雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)注射β-淀粉樣蛋白后樹(shù)突棘和發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白表達(dá)的影響

聶　菁　周　明　魯純糾　呂　誠(chéng)

(南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江西　南昌　330006)

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雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)注射β-淀粉樣蛋白后樹(shù)突棘和發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白表達(dá)的影響

聶菁周明魯純糾呂誠(chéng)

(南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江西南昌330006)

〔摘要〕目的探討雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)后樹(shù)突棘和發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白(drebrin)表達(dá)的影響。方法30只SD雄性大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、Aβ組、用藥組(每組10只)。Aβ組大鼠雙側(cè)大腦皮質(zhì)各一次性注射凝聚態(tài)Aβ1～40，對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)注射等量生理鹽水，用藥組大鼠在大腦皮質(zhì)注射Aβ1～40后每日腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇(0.4 mg/kg)，共30 d。Golgi染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘的密度和drebrin的表達(dá)。結(jié)果Golgi染色顯示，Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，用藥組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度明顯高于Aβ組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示，Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒平均光密度較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)；用藥組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒平均光密度較Aβ組明顯增加(P<0.01)。結(jié)論雷公藤內(nèi)酯醇能抑制Aβ所致drebrin的丟失，減輕Aβ所致樹(shù)突棘的損傷。

〔關(guān)鍵詞〕雷公藤內(nèi)酯醇；β-淀粉樣蛋白；發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白；樹(shù)突棘

β-淀粉樣蛋白(Aβ)是阿爾茨海默病(AD)的主要神經(jīng)病理特征老年斑的核心成分〔1〕。研究表明，Aβ在腦內(nèi)的沉積可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌、釋放多種免疫炎性產(chǎn)物，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、死亡〔1〕，并使突觸的結(jié)構(gòu)和功能受損〔2〕。因此，抑制AD腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)有可能成為治療AD的潛在途徑。雷公藤內(nèi)酯醇具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制作用，且能透過(guò)血腦屏障〔3〕。近年來(lái)的研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇可以改善AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用〔4〕。我們的前期工作表明，雷公藤內(nèi)酯醇能緩解Aβ誘導(dǎo)的樹(shù)突棘退化〔5〕，但其作用機(jī)制尚不清楚。

樹(shù)突棘的主要細(xì)胞骨架成分是肌動(dòng)蛋白，樹(shù)突棘形態(tài)的改變是通過(guò)樹(shù)突棘內(nèi)肌動(dòng)蛋白的重排而實(shí)現(xiàn)的〔6〕。發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白(drebrin)作為一種神經(jīng)元特異性的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可通過(guò)改變細(xì)胞骨架的理化性質(zhì)影響樹(shù)突棘及突觸的形態(tài)和功能，在樹(shù)突棘肌動(dòng)蛋白的重排中起著重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕。本實(shí)驗(yàn)擬觀察雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)注射Aβ后樹(shù)突棘和drebrin表達(dá)的影響，從樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)重塑的角度探討雷公藤內(nèi)酯醇治療AD的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器Aβ1～40(sigma公司)，雷公藤內(nèi)酯醇(純度為99.8%，批號(hào)070929，福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，溶于4%丙二醇溶液中，經(jīng)200目過(guò)濾器濾過(guò)除菌后備用)。小鼠抗drebrin單克隆抗體(abcam公司)，SP免疫組化試劑盒(Zymed公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)，硝酸銀(上海申博化工有限公司)，重鉻酸鉀(汕頭市西隴化工廠)，5%火棉膠(天津化學(xué)試劑有限公司)，Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)，江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠)，電腦快速恒溫冷凍切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組30只體重250～275 g的SD雄性大鼠(南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)隨機(jī)等分成對(duì)照組、Aβ組、用藥組，每組10只。用無(wú)菌生理鹽水將Aβ1～40稀釋成5 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ1～40。Aβ組和用藥組動(dòng)物麻醉后固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上，參照包新民等的《大鼠腦立體定位圖譜》用微量注射器向雙側(cè)大腦皮質(zhì)(定位坐標(biāo)為前囟后3.0 mm，雙側(cè)旁開(kāi)2.0 mm，硬腦膜下1.5 mm)緩慢注入凝聚態(tài)Aβ1～402 μl，留針10 min，以使Aβ充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口。對(duì)照組注入等容積生理鹽水，其余操作步驟同上。用藥組每日腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg，共30 d。對(duì)照組和Aβ組腹腔注射等容積的4%丙二醇溶液。

