個體之間分配就越均勻，指數(shù)越高，多樣性就越好。C也可以在一定程度上反映樣品的多樣性。

H=-∑(Pi)·(lnPi)；

D=1-∑Pi2；

C=-∑Pi2.

式中：Pi是某個植物樣品中單一條帶的強度在該樣品中所有條帶強度的比率，S是某個植物樣品中所有條帶數(shù)目的總和[23]。

1.2.5DGGE條帶測序和系統(tǒng)發(fā)育分析將DGGE條帶中的優(yōu)勢條帶和特異性的條帶切割下后，用無菌去離子水清洗3次，挑取一小塊膠(膠塊體積<1 mm3)作 DNA模板。用第2次PCR擴增時用的引物(無GC發(fā)夾)進行PCR擴增，體系和程序也與總DNA的18S rRNA PCR擴增時相同。PCR產(chǎn)物用UNIQ-10 DNA純化試劑盒(上海生工)進行純化，然后用大連寶生物公司的pMDTM19-T Vector試劑盒進行克隆。挑選白色克隆子進一步測序，測序由上海生工生物工程公司完成。將所測的序列，以及通過 BLAST程序在GenBank獲取的相似度較高的序列，先用Clustral X(Version 1.81)進行全序列比對[24]，然后采用Neighbor-joining方法在Mega 5.0中進行系統(tǒng)發(fā)育分析[25]。將測序得到的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KU050708-KU050732。

1.2.6數(shù)據(jù)分析采用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)分析DGGE圖譜，所得數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行統(tǒng)計分析和表格制作，多樣性指數(shù)、豐富度、優(yōu)勢度指數(shù)和辛普森指數(shù)的方差分析采用SPSS 20.0。

2結果與分析

2.1甘草真菌DGGE圖譜分析

甘草各組織DNA的PCR產(chǎn)物在經(jīng)過DGGE后，分離出數(shù)目不等和遷移率存在明顯差異的電泳條帶(圖1)，揭示了甘草內(nèi)生真菌的多樣性。通過比較脹果甘草根、莖、葉、果、皮的DGGE條帶，發(fā)現(xiàn)脹果甘草根組織的條帶最多，且最復雜，莖組織次之，皮組織的條帶最少。表明同一種植物不同的部位其內(nèi)生真菌多樣性存在明顯的差異，且不同部位內(nèi)生真菌的豐富度也有一定的區(qū)別。此外，比較光果甘草和脹果甘草內(nèi)生真菌的DGGE條帶數(shù)，發(fā)現(xiàn)莖、葉、皮組織樣品的條帶數(shù)均為光果甘草比脹果甘草多，而根、果組織的DGGE條帶數(shù)脹果甘草比光果甘草多，表明不同種植物間各組織內(nèi)生真菌多樣性不同。

2.2甘草內(nèi)生真菌遺傳多樣性分析

本研究依據(jù)電泳圖譜中條帶的強度，以及各樣品中真菌的H、S、D和C指標進行遺傳多樣性分析(表1)。

微生物群落的遺傳多樣性在一定程度上可以通過DGGE條帶的多少反映出來[26]。脹果甘草根(B1)內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)(3.25)、豐富度(26)和辛普森指數(shù)(0.961)最高，而光果甘草果(L4)和脹果甘草皮(B5)的豐富度和辛普森指數(shù)最低(表1)。優(yōu)勢度最高的是光果甘草果(L4)和脹果甘草皮(B5)，均為0.102，最低的是脹果甘草根(B1)，為0.039。從甘草各組織的多樣性看，光果甘草內(nèi)生真菌多樣性大致體現(xiàn)出莖(L2)>根(L1)>葉(L3)>皮(L5)>果(L4)的分布規(guī)律，而脹果甘草內(nèi)生真菌多樣性則是根(B1)>莖(B2)>葉(B3)>果(B4)>皮(B5)。將光果甘草與脹果甘草內(nèi)生真菌多樣性相比較后，發(fā)現(xiàn)脹果甘草根和果內(nèi)生真菌多樣性明顯高于光果甘草，而莖、葉、皮內(nèi)生真菌多樣性則是光果甘草高于脹果甘草。表明植物種類和部位的不同都會導致其內(nèi)生真菌群落結構的差異。

