鬼針草水提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6的影響

周畢軍　趙　巖　黃川鋒

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校外科教研室，河南　南陽(yáng)　473000)

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鬼針草水提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6的影響

周畢軍趙巖黃川鋒

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校外科教研室，河南南陽(yáng)473000)

〔摘要〕目的研究鬼針草水提物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用及對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響。方法一次性腹腔注射LPS(400 μg/kg)建立小鼠化學(xué)性肝損傷模型，鬼針草水提物灌胃，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6的水平和肝勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的含量，肝組織HE染色作病理切片分析。結(jié)果鬼針草水提物可明顯改善 LPS 引起的小鼠肝組織病理?yè)p傷，降低 LPS致小鼠血漿ALT、GGT、TNF-α和IL-6的水平，GSH-Px活性明顯增高，肝細(xì)胞水腫、變性等損傷程度明顯減輕。結(jié)論鬼針草水提物能夠明顯降低急性肝損傷小鼠TNF-α、IL-6水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，具有較強(qiáng)的保肝作用。

〔關(guān)鍵詞〕鬼針草水提物；脂多糖；急性肝損傷；細(xì)胞因子

肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，藥物和毒物引起的肝損傷是一種常見(jiàn)的病理?yè)p害，其長(zhǎng)期存在往往導(dǎo)致肝纖維化，甚至成為肝硬化、肝癌發(fā)生的使動(dòng)因素〔1〕。研究表明中藥及其有效成分可以通過(guò)減少致炎相關(guān)介質(zhì)的產(chǎn)生、促進(jìn)肝臟循環(huán)和肝細(xì)胞再生等方面保護(hù)肝細(xì)胞、預(yù)防肝損害〔2〕。鬼針草為菊科一年生草本植物，作為常用中草藥，應(yīng)用十分廣泛〔3〕。馬瑜紅等〔4〕的實(shí)驗(yàn)研究表明：鬼針草提取物能降低動(dòng)物模型的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平和肝勻漿丙二醛(MDA)含量，具有一定的保肝作用，且與藥物劑量有關(guān)。劉韋成等〔5〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了脂多糖(LPS)單獨(dú)誘導(dǎo)急性肝損傷模型，是一種簡(jiǎn)易實(shí)用的急性肝損傷動(dòng)物模型建立的方法。本項(xiàng)研究從細(xì)胞和分子水平探討鬼針草水提物對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用及對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種雄性小鼠50只，3月齡，體質(zhì)量160～190 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。大鼠每籠5只，分籠喂養(yǎng)，房間溫度平均20℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光線(xiàn)為12 h明暗循環(huán)〔6〕，保持籠內(nèi)清潔。

1.2試劑LPS購(gòu)自上?；鈱?shí)業(yè)有限公司；ALT、AST試劑盒購(gòu)自上?？迫A生產(chǎn)；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒均購(gòu)自上海博研生物科技有限公司。MDA、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3試驗(yàn)方法制備鬼針草水提物：采集、鑒定鬼針草，制備鬼針草水提取物，濃度為每毫升含1 g生藥。昆明種雄性小鼠50只，隨機(jī)分為五組：正常組、模型組、鬼針草水提物低、中、高劑量組。低、中、高劑量組分別用以3.0、6.0、12 g·kg-1·d-1劑量灌胃，正常組與模型組灌胃等量生理鹽水，每日一次，連續(xù)3 w。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物正常飲水，以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。末次灌胃后禁食12 h，除正常組組外，其余各組小鼠均一次性腹腔注射LPS(400 μg/kg)建立小鼠肝損傷模型，正常組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，觀(guān)察動(dòng)物的一般情況及死亡情況。

1.4標(biāo)本檢測(cè)造模12 h后處死小鼠，快速摘取小鼠眼球采血制備血清〔7〕，血液離心后血清送生化室檢測(cè)ALT、AST；迅速解剖，取小鼠肝臟作HE染色，觀(guān)察組織形態(tài)與受損情況；取肝組織(0.5～1 g)在冰冷的生理鹽水中漂洗，在冰浴中制備肝勻漿并測(cè)定MDA、SOD含量，使用TU-1810分光光度計(jì)測(cè)定，均按說(shuō)明書(shū)操作〔8〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組小鼠轉(zhuǎn)氨酶及細(xì)胞因子水平變化與模型組比較，干預(yù)組ALT、AST、TNF-α、IL-6均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠轉(zhuǎn)氨酶及細(xì)胞因子水平比較±s,n=10)

