心復(fù)康含藥血清對(duì)心臟干細(xì)胞中縫隙連接蛋白43水平的影響

闞伯紅　高　青　胡先同　王一婧　趙　嵐　范英昌

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所　天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300381)

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·基礎(chǔ)研究·

心復(fù)康含藥血清對(duì)心臟干細(xì)胞中縫隙連接蛋白43水平的影響

闞伯紅高青1胡先同1王一婧1趙嵐范英昌1

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300381)

〔摘要〕目的探討心復(fù)康含藥血清對(duì)心臟干細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。方法采用細(xì)胞免疫熒光方法對(duì)傳代后心臟干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡分別檢測(cè)心臟干細(xì)胞中縫隙連接蛋白(Cx43)mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果5%心復(fù)康含藥血清培養(yǎng)72 h后，心臟干細(xì)胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)論心復(fù)康含藥血清具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞分化的作用，有利于闡明心復(fù)康治療心肌梗死的作用機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕心臟干細(xì)胞；心復(fù)康

急性心肌梗死(AMI)多數(shù)臨床支持療法著重于調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)、減低早期死亡率，但不利于心臟的修復(fù)和減少心力衰竭的發(fā)生。修復(fù)梗死心肌的最終目標(biāo)是再生健康的、有功能的、可以和周?chē)募〖?xì)胞相整合的心肌組織，被普遍接受的治療方法是通過(guò)增加組織再生促進(jìn)愈合和抑制病理重塑〔1〕。心肌干細(xì)胞(CSCs)具有定向分化為心臟細(xì)胞的趨勢(shì)，在AMI及缺血性心肌病的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。促進(jìn)CSCs的增殖和分化對(duì)于心肌細(xì)胞再生的臨床治療是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。本文通過(guò)檢測(cè)心復(fù)康含藥血清對(duì)CSCs中縫隙連接蛋白(Cx)43轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響，闡明心復(fù)康對(duì)心肌分化的干預(yù)作用。

1材料與方法

1.1材料18s RNA(76 bp)上游引物：5′-CGAGCCGCCTGGATACC-3′，下游引物：5′-CCTCAGTTCCGAAAACCAACAA-3′；Cx43 NM_010288.3(101 bp)上游引物：5′-GATCGCGTGAAGGGAAGAAG-3′，下游引物：5′-CAGCCATTGAAGTAAGCATATT-TTG-3′。親和素結(jié)合的兔抗大鼠/小鼠c-kit 抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠Cx43購(gòu)自英國(guó)Santa公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠/人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購(gòu)自武漢博士德公司(1∶300)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗親和素IgG購(gòu)自Ligend(1∶1 000)，DMEM/DF12 培養(yǎng)液和胎牛血清(FCS)(澳洲源血清)購(gòu)自GIBCO，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自美國(guó)invitrogen，F(xiàn)asline Cell cDNA Kit(TIANGEN：KR105)，q-PCR 試劑盒(CW0662)和UltraSYBR Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)試劑盒購(gòu)自索萊寶，熒光顯微鏡(Leca DM3000，德國(guó))，實(shí)時(shí)熒光PCR 系統(tǒng)(RochLightCycle 480，瑞士)，生物分光光度計(jì)(EppendoBioPhotometer，德國(guó))，SIGMA 3-18K 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(SIGMA，德國(guó))，Q/TLY001 型電泳裝置(北京市六一儀器廠，中國(guó))，濕性轉(zhuǎn)膜儀(GE，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Biorad，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)〔2〕。

1.2.2CSCs的培養(yǎng)C57 小鼠CSCs由美國(guó)西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈(zèng)。培養(yǎng)基成分〔3〕：DMEM/F12，10%澳洲源FCS，2 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β巰基乙醇，1%非必需氨基酸，5 ng/ml bFGF。培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，隔天換液并傳代。

1.2.3CSCs的免疫熒光鑒定CSCs消化分散后，接種于放好蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次洗10 min；換4%多聚甲醛固定15 min；再以PBS 洗3次，每次洗10 min；以鑷子取出蓋玻片貼于載玻片上；以封閉血清室溫封閉1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；以c-kit 一抗室溫孵育2 h；PBS 洗3次，每次10 min；FITC 標(biāo)記的二抗避光孵育1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液室溫孵育5～10 min；PBS 洗3 次，每次洗10 min；滴加抗熒光淬滅封片液后封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像；以PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)分為空白血清組和含藥血清組。細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)/ml，CSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，空白血清組在原培養(yǎng)液中加入5%兔空白血清，含藥血清組在原培養(yǎng)液中加入5%含藥血清，37℃，5% CO2培養(yǎng)72 h。