2.3DGGE條帶回收序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析

從10個樣品的DGGE圖譜中成功回收了25個條帶(圖1)，對DNA經(jīng)PCR擴增、克隆后送上海生工生物工程有限公司測序，將結果與Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行blast比對，找出同源性最高的序列。結果表明，所有回收條帶的序列與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株都具有一定的同源性，最高相似度在98%～100%(表2)。鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、枝頂孢屬(Acremonium)在不同品種不同組織部位中均有分布，是甘草內(nèi)生真菌的共有菌屬。而有一些真菌菌屬只存在于唯一的樣品中，如枝孢屬(Cladosporium)只在脹果甘草的根部存在，綠僵菌屬(Metarhizium)只在光果甘草和脹果甘草的根部存在，表明在不同種類的植物中存在特有的內(nèi)生真菌類群。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖2)，可以將所有序列大致分為兩個簇，其中第1個簇又可以分為5個小支，SICAUZ 6、7、11、13、14、18、21、22、23、25聚在一支，歸于肉座菌目(Hypocreales)的叢赤殼科(Nectriaceae)和麥角菌科(Clavicipitaceae)兩個科的枝頂孢屬(Acremonium)、帚枝霉屬(Sarocladium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、綠僵菌屬(Metarhizium)4個屬；SICAUZ20聚在第2支，歸于糞殼菌目(Sordariales)毛殼菌科(Chaetomiaceae)梭孢殼屬(Thielavia)；SICAUZ 19聚在第3支，歸于煤炱目(Capnodiales)枝孢科(Cladosporiaceae)枝孢屬(Cladosporium)；SICAUZ1、2、10則聚在第4支，歸于散囊菌目(Eurotiales)曲霉科(Aspergillaceae)曲霉屬(Aspergillus)；SICAUZ16、17聚在第5支，歸于錘舌菌綱(Leotiomycetes)的錘舌菌屬(Leotiomycetes)和假裸(Pseudogymnoascus)兩個屬。而第2個簇的序列則歸于格孢菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)鏈格孢屬(Alternaria)。其中鏈格孢屬(Alternaria)占32%，屬于甘草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群，說明甘草內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性。

圖1　甘草內(nèi)生真菌DGGE圖譜Fig.1　DGGE profile of the endophytic fungi of liquorice

注：L1～L5分別為光果甘草的根、莖、葉、果、皮樣品；B1～B5分別為脹果甘草的根、莖、葉、果、皮樣品；SICAUZ1～SICAUZ25為擴增條帶。下同。

Note: L1～L5, Root, steam, leaf, fruit, and bark ofGlycyrrhizaglabra, respectively; B1～B5, Root, stem, leaf, fruit, and bark ofGlycyrrhizainflate, respectively; SICAUZ1～SICAUZ25, amplified bands. The same below.

表1　植物組織樣品中 DGGE 條帶多樣性指數(shù)、 豐富度、優(yōu)勢度指數(shù)和辛普森指數(shù)Table 1　Shannon-Wiener index(H), Richness(S), Dominance index(C), Simpson index(D) for the test plant samples

3討論與結論

中國藥典收載作為藥用的主要是烏拉爾甘草(G.uralensis)、黃甘草(G.kansuensis)、脹果甘草和光果甘草[27]。目前，有關甘草內(nèi)生真菌多樣性的研究僅見于對脹果甘草[28-29]和烏拉爾甘草內(nèi)生真菌[30-31]的報道，他們采用可培養(yǎng)方法從這兩類甘草中分離出的內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌群主要是梭孢霉菌屬(Fusidium)和鐮孢屬(Fusarium)。本研究首次運用DGGE免培養(yǎng)方法對光果甘草和脹果甘草內(nèi)生真菌種群多樣性進行分析，測序結果表明，光果甘草中共有10個真菌屬，脹果甘草中共有11個真菌屬，其中鏈格孢屬為這兩類甘草的優(yōu)勢菌屬，這與前人的研究結果存在差異，主要原因可能與分析手段和試驗材料不同有關。鏈格孢屬是引起植物病害的重要真菌類群之一，豆鏈格孢(Alternariaazukiae)是甘草葉斑病的致病菌[32]。盡管本研究結果表明鏈格孢屬是光果甘草和脹果甘草的優(yōu)勢菌群，但本研究采集的甘草樣品均為無明顯感病癥狀的健康植株，導致這一結果的原因可能是，病原真菌在與宿主植物長期共存的相互作用以及自身演變的過程中[33]，由于環(huán)境的改變導致其致病能力喪失，進而演化成為宿主體內(nèi)的正常菌群[34]。此外，已有研究表明，鏈格孢屬內(nèi)生真菌能產(chǎn)生具有生物活性化合物的能力[35-36]，這些活性物質不僅具有抗病原真菌的作用[37]，還具有抗惡性細胞增生的作用[38]，為進一步篩選具有生產(chǎn)活性天然產(chǎn)物功能的內(nèi)生真菌提供了豐富的資源。

表2　DGGE 切膠條帶序列比對結果Table 2　Phylogenetic identification and distribution of fungi excised and sequenced from DGGE bands

圖2　甘草內(nèi)生真菌DGGE條帶N-J系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2　Phylogenetic analysis of 18S rRNA gene sequences of endophytic fungi in Liquorice from DGGE bands

