龜鹿二仙膏改善圍絕經(jīng)期女性骨質(zhì)疏松的機(jī)制

尚　冰　叢培瑋　張麗娜　吳兆利

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻(xiàn)研究院，遼寧　沈陽　110847)

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龜鹿二仙膏改善圍絕經(jīng)期女性骨質(zhì)疏松的機(jī)制

尚冰叢培瑋1張麗娜1吳兆利2

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻(xiàn)研究院，遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的觀察龜鹿二仙膏對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESCs)增殖和胰島素樣生長因子(IGF)-1表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)hESCs，6孔培養(yǎng)板細(xì)胞貼壁達(dá)75%～85%后對(duì)細(xì)胞純度通過免疫組化法進(jìn)行鑒定。細(xì)胞無血清培養(yǎng)同步化24 h后，龜鹿二仙膏采用不同濃度(10-4、10-6、10-8mol/L)處理細(xì)胞48 h，MTT法測定三個(gè)濃度下24、36、48 h龜鹿二仙膏對(duì)hESCs增殖的影響，Real-time PCR和Western印跡法檢測24、36、48 h子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量。結(jié)果細(xì)胞鑒定波形蛋白陽性率高達(dá)95%；10-4、10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組和雌二醇組細(xì)胞增殖率顯著升高，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)；36、48 h 10-4mol/L龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖明顯高于10-6、10-8mol/L組(P<0.05)；10-4mol/L龜鹿二仙膏組可顯著促進(jìn)IGF-1 mRNA的表達(dá)和IGF-1蛋白含量(P<0.05)。結(jié)論高濃度龜鹿二仙膏能夠顯著促進(jìn)hESCs增殖，升高IGF-1 mRNA的表達(dá)和IGF-1蛋白含量。

〔關(guān)鍵詞〕龜鹿二仙膏；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；骨質(zhì)疏松；胰島素樣生長因子1

雌激素的降低是骨質(zhì)疏松(OP)發(fā)生的最主要原因〔1〕。龜鹿二仙膏是古代著名的抗衰老膏方，由鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參四味組成，具有生精、益氣、養(yǎng)血的功效，古醫(yī)籍中多見有運(yùn)用該方調(diào)理女性健康。龜鹿二仙膏對(duì)改善女性血液循環(huán)，提高性激素含量，均有顯著療效〔2，3〕。前期臨床調(diào)查顯示，龜鹿二仙膏對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征患者治愈率高達(dá)93.75%〔4〕，OP明顯改善。子宮內(nèi)膜是一個(gè)由激素調(diào)節(jié)經(jīng)歷動(dòng)態(tài)改變的組織，在性激素的作用下內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生周期性的變化。本次研究通過體外培養(yǎng)hESCs，觀察不同濃度龜鹿二仙膏對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)骨質(zhì)疏松骨重建過程中發(fā)揮重要作用的胰島素樣生長因子(IGF)-1〔5〕基因和蛋白表達(dá)的影響，探討龜鹿二仙膏對(duì)改善圍絕經(jīng)期女性O(shè)P的作用與機(jī)制。

1資料與方法

1.1材料來源選取2014年5～11月遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科因婦科良性疾病行腹腔鏡檢查患者15例，年齡25～45歲，術(shù)后病理顯示為正常增生期子宮內(nèi)膜，術(shù)前3個(gè)月未應(yīng)用過激素類藥物，刮宮獲取足夠數(shù)量的子宮內(nèi)膜，轉(zhuǎn)移至4℃保存的裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的小瓶中，將小瓶置于低溫保溫桶30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，所取標(biāo)本均與患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑龜鹿二仙膏(上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院藥局)；DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone)；青鏈霉素混合液(Genview)；膠原酶、人雌二醇E2(Sigma)；兔抗人波形蛋白抗體、鼠抗人角蛋白抗體(Abcam)；兔抗人IGF-1抗體(sc-9013)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(Santa)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Green I(TaKaRa)。

