闞伯紅 高 青 胡先同 王一婧 趙 嵐 范英昌
(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所 天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300381)
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·基礎(chǔ)研究·
心復(fù)康含藥血清對心臟干細(xì)胞中縫隙連接蛋白43水平的影響
闞伯紅高青1胡先同1王一婧1趙嵐范英昌1
(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300381)
〔摘要〕目的探討心復(fù)康含藥血清對心臟干細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。方法采用細(xì)胞免疫熒光方法對傳代后心臟干細(xì)胞進(jìn)行檢測,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡分別檢測心臟干細(xì)胞中縫隙連接蛋白(Cx43)mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果5%心復(fù)康含藥血清培養(yǎng)72 h后,心臟干細(xì)胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)論心復(fù)康含藥血清具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞分化的作用,有利于闡明心復(fù)康治療心肌梗死的作用機(jī)制。
〔關(guān)鍵詞〕心臟干細(xì)胞;心復(fù)康
急性心肌梗死(AMI)多數(shù)臨床支持療法著重于調(diào)節(jié)血流動力學(xué)、減低早期死亡率,但不利于心臟的修復(fù)和減少心力衰竭的發(fā)生。修復(fù)梗死心肌的最終目標(biāo)是再生健康的、有功能的、可以和周圍心肌細(xì)胞相整合的心肌組織,被普遍接受的治療方法是通過增加組織再生促進(jìn)愈合和抑制病理重塑〔1〕。心肌干細(xì)胞(CSCs)具有定向分化為心臟細(xì)胞的趨勢,在AMI及缺血性心肌病的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。促進(jìn)CSCs的增殖和分化對于心肌細(xì)胞再生的臨床治療是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。本文通過檢測心復(fù)康含藥血清對CSCs中縫隙連接蛋白(Cx)43轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響,闡明心復(fù)康對心肌分化的干預(yù)作用。
1材料與方法
1.1材料18s RNA(76 bp)上游引物:5′-CGAGCCGCCTGGATACC-3′,下游引物:5′-CCTCAGTTCCGAAAACCAACAA-3′;Cx43 NM_010288.3(101 bp)上游引物:5′-GATCGCGTGAAGGGAAGAAG-3′,下游引物:5′-CAGCCATTGAAGTAAGCATATT-TTG-3′。親和素結(jié)合的兔抗大鼠/小鼠c-kit 抗體購自美國BD公司(1∶1 000);兔抗大鼠/小鼠Cx43購自英國Santa公司(1∶1 000);兔抗大鼠/小鼠/人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自武漢博士德公司(1∶300);異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗親和素IgG購自Ligend(1∶1 000),DMEM/DF12 培養(yǎng)液和胎牛血清(FCS)(澳洲源血清)購自GIBCO,重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自美國invitrogen,F(xiàn)asline Cell cDNA Kit(TIANGEN:KR105),q-PCR 試劑盒(CW0662)和UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore,化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)試劑盒購自索萊寶,熒光顯微鏡(Leca DM3000,德國),實(shí)時(shí)熒光PCR 系統(tǒng)(RochLightCycle 480,瑞士),生物分光光度計(jì)(EppendoBioPhotometer,德國),SIGMA 3-18K 臺式低溫高速離心機(jī)(SIGMA,德國),Q/TLY001 型電泳裝置(北京市六一儀器廠,中國),濕性轉(zhuǎn)膜儀(GE,美國),凝膠成像系統(tǒng)(Biorad,美國)。
1.2方法
1.2.1含藥血清的制備參見文獻(xiàn)〔2〕。
1.2.2CSCs的培養(yǎng)C57 小鼠CSCs由美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈。培養(yǎng)基成分〔3〕:DMEM/F12,10%澳洲源FCS,2 mmol/L 谷氨酰胺,0.1 mmol/L β巰基乙醇,1%非必需氨基酸,5 ng/ml bFGF。培養(yǎng)條件:37℃,5% CO2培養(yǎng)箱,隔天換液并傳代。
1.2.3CSCs的免疫熒光鑒定CSCs消化分散后,接種于放好蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次洗10 min;換4%多聚甲醛固定15 min;再以PBS 洗3次,每次洗10 min;以鑷子取出蓋玻片貼于載玻片上;以封閉血清室溫封閉1 h;PBS 洗3 次,每次洗10 min;以c-kit 一抗室溫孵育2 h;PBS 洗3次,每次10 min;FITC 標(biāo)記的二抗避光孵育1 h;PBS 洗3 次,每次洗10 min;二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液室溫孵育5~10 min;PBS 洗3 次,每次洗10 min;滴加抗熒光淬滅封片液后封片;熒光顯微鏡下觀察并采集圖像;以PBS代替一抗,作為陰性對照。
1.2.4實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)分為空白血清組和含藥血清組。細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)/ml,CSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h,空白血清組在原培養(yǎng)液中加入5%兔空白血清,含藥血清組在原培養(yǎng)液中加入5%含藥血清,37℃,5% CO2培養(yǎng)72 h。
1.2.5熒光定量PCR檢測Cx43 mRNA的表達(dá)量細(xì)胞cDNA快速制備參見試劑說明書,PCR 反應(yīng)體系〔2×UltraSYBR Mixture(with ROX) 10 μl,10 μmol/L上、下游引物各1 μl,cDNA模板1 μl,RNase-Free水7 μl〕,PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃,10 min,1個(gè)循環(huán);延伸95℃、15 s,60℃、1 min,45個(gè)循環(huán);溶解曲線分析95℃、15 s,60℃、1 min,97℃延伸,1個(gè)循環(huán);cooling 40℃、30 s,1個(gè)循環(huán)。