本研究還發(fā)現(xiàn)，枝孢屬(Cladosporium)只在脹果甘草根組織中存在，而在脹果甘草的其它組織及光果甘草中都沒有檢測到，其原因可能是DGGE技術有局限性[39]，或是植物種類不同，基因水平和遺傳背景的差異導致其內(nèi)部環(huán)境的差異，而導致內(nèi)生真菌的類群有所不同。但是，除了枝孢屬以外的其它10種菌屬在光果甘草和脹果甘草中均有分布，其原因可能是內(nèi)生真菌在植物科的水平上具有一定的偏好性[40]，而且這兩種甘草在相同環(huán)境和地域的影響下，群落的多樣性演替過程相似，導致內(nèi)生真菌多樣性及群落結構相似。

內(nèi)生菌在植株體內(nèi)的分布通常為下部組織多于上部組織，越往植株頂部，內(nèi)生菌越少[41]；從甘草各組織中分離內(nèi)生真菌根部最多，莖部次之，葉部最少[30]；對于藥用植物而言，枝條同葉片相比內(nèi)生真菌的種類更為豐富[13]。本研究通過DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，光果甘草的莖組織中內(nèi)生真菌的多樣性最豐富，而脹果甘草根組織內(nèi)生真菌多樣性最豐富，表明甘草根、莖組織內(nèi)生真菌豐富度明顯高于其它組織，其原因可能是植物體根圍區(qū)域是一個能量和物質交換異?；钴S的區(qū)域，根系內(nèi)生真菌的侵染程度較地上部分要強，而葉片內(nèi)生真菌多以局部侵染為主[42]，從而導致根組織內(nèi)生真菌多于地上組織的。此外，內(nèi)生真菌還可以很容易地穿過植物皮層進入木質部導管中，使莖組織內(nèi)有較豐富的內(nèi)生真菌種群[43]。

研究新疆塔里木盆地光果甘草和脹果甘草內(nèi)生真菌多樣性及其群落結構，可以幫助了解不同種類甘草的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育情況。甘草作為新疆塔里木盆地一種常見的藥用植物，其內(nèi)部的真菌存在明顯的多樣性，可作為一種較理想的分離內(nèi)生真菌的植物資源，為真菌資源的篩選提供理論依據(jù)。

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(責任編輯武艷培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0637

*收稿日期：2015-11-13接受日期：2016-02-24

基金項目：國家863計劃項目(2013AA102802-05)；新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室開放課題(BRYB1201)

通信作者：趙珂(1982-)，女，四川彭州人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail:zhaoke82@126.com

中圖分類號：S567.7+1;Q948.15

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)7-1315-09*

Corresponding author:Zhao KeE-mail:zhaoke82@126.com

Diversity and community structure of endophytic fungi from liquorice plants

Zhao Chong1, Liao Ping1, Zhang Han-neng1, Yang Ya-lin1, Zhang Qin2,Li Yan-bin2, Zhang Li-li2, Zhao Ke1, Zhang Xiao-ping1

(1.Department of Microbiology, College of Resource and Environment,Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2.Xinjiang Production Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resourses in Tarim Basin, Alar 843300, China)

Abstract:In the present study, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was employed to analyze the community structure and diversity of endophytic fungi of Glycyrrhiza inflate and G. glabra plants in Tarim basin, Xinjiang．The results showed that diversity and community structure of endophytic fungi of Liquorice were different either in different species or in different tissue of the same species. The diversity of endophytic fungi was richest in root (B1) of G. inflate and lowest in the fruit of G. glabra. Twenty five gel bands were purified and sequenced which belonged to eleven genera, including Acremonium, Metarhizium, Metacordyceps, Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Leotiomycetes, Sarocladium, Pseudogymnoascus, Aspergillus. Alternaria was dominant genera accounting for 32% of all sequences. All of the results revealed there was high diversity of endophytic fungi in the plant tissues of Liquorice and there was abundant endophytic fungi resource in Liquorice of Tarim basin, Xinjiang.

Key words:Glycyrrhiza glabra; Glycyrrhiza inflate; endophytic fungi; diversity and community structure; DGGE

趙翀,廖萍,張瀚能,楊雅琳,張琴,李艷賓,張利莉,趙珂,張小平.甘草內(nèi)生真菌多樣性及群落結構.草業(yè)科學,2016,33(7)：1315-1323.

Zhao C,Liao P,Zhang H N,Yang Y L,Zhang Q,Li Y B,Zhang L L,Zhao K,Zhang X P.Diversity and community structure of endophytic fungi from liquorice plants.Pratacultural Science，2016,33(7)：1315-1323.

第一作者：趙翀(1991-)，女，重慶萬州人，在讀碩士生，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail：zcsuzee@126.com