1.2.2組織處理與細(xì)胞培養(yǎng)參照Arnold 法〔6〕，分離并獲取人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESCs)。超凈工作臺(tái)取出內(nèi)膜組織倒入無菌培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3遍。剪至1 mm3左右的碎片，加入2倍體積的0.125%膠原酶，37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化60 min，每5 min取出拍打助消化，細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。懸浮液經(jīng)38 μm不銹鋼濾網(wǎng)過濾，PBS沖洗，將濾液(主要為基質(zhì)細(xì)胞)轉(zhuǎn)入離心管中，1 200 r/min離心15 min，棄上清，10%FBS DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)，以5×105～6×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后換液，細(xì)胞貼壁達(dá)90%以上后1∶3傳代至6孔板。

1.2.3 hESCs的鑒定倒置顯微鏡下觀察6孔板中細(xì)胞爬片，2 d后，貼壁達(dá)75%細(xì)胞免疫組化鑒定細(xì)胞表型。采用兔抗人波形蛋白一抗和鼠抗人角蛋白一抗，二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.2.4不同濃度龜鹿二仙膏的處理第二代hESCs經(jīng)胰酶消化，細(xì)胞貼壁達(dá)75%以上后，接種于6孔板，更換無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)，細(xì)胞同步化24 h后棄培養(yǎng)液，分為對(duì)照組、龜鹿二仙膏組(10-4、10-6、10-8mol/L)、雌二醇(10-4、10-6、10-8mol/L)組。對(duì)照組加入10%FBS DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，龜鹿二仙膏組按照10-4、10-6、10-8mol/L加入對(duì)應(yīng)含龜鹿二仙膏血清培養(yǎng)液200 μl，每組8復(fù)孔，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h。雌二醇組(陽性對(duì)照)與龜鹿二仙膏組設(shè)計(jì)一致，計(jì)算細(xì)胞增殖率=(藥物組/對(duì)照組)×100%。

1.2.5MTT法檢測hESCs增殖率96孔板每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄孵育液每孔加入DMSO 100 μl。雌二醇組作為陽性對(duì)照組，酶標(biāo)儀492 nm測定OD值。

1.2.6Real-time PCR測定IGF-1 mRNA表達(dá)龜鹿二仙膏處理48 h后收集細(xì)胞，RNAiso Plus 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度：A260 nm/A280 nm在1.8～2.2之間。去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)和SYBR Green I相對(duì)定量分析。反轉(zhuǎn)錄按如下條件反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 20 s，60℃ 35 s，32個(gè)循環(huán)。引物序列：IGF-1基因IGF-1基因(上游5’-ATGGGAAAAATCAGCAGTCTTC-3’，下游5’-CTACATCCTGTAGTTCTTGTTT-3’)；β-actin基因(上游5’-GCACAGCCTGGATAGCA-3’，下游5’-CACCAACTGGGACGACAT-3’)。

1.2.7Western印跡測定IGF-1蛋白含量將對(duì)數(shù)生長期的hESCs以2.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，分別在24、36、48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取80 μg蛋白進(jìn)行二烷基硫酸鈉-聚丙烯乙胺凝膠電泳，電泳完畢后以150 V恒壓30 min半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉常溫下?lián)u床封閉2 h，

加入兔抗IGF-1一抗(稀釋比例均為1∶100)，4℃過夜。TBST洗膜3次，15 min/次；二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞免疫組化鑒定波形蛋白特異性地標(biāo)記hESCs，角蛋白特異性標(biāo)記腺上皮細(xì)胞。波形蛋白染色陽性hESCs，形態(tài)多為紡錘形或多角形，波形蛋白染色陽性率達(dá)95%，陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，以核周染色較為明顯，核藍(lán)染。角蛋白染色陽性的細(xì)胞，角蛋白在hESCs染色中呈陰性，波形蛋白陽性染色率達(dá)95%。見圖1。