1.2.6Western印跡法測定Cx43蛋白的表達(dá)量所提細(xì)胞總蛋白以二喹啉甲酸(BCA)法按試劑說明書測蛋白濃度,加入5倍上樣緩沖液。100℃變性5 min,瞬時(shí)離心。10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳。濕轉(zhuǎn)250 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜2 h。將膜蛋白面朝上,按試劑說明書加入兔抗小鼠多克隆抗體Cx43(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶300稀釋)各2 ml,密封于袋中,4℃過夜;室溫平衡30 min,去除一抗,用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜,5 min×3次;蛋白面朝上,按試劑說明書加入1∶4 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體各2 ml,密封于保鮮袋中,37℃震蕩1 h;去除二抗,用TBST洗PVDF膜,5 min×3次。按照試劑說明書配制發(fā)光液,與膜作用1 min,在凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,并對所得條帶進(jìn)行分析。
2結(jié)果
2.1CSCs免疫熒光鑒定結(jié)果以c-kit為一抗對CSCs進(jìn)行標(biāo)記,DAPI染核,發(fā)現(xiàn)雖經(jīng)數(shù)次傳代,但幾乎所有細(xì)胞均具有c-kit表達(dá),表明所培養(yǎng)細(xì)胞基因穩(wěn)定,該培養(yǎng)條件適合CSCs培養(yǎng),且能保持其干細(xì)胞潛能不變。見圖1。
2.2心復(fù)康含藥血清對CSCs中Cx43水平的影響經(jīng)5%心復(fù)康含藥血清培養(yǎng)72 h,心臟干細(xì)胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯提高(P<0.05),見表1,圖2。
A.綠色熒光為c-kit陽性細(xì)胞;B.DAPI染核的藍(lán)色熒光與c-kit陽性細(xì)胞的綠色熒光的疊加圖1 心臟干細(xì)胞免疫熒光鑒定(×200)
組別Cx43mRNACx43蛋白空白血清組(3.19E-06)±(7.04E-07)2.04±0.04含藥血清組(1.15E-05)±(3.56E-06)1)5.16±0.171)
與空白血清組比較:1)P<0.05
圖2 心復(fù)康含藥血清對心臟干細(xì)胞中CX43蛋白表達(dá)的影響
3討論
Cx43作為心肌閏盤結(jié)構(gòu)中縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在細(xì)胞膜聚合形成的縫隙連接構(gòu)成介導(dǎo)細(xì)胞離子、小分子和信號分子等的跨膜交流的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對于心肌細(xì)胞的發(fā)育、分化和收縮功能均有著重要作用,是心肌細(xì)胞分化的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)心復(fù)康含藥血清可明顯提高CSCs中Cx43的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞分化的作用。
c-kit陽性的CSCs 首先在大鼠心臟被鑒定,c-kit陽性是CSCs 最普遍特征,且這些細(xì)胞不表達(dá)骨髓細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子或膜和胞質(zhì)蛋白,因此CSCs 不屬于譜系細(xì)胞〔4〕。Lin(-)c-kit陽性 CSCs 具有干細(xì)胞的三大特性——能夠自我修復(fù)、克隆性和多潛能,可以向心肌、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。在缺血心肌中,這些細(xì)胞和他們的克隆后代分化成的心肌細(xì)胞和形成的血管可重組為具有年輕細(xì)胞特征的心肌,大約構(gòu)成70%的心室組織。但當(dāng)心肌大面積梗死時(shí),相對有限的內(nèi)源性CSCs很難及時(shí)修復(fù)受損心肌,因此,通過干預(yù)措施促進(jìn)CSCs的增殖和分化變得至關(guān)重要。
CSCs的增殖分化受多種因素調(diào)節(jié),諸如旁分泌或自分泌、生長因子和藥物等。藥物相對于其他方法更加簡便、安全和有效。中藥在CSCs分化中發(fā)揮重要作用,研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以促進(jìn)小鼠CSCs分化為心肌樣細(xì)胞〔5〕。心復(fù)康具有益氣活血的作用,能夠明顯改善AMI患者的臨床癥狀〔6〕。體外研究表明心復(fù)康可有效增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗缺氧性損傷的能力〔7〕。西洋參為心復(fù)康的君藥,具有補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效,可減輕大鼠AMI后心室重構(gòu)〔8〕。人參皂甙是西洋參中主要的有效成分,也是生理活性最顯著的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷RG1能夠明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞的增殖〔9〕,增加環(huán)境依賴的骨髓干細(xì)胞在體外分化為內(nèi)皮分化〔10〕。因此,心復(fù)康可能通過代謝后的單體成分發(fā)揮促CSCs分化的作用,其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
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〔2015-06-17修回〕
(編輯袁左鳴)
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173413);天津市高等學(xué)校發(fā)展基金項(xiàng)目(No.20120211);天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研專項(xiàng)課題(No.13079)
通訊作者:范英昌(1951-),男,碩士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病研究。
〔中圖分類號〕R542.2+2
〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A
〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2829-03;
doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.001
1天津中醫(yī)藥大學(xué)
第一作者:闞伯紅(1978-),女,博士,副主任醫(yī)師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年性相關(guān)疾病研究。