硫辛酸對(duì)大鼠多發(fā)性腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用

杜　斌　楊志勇　范紅斌　龐慶豐　邱麗穎

(江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，江蘇　無(wú)錫　214122)

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硫辛酸對(duì)大鼠多發(fā)性腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用

杜斌楊志勇1范紅斌龐慶豐邱麗穎

(江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，江蘇無(wú)錫214122)

〔摘要〕目的探討硫辛酸(LA)對(duì)大鼠多發(fā)性腦梗死(MCI)神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。方法將雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組,即假手術(shù)組、模型組、LA高劑量組、低劑量組,每組8只。給藥3 d后觀察對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征評(píng)分。給藥4 d后觀察硫辛酸對(duì)大鼠MCI體重的變化、腦病理形態(tài)、腦組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。結(jié)果給藥4 d時(shí)體重變化明顯。術(shù)后3 d時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征評(píng)分有顯著改變。腦組織病理切片顯示神經(jīng)細(xì)胞排列不整齊,神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，LA低劑量組、高劑量組腦組織中CaN、LDH、NO含量下降，SOD活性增高(P<0.05)。高劑量組與低劑量組比較有差異(P<0.05)。結(jié)論LA可通過(guò)保護(hù)腦組織抗氧化酶的活性，減輕自由基對(duì)腦組織損傷，對(duì)MCI有保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕硫辛酸；多發(fā)性腦梗死；神經(jīng)保護(hù)

多發(fā)性腦梗死(MCI)是指腦內(nèi)有多個(gè)因缺血而產(chǎn)生的軟化梗死灶,又稱為多發(fā)性腦軟化。在病理生理機(jī)制中，認(rèn)為與氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、單胺神經(jīng)遞質(zhì)毒性等有關(guān)〔1〕。硫辛酸(LA)可存在于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外，可以清除脂溶性或水溶性自由基，促進(jìn)線粒體的葡萄糖代謝循環(huán)、增加能量產(chǎn)生、影響新陳代謝、緩解炎癥、增強(qiáng)免疫系統(tǒng),還能啟動(dòng)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制〔2〕。LA作為神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化損傷保護(hù)劑已越來(lái)越引起關(guān)注。本文研究LA對(duì)MCI的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料健康雄性清潔級(jí)SD成年大鼠32只，體重(250±20)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2012-0002，LA購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：12705243；生化試劑盒：購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備32只大鼠，隨機(jī)分為四組，假手術(shù)組、模型組、LA高劑量組、低劑量組,每組8只。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。模型組采用改良Kaneko法制造MCI模型〔3〕。同種SD 大鼠尾靜脈采血,于37℃溫箱內(nèi)干燥,研碎后用200 nm 篩孔過(guò)篩,制成血栓栓子,應(yīng)用時(shí)取栓子1 mg加生理鹽水0.5 ml,搖勻成混懸液。10%水合氯醛按35 mg/100 g 體重腹腔注射麻醉,頸正中切開皮膚,剝離肌肉,暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈,暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈,于頸外動(dòng)脈逆行插管注入栓子溶液0.3 ml,推注同時(shí)開放頸總動(dòng)脈,使栓子通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈,造成MCI,然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈,縫合皮膚。假手術(shù)組同樣麻醉剝離并暴露頸動(dòng)脈后便縫合皮膚。LA低劑量組術(shù)后每天灌胃100 mg/kg，高劑量組每天灌胃200 mg/kg，假手術(shù)組、模型組每天灌胃等量生理鹽水，共4 d。術(shù)后第4天統(tǒng)一處死。

1.2.2神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征評(píng)分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用日本永岡明申的腦卒中癥狀體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔4〕:0分:正常;1分:運(yùn)動(dòng)量輕度減少,或輕度興奮;2分:運(yùn)動(dòng)量明顯減少,或激惹性亢進(jìn);3分:不能行走,憂郁性癥狀(體臥不動(dòng));4分:不能站立,體肢麻痹(癱瘓)或任何一側(cè)體肢癱瘓。觀察方法:每天評(píng)分兩次(用恫嚇的方式查看大鼠的反應(yīng)和活動(dòng)能力),以3 d評(píng)分的平均分評(píng)價(jià)腦梗死癥狀及體征變化的程度。

1.2.3病理形態(tài)的觀察迅速斷頭取血后處死，迅速取出腦標(biāo)本，然后將腦組織固定于10%甲醛溶液內(nèi)，24 h后，從冠狀面取中央前回和中央后回組織各一塊，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(厚度4 μm),HE染色，光鏡檢查。

1.2.4大鼠腦組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性測(cè)定給藥4 d時(shí)迅速斷頭取血，分離血清樣本，CaN、LDH、NO、SOD的測(cè)定嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MCI 模型大鼠外觀形態(tài)造模動(dòng)物共34只,存活32只,存活率達(dá)94.15%，所有存活大鼠均發(fā)生腦梗死,腦梗死發(fā)生率為100%。發(fā)生腦梗死大鼠癥狀輕重不等,輕者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少,易激惹,重者出現(xiàn)行走轉(zhuǎn)圈或不能站立、身體向一側(cè)傾倒,完全偏癱,或抽搐、大便失禁等。用手提起大鼠尾部,大鼠患側(cè)肢體下垂,四肢伸出不對(duì)稱。