2.2各組細(xì)胞增殖情況隨著作用時(shí)間增長，龜鹿二仙膏組和雌二醇組細(xì)胞增殖率顯著升高，呈時(shí)間及劑量依賴性(P<0.05)。24 h，10-4、10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組間細(xì)胞增殖率差異不顯著(P>0.05)。36、48 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖明顯高于10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組(P<0.05)。與同濃度雌二醇組比較，24 h龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖率無明顯差異(P>0.05)；36 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖率差異不顯著(P>0.05)，10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖率差異顯著(P<0.05)；48 h，10-4、10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組細(xì)胞增殖率差異不顯著(P>0.05)。見表1。

圖1　hESCs免疫組化染色鑒定結(jié)果(×400)

濃度(mol/L)龜鹿二仙膏組24h36h48h雌二醇組24h36h48h10-871.87±1.1699.87±1.151)2)3)125.54±1.311)3)70.34±1.06120.44±1.123)128.51±1.371)3)10-673.16±1.19101.41±1.711)2)3)135.97±1.331)3)72.87±1.51121.31±1.143)137.47±1.201)3)10-473.77±1.10121.24±2.033)149.65±1.273)75.02±1.15123.07±1.033)150.17±1.163)

與10-4mol/L相比較：1)P<0.05；與同濃度雌二醇組相比較：2)P<0.05；與同組同濃度組前一時(shí)間點(diǎn)相比較：3)P<0.05

2.3龜鹿二仙膏對(duì)IGF-1 mRNA表達(dá)的影響10-6和10-8mol/L龜鹿二仙膏組IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著作用時(shí)間延長有顯著升高(P<0.05)，36 h和48 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組和10-6mol/L雌二醇組IGF-1 mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。24、36、48 h對(duì)照組與同時(shí)間段內(nèi)其余各組間IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照組比較，IGF-1 mRNA的表達(dá)在10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用hESCs 36 h、48 h后最為顯著(P<0.01)，10-6mol/L與雌二醇組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且呈時(shí)間及劑量依賴性。見表2。

2.4龜鹿二仙膏對(duì)IGF-1 蛋白表達(dá)的影響IGF-1蛋白表達(dá)隨著作用時(shí)間延長也呈現(xiàn)上升趨勢。24 h與對(duì)照組比較，各組均有顯著差異(P<0.05)，36 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組和10-6mol/L雌二醇組IGF-1蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；10-4mol/L龜鹿二仙膏組和10-6mol/L雌二醇組IGF-1 蛋白表達(dá)量顯著高于10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組(P<0.05)。48 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組和10-6mol/L雌二醇組IGF-1 蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；10-4mol/L龜鹿二仙膏組和10-6mol/L雌二醇組IGF-1 蛋白表達(dá)量顯著高于10-6、10-8mol/L龜鹿二仙膏組(P<0.01)。見圖2、表3。

表2　不同時(shí)間點(diǎn)各組hESCs IGF-1 mRNA表達(dá)變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與10-4mol/L龜鹿二仙膏組比較：3)P<0.01，下表同

1：對(duì)照組；2：10-8 mol/L龜鹿二仙膏組；3：10-6 mol/L龜鹿二仙膏組；4：10-4 mol/L龜鹿二仙膏組；5：10-6 mol/L雌二醇組圖2　不同時(shí)間點(diǎn)各組hESCk IGF-1蛋白表達(dá)

組別劑量(mol/L)IGF-1/β-actin相對(duì)表達(dá)量24h36h48h對(duì)照組-1.54±0.131.62±0.081.59±0.21雌二醇組10-62.35±0.151)3.94±0.162)4.28±0.272)龜鹿二仙膏組10-42.31±0.061)3.85±0.182)4.19±0.092)10-62.27±0.071)2.98±0.271)3)3.13±0.141)3)10-81.98±0.171)2.21±0.211)3)2.95±0.181)3)