1.3Golgi染色藥物干預(yù)結(jié)束后，每組各取5只動(dòng)物經(jīng)升主動(dòng)脈插管，生理鹽水沖洗后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)300 ml灌注固定，取腦置于上述灌注液中后固定1 w，修整組織塊；將修整好的組織塊投入5%火棉膠中進(jìn)行表面包被處理；將包被好的組織塊投入3%重鉻酸鉀溶液中，37℃浸泡，24 h換液1次，然后繼續(xù)浸泡2 d；將鉻化后的組織塊投入1.5%硝酸銀溶液37℃避光浸染3 d。銀染完成后，將組織塊連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚60 μm，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。每只動(dòng)物取3張切片，每張切片隨機(jī)選擇注射區(qū)附近3個(gè)胞突顯示較完整的錐體細(xì)胞，在1 000倍油鏡下觀察樹(shù)突棘，從胞體發(fā)出的樹(shù)突第1次分支開(kāi)始，計(jì)算60 μm長(zhǎng)度范圍內(nèi)樹(shù)突棘的個(gè)數(shù)，以每10 μm長(zhǎng)度的樹(shù)突棘個(gè)數(shù)反映其密度。

1.4組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)染色藥物干預(yù)結(jié)束后，每組各取5只動(dòng)物經(jīng)左心室灌注固定，取腦，在注射區(qū)附近連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚25 μm，相鄰切片分二套，分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)尼氏染色和drebrin免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色采用SP法：3% H2O2，室溫10 min；10%正常山羊血清，室溫15 min；小鼠抗drebrin單克隆抗體(1∶100)，4℃過(guò)夜；生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶100)，室溫30 min；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(1∶100)，室溫30 min；DAB顯色。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，重復(fù)上述步驟。每只動(dòng)物取3張切片，每張切片在注射區(qū)附近隨機(jī)取互不重疊的3個(gè)視野，在顯微鏡下采用Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)出drebrin免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性產(chǎn)物的平均光密度。

2結(jié)果

2.1甲苯胺藍(lán)尼氏染色結(jié)果對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)未見(jiàn)明顯神經(jīng)元損傷；Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)注射點(diǎn)附近局部神經(jīng)元丟失，并可見(jiàn)大量核小深染、胞質(zhì)不著色的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)；用藥組大鼠大腦皮質(zhì)注射點(diǎn)附近神經(jīng)元損傷程度減輕，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1　各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)觀察(甲苯胺藍(lán)尼氏染色，×100)

2.2Golgi染色結(jié)果對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)量多而密集，Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，用藥組明顯高于Aβ組(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

表1　大鼠大腦皮質(zhì)Golgi染色和drebrin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

與對(duì)照組相比：1)P<0.01；與Aβ組相比：2)P<0.05，3)P<0.01

圖2　各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘(Golgi染色，×1 000)

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表1、圖3可見(jiàn)，drebrin免疫反

圖3　各組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒(免疫組織化學(xué)染色，×100)

應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀顆粒，位于大腦皮質(zhì)神經(jīng)氈區(qū)。對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒染色較深；Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒染色較淺，與對(duì)照組相比，Aβ組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒平均光密度明顯減少(P<0.01)；與Aβ組相比，用藥組大鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒平均光密度明顯增加(P<0.01)。