與正常組比較：1)P<0.01,2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01,4)P<0.05

2.2肝組織MDA、SOD、GSH-Px的變化與模型組比較，鬼針草高劑量組MDA顯著降低(P<0.05)，鬼針草中、高劑量組明顯增高(P<0.05)，但均未恢復(fù)至正常水平。見(jiàn)表2。

2.3肝組織病理切片結(jié)果正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞大小一致。模型組周?chē)[，肝索紊亂、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。鬼針草中、高劑量組較模型組病變明顯減輕，肝細(xì)胞形態(tài)、大小基本正常，只有少極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

正常組　　　　　　　　　　　　　模型組　　　　　　　　　　鬼針草中劑量組　　　　　　　　　鬼針草高劑量組圖1　各組小鼠肝組織病理變化(HE，×100)

表2　各組小鼠MDA、SOD、GSH-Px水平比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

LPS是革蘭陰性菌胞壁內(nèi)毒素的主要成分，也是革蘭陰性菌激發(fā)宿主免疫應(yīng)答導(dǎo)致機(jī)體損傷的主要因素〔9〕。肝臟是腸源性?xún)?nèi)毒素攻擊的首要器官，也是免疫損傷的常見(jiàn)靶器官。更為重要的是它可以刺激肝內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)活化，生成大量炎性因子如TNF-α、IL-1及IL-6等，觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)肝臟造成較為持久而且廣泛的損傷〔10，11〕。TNF-α、IL-6是由肝Kupffer細(xì)胞表達(dá)和分泌的炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步刺激相鄰的肝細(xì)胞和附近的Kupffer細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-6〔12〕。TNF-α對(duì)肝細(xì)胞的直接致傷作用可通過(guò)肝細(xì)胞膜上的膜腫瘤壞死因子受體(TNF-R)上調(diào)，已知TNF-α與mTNFR結(jié)合，可通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑最終激活細(xì)胞內(nèi)多種非溶酶體性脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，將肝細(xì)胞雙鏈基因組DNA切割成寡脫氧核苷酸片段，從而使肝細(xì)胞凋亡，破壞和排除大量肝細(xì)胞。

IL-6的生物學(xué)活性廣泛，能誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化并產(chǎn)生抗體，使免疫復(fù)合物的形成增多，可以通過(guò)經(jīng)典或旁路途徑激活補(bǔ)體，引起炎癥反應(yīng)和靶細(xì)胞的損傷；誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的活性，增強(qiáng)CTL殺傷靶細(xì)胞的能力，導(dǎo)致肝臟炎癥和免疫損傷；另外也是急性期反應(yīng)蛋白如C反應(yīng)蛋白的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，后者升高可加重肝臟的病理?yè)p傷〔13〕。

本研究結(jié)果證明，模型組的ALT、AST、TNF-α、IL-6明顯高于正常組，進(jìn)一步證明肝細(xì)胞受到損傷。鬼針草水提物中、高劑量組與模型組相比，ALT、AST、TNF-α、IL-6明顯降低，病理檢查肝細(xì)胞病變明顯減輕，鬼針草水提物高劑量組肝細(xì)胞形態(tài)、大小未見(jiàn)明顯異常，肝中央靜脈結(jié)構(gòu)完整，表明鬼針草水提物具有保肝作用，能明顯減輕肝損害。導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死損傷的重要因素之一是氧自由基(OFR)的生成，導(dǎo)致MDA增多〔14〕。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。鬼針草高劑量組MDA顯著降低，GSH明顯增加，證實(shí)鬼針草水提物能夠清除自由基，從而減輕肝損害。鬼針草水提物預(yù)處理對(duì)LPS所致化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用〔14〕，可能與降低TNF-α、IL-6水平和減輕氧化應(yīng)激有關(guān)，其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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〔2014-12-08修回〕

(編輯安冉冉)

基金項(xiàng)目：南陽(yáng)市2012年科技攻關(guān)發(fā)展計(jì)劃(2012GG046)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2858-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.014

第一作者：周畢軍(1979-)，男，講師，主要從事普通外科教學(xué)、科研與臨床研究。