3討論

骨成熟后，骨組織不斷經(jīng)歷破骨細(xì)胞對(duì)舊骨吸收和伴隨其后成骨細(xì)胞形成新骨的動(dòng)態(tài)平穩(wěn)過程，圍絕經(jīng)期女性雌激素減少促使骨吸收超過骨形成，出現(xiàn)骨丟失，發(fā)生OP〔7〕。龜鹿二仙膏是古代著名的補(bǔ)肝腎、抗衰老膏方，首見于《醫(yī)方考·虛損勞瘵門》，因符合女性生理和病理特點(diǎn)，為許多中醫(yī)婦科專家臨床用于女性健康調(diào)理。實(shí)驗(yàn)表明其能明顯增加未成年小鼠、大鼠包皮腺、精液囊和前列腺重量，防治腎陽虛小鼠附性器官萎縮；提高性激素含量有顯著效果〔8〕。

子宮內(nèi)膜在性激素的作用下發(fā)生周期性變化，雌激素能促進(jìn)子宮內(nèi)膜和間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂，引起子宮內(nèi)膜基底層和腺體、間質(zhì)、血管增生、增厚〔9〕。有研究指出雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，而基質(zhì)細(xì)胞在上皮細(xì)胞的生長發(fā)育和功能方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用〔10〕。Arnold等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)上皮組織形成，并調(diào)控其分化。本研究結(jié)果顯示：龜鹿二仙膏組hESCs增殖率隨作用時(shí)間增長顯著升高。

目前研究發(fā)現(xiàn)雌激素與IGF-1水平呈正相關(guān)。舒強(qiáng)等〔11〕發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP組患者血清中IGF-1 水平低于絕經(jīng)前正常婦女組及絕經(jīng)后非OP組，受試者的血清IGF-1 水平與骨密度(BMD)、雌二醇呈顯著正相關(guān)。Kassem等〔12〕發(fā)現(xiàn)17-雌二醇以時(shí)間和劑量相關(guān)的方式增加IGF-1 mRNA水平，認(rèn)為IGF-1基因是雌激素作用的靶基因，提示IGF-1介導(dǎo)了雌激素對(duì)人骨的部分作用。Posaci等〔13〕發(fā)現(xiàn)雌二醇可通過成骨細(xì)胞上的雌激素受體在轉(zhuǎn)錄水平提高IGF-1的合成，而且應(yīng)用雌激素替代治療也可顯著增加血清IGF-1水平。Reed等〔14〕發(fā)現(xiàn)原發(fā)性O(shè)P患者血漿IGF-1水平與成骨細(xì)胞活性指標(biāo)密切相關(guān)，體外培養(yǎng)中IGF-1可呈劑量依賴性刺激OB前體的增殖及向OB的分化、促進(jìn)堿性磷酸酶、骨鈣素等成骨標(biāo)志物的表達(dá)。國外已有醫(yī)生開始將IGF-1用于試驗(yàn)性治療OP，給18名健康絕經(jīng)婦女服用不同劑量rhIGF-1共6 d，發(fā)現(xiàn)血清中Ⅰ型膠原羧端前肽每日上升14%，尿膠原交聯(lián)排出率上升9%，骨轉(zhuǎn)化加速，骨形成增加更顯著。本研究結(jié)果顯示：36、48 h，10-4mol/L龜鹿二仙膏組IGF-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平與雌二醇組比較無明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膏對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞有顯著增殖作用，其調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞增殖機(jī)制可能與間接調(diào)節(jié)卵巢相關(guān)激素水平相關(guān)。對(duì)OP骨重建過程中發(fā)揮重要作用的IGF-1基因在龜鹿二仙膏作用下，水平有顯著變化，提示龜鹿二仙膏改善圍絕經(jīng)期女性O(shè)P的機(jī)制可能與調(diào)控IGF-1的表達(dá)相關(guān)。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳科技攻關(guān)層次計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012225018)

通訊作者：吳兆利(1965-)，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對(duì)臟腑調(diào)控作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。

〔中圖分類號(hào)〕R274

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2847-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.009

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院

第一作者：尚冰(1974-)，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)藥對(duì)臟腑調(diào)控作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。