3討論

作為突觸后結(jié)構(gòu)的樹(shù)突棘，其組分包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、突觸后致密物和神經(jīng)遞質(zhì)受體等，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的原始位點(diǎn)。drebrin是一種與神經(jīng)元生長(zhǎng)和腦發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，主要存在于70%興奮性突觸的樹(shù)突棘內(nèi)，它可與纖維型肌動(dòng)蛋白結(jié)合或解離，影響樹(shù)突棘的形態(tài)，在神經(jīng)元樹(shù)突棘的形成和重塑中發(fā)揮重要作用。在培養(yǎng)的皮層成熟神經(jīng)元過(guò)表達(dá)drebrin時(shí)，神經(jīng)元樹(shù)突棘的長(zhǎng)度明顯增加〔7〕；而抑制drebrin在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)則導(dǎo)致樹(shù)突棘密度減少〔8〕。這些研究表明drebrin 能促進(jìn)樹(shù)突棘的形成，其可能的作用機(jī)制有：① drebrin的氨基末端含有高親和力的肌動(dòng)蛋白結(jié)合域，能競(jìng)爭(zhēng)性地與纖維型肌動(dòng)蛋白結(jié)合，抑制其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(如原肌球蛋白、肌球蛋白等)與肌動(dòng)蛋白的作用，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架網(wǎng)的動(dòng)力學(xué)，減少樹(shù)突棘的回縮；② drebrin的羧基末端含有肌動(dòng)蛋白聚合啟動(dòng)子(profilin)的結(jié)合域，能募集profilin進(jìn)入纖絲引起棘的延長(zhǎng)〔6〕。將Aβ1～40注射入大鼠海馬內(nèi)，可導(dǎo)致海馬和皮質(zhì)樹(shù)突棘密度明顯下降〔9〕；免疫細(xì)胞化學(xué)、ELISA和Western印跡檢測(cè)顯示，原代培養(yǎng)的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠神經(jīng)元內(nèi)Aβ積聚的同時(shí)，drebrin表達(dá)下降〔10〕；免疫電鏡結(jié)果顯示，2xKI轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠大腦皮質(zhì)drebrin免疫反應(yīng)陽(yáng)性樹(shù)突棘的比例明顯減少〔11〕；病理尸檢結(jié)果顯示AD患者腦組織樹(shù)突棘數(shù)量和drebrin水平明顯下降〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述學(xué)者的研究結(jié)果一致。結(jié)合前述文獻(xiàn)，我們認(rèn)為Aβ所致的drebrin表達(dá)減少可能是樹(shù)突棘密度下降的原因之一。Aβ對(duì)drebrin影響的機(jī)制目前尚不清楚。已有研究表明，大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射細(xì)菌脂多糖引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)可減少腦組織內(nèi)drebrin蛋白的水平〔13〕；原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放的免疫炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致培養(yǎng)的神經(jīng)元drebrin表達(dá)下降〔14〕。因此，Aβ所致的drebrin表達(dá)減少可能與腦內(nèi)免疫炎癥有關(guān)。

近年來(lái)的研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。Wang 等〔4〕發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇能改善5XFAD 轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少Aβ在5XFAD 轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)的產(chǎn)生和積聚。我們的前期工作表明，雷公藤內(nèi)酯醇能緩解Aβ誘導(dǎo)的樹(shù)突棘退化〔5〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，與Aβ組相比，雷公藤內(nèi)酯醇有可能通過(guò)抑制Aβ誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)drebrin的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)樹(shù)突棘起保護(hù)作用。

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〔2015-10-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30660073)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20132BAB205085)；江西省教育廳科研基金項(xiàng)目(No.GJJ12078)

通訊作者：呂誠(chéng)(1968-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年性疾病的基礎(chǔ)研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R749.1+6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2831-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.002

Effects of triptolide on dendritic spines and the expression of drebrin after microinjection of beta-amyloid protein into cerebral cortex in rats

NIE Jing，ZHOU Ming，LU Chun-Jiu，et al.

Department of Anatomy,Jiangxi Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of triptolide on dendritic spines and the expression of drebrin after microinjection of beta-amyloid protein(Aβ) into cerebral cortex in rats.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control,Aβ and triptolide-treated groups(n=10).The Aβ group was given an bilateral injection of aggregated Aβ1～40in cerebral cortex in rats.The control group was given an injection of sterile saline in cerebral cortex.The triptolide-treated group was administered intraperitoneally triptolide(0.4 mg/kg)once daily for 30 days after Aβ1～40injection.Spine density of cerebral cortical neurons was assayed by Golgi staining and drebrin expression of cerebral cortical neurons was assayed by immunohistochemical staining.ResultsThe spine density of cerebral cortical neurons in Aβ group was obviously decreased compared with that of control group(P<0.01)；spine density of cerebral cortical neurons in triptolide-treated group was obviously increased compared with that of Aβ group(P<0.05).The average optical density of drebrin immunoreactive product in cerebral cortex of Aβ group was obviously decreased compared with that of control group(P<0.01)；the average optical density of drebrin immunoreactive product in cerebral cortex of triptolide-treated group was obviously increased compared with that of Aβ group(P<0.01).ConclusionsTriptolide could inhibit the loss of drebrin induced by Aβand alleviate the degeneration of dendritic spines induced by Aβ.

【Key words】Triptolide;Beta-amyloid protein;Drebrin;Dendritic spines

第一作者：聶菁(1982-)，女，碩士，主要從事老年性疾病的基礎(chǔ)研究。