2.2大鼠MCI后體重變化術(shù)后1 d體重?zé)o變化(P>0.05)。術(shù)后4 d與模型組比較，體重變化有顯著差異(P<0.01)。見表1。

2.3神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征評(píng)分假手術(shù)組大鼠術(shù)后3 d神經(jīng)系統(tǒng)癥癥狀體征評(píng)分為0，模型組、LA低劑量組及LA高劑量組分別為2.75±0.71、1.37±0.74、1.12±0.64。與模型組比較，各組均有顯著差異(P<0.01)。

2.4腦組織病理學(xué)變化光鏡下見假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞核

表1　大鼠MIC后體重變化

與模型組比較：1)P<0.01；與低劑量組比較：2)P<0.01，下表同

大,核膜清晰、核仁明顯。神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，呈多層排列，且緊密、整齊,神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分布正常,未見軟化灶,神經(jīng)纖維走向規(guī)則。模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列不整齊、稀松、不規(guī)則,脫失現(xiàn)象嚴(yán)重、神經(jīng)元數(shù)目明顯減少、胞核固縮等缺血性改變，神經(jīng)纖維走向紊亂。LA低劑量組、高劑量組可見大腦皮質(zhì)細(xì)胞部分消失，數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，胞核深染，形態(tài)大小不一。見圖 1。

2.5各組大鼠腦組織CaN、LDH、NO、SOD活性含量與模型組比較，LA低劑量組、高劑量組腦組織中CaN、LDH、NO含量下降，SOD活性增高。LA高劑量組與低劑量組比較有顯著差異(P<0.01)。見表2。

圖1　MCI腦組織病理學(xué)變化(HE,×100)

組別CaN(OD636/mgprot)LDH(nU/mg)NO(μmol/gprot)SOD(U/gprot)假手術(shù)組4.50±0.251)9.45±0.161)0.78±0.0721)8.31±0.111)模型組8.01±0.1813.84±0.131.53±0.174.87±0.31LA低劑量組6.13±0.111)11.43±0.111)0.91±0.071)5.61±0.071)LA高劑量組4.32±0.131)2)10.10±0.191)2)0.86±0.031)6.38±0.081)2)

3討論

大鼠MCI模型建立同線栓法腦缺血再灌注損傷相比，其病理生理學(xué)過(guò)程更相似人類腦梗死的發(fā)病機(jī)制。MCI會(huì)產(chǎn)生自由基連鎖反應(yīng)。因此,MCI早期抗自由基治療是非常必要的。自然界存在的硫辛酸具有氧化型和還原型兩種形態(tài)。生物體內(nèi)氧化型和還原型相互轉(zhuǎn)化時(shí)多種活性氧被清除，構(gòu)成機(jī)體獨(dú)特的抗氧化劑循環(huán)代謝網(wǎng)絡(luò)，被稱為萬(wàn)能抗氧化劑〔5〕。

CaN 作為一種使底物脫磷酸化的蛋白磷酸酶，參與全身性應(yīng)激反應(yīng)引起的磷酸化反應(yīng)，維持重要器官磷酸化反應(yīng)平衡中有重要意義〔6〕。LA高劑量組對(duì)MCI治療過(guò)程中，CaN含量接近假手術(shù)組，說(shuō)明LA對(duì)調(diào)節(jié)磷酸化反應(yīng)有影響。SOD 是機(jī)體清除自由基的主要酶，SOD活性高低間接反映腦組織清除自由基的能力，對(duì)腦缺血有神經(jīng)保護(hù)作用〔7〕。LA低、高劑量組SOD活性明顯高于模型組，說(shuō)明LA對(duì)清除自由基有影響。NO是體內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸和O2氧化產(chǎn)生的，可被氧自由基、血紅蛋白等迅速滅活。內(nèi)皮型NOS合酶產(chǎn)生NO能夠擴(kuò)張血管，具有神經(jīng)保護(hù)作用。LA給藥后的神經(jīng)保護(hù)作用，可能是腦缺血和再灌注過(guò)程中LA通過(guò)升高NO水平增強(qiáng)流經(jīng)大腦動(dòng)脈的血流量實(shí)現(xiàn)的〔7〕。MCI面積越大，細(xì)胞破壞越多，腦組織中的LDH 活性越低。因此LDH 是腦組織損害最敏感的酶，可準(zhǔn)確反映腦組織細(xì)胞受損的程度〔8〕。Tagliari 等〔9〕認(rèn)為，LDH 從損傷的細(xì)胞內(nèi)溢出，可通過(guò)測(cè)量LDH 的變化來(lái)定量分析腦細(xì)胞損傷的程度。鈣離子在LA神經(jīng)保護(hù)作用中起到調(diào)控功能,進(jìn)一步說(shuō)明LA有神經(jīng)保護(hù)作用〔10〕。LA對(duì)糖尿病大鼠大腦皮質(zhì)有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)核因子-κB、糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)等表達(dá)，改善大腦退行性病變有關(guān)〔11〕。研究結(jié)果表明LA給藥后腦細(xì)胞損傷程度有所好轉(zhuǎn)，可以推斷LA對(duì)MCI有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與LA的抗氧化性有關(guān)。

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〔2014-11-30修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：邱麗穎(1965-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管病病因?qū)W與藥物治療和中藥藥理研究。

〔中圖分類號(hào)〕R365

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2867-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.018

1阜陽(yáng)市人民醫(yī)院特需病房

第一作者：杜斌(1983-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥理學(xué)研究。