1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)量細(xì)胞cDNA快速制備參見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū)，PCR 反應(yīng)體系〔2×UltraSYBR Mixture(with ROX) 10 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，RNase-Free水7 μl〕，PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃，10 min，1個(gè)循環(huán)；延伸95℃、15 s，60℃、1 min，45個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析95℃、15 s，60℃、1 min，97℃延伸，1個(gè)循環(huán)；cooling 40℃、30 s，1個(gè)循環(huán)。

1.2.6Western印跡法測(cè)定Cx43蛋白的表達(dá)量所提細(xì)胞總蛋白以二喹啉甲酸(BCA)法按試劑說(shuō)明書(shū)測(cè)蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液。100℃變性5 min，瞬時(shí)離心。10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳。濕轉(zhuǎn)250 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜2 h。將膜蛋白面朝上，按試劑說(shuō)明書(shū)加入兔抗小鼠多克隆抗體Cx43(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶300稀釋)各2 ml，密封于袋中，4℃過(guò)夜；室溫平衡30 min，去除一抗，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，5 min×3次；蛋白面朝上，按試劑說(shuō)明書(shū)加入1∶4 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體各2 ml，密封于保鮮袋中，37℃震蕩1 h；去除二抗，用TBST洗PVDF膜，5 min×3次。按照試劑說(shuō)明書(shū)配制發(fā)光液，與膜作用1 min，在凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并對(duì)所得條帶進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1CSCs免疫熒光鑒定結(jié)果以c-kit為一抗對(duì)CSCs進(jìn)行標(biāo)記，DAPI染核，發(fā)現(xiàn)雖經(jīng)數(shù)次傳代，但幾乎所有細(xì)胞均具有c-kit表達(dá)，表明所培養(yǎng)細(xì)胞基因穩(wěn)定，該培養(yǎng)條件適合CSCs培養(yǎng)，且能保持其干細(xì)胞潛能不變。見(jiàn)圖1。

2.2心復(fù)康含藥血清對(duì)CSCs中Cx43水平的影響經(jīng)5%心復(fù)康含藥血清培養(yǎng)72 h，心臟干細(xì)胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

A.綠色熒光為c-kit陽(yáng)性細(xì)胞；B.DAPI染核的藍(lán)色熒光與c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的綠色熒光的疊加圖1　心臟干細(xì)胞免疫熒光鑒定(×200)

組別Cx43mRNACx43蛋白空白血清組(3.19E-06)±(7.04E-07)2.04±0.04含藥血清組(1.15E-05)±(3.56E-06)1)5.16±0.171)

與空白血清組比較:1)P<0.05

圖2　心復(fù)康含藥血清對(duì)心臟干細(xì)胞中CX43蛋白表達(dá)的影響

3討論

Cx43作為心肌閏盤(pán)結(jié)構(gòu)中縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞膜聚合形成的縫隙連接構(gòu)成介導(dǎo)細(xì)胞離子、小分子和信號(hào)分子等的跨膜交流的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)于心肌細(xì)胞的發(fā)育、分化和收縮功能均有著重要作用，是心肌細(xì)胞分化的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)心復(fù)康含藥血清可明顯提高CSCs中Cx43的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞分化的作用。

c-kit陽(yáng)性的CSCs 首先在大鼠心臟被鑒定，c-kit陽(yáng)性是CSCs 最普遍特征，且這些細(xì)胞不表達(dá)骨髓細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子或膜和胞質(zhì)蛋白，因此CSCs 不屬于譜系細(xì)胞〔4〕。Lin(-)c-kit陽(yáng)性 CSCs 具有干細(xì)胞的三大特性——能夠自我修復(fù)、克隆性和多潛能，可以向心肌、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。在缺血心肌中，這些細(xì)胞和他們的克隆后代分化成的心肌細(xì)胞和形成的血管可重組為具有年輕細(xì)胞特征的心肌，大約構(gòu)成70%的心室組織。但當(dāng)心肌大面積梗死時(shí)，相對(duì)有限的內(nèi)源性CSCs很難及時(shí)修復(fù)受損心肌，因此，通過(guò)干預(yù)措施促進(jìn)CSCs的增殖和分化變得至關(guān)重要。

CSCs的增殖分化受多種因素調(diào)節(jié)，諸如旁分泌或自分泌、生長(zhǎng)因子和藥物等。藥物相對(duì)于其他方法更加簡(jiǎn)便、安全和有效。中藥在CSCs分化中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以促進(jìn)小鼠CSCs分化為心肌樣細(xì)胞〔5〕。心復(fù)康具有益氣活血的作用，能夠明顯改善AMI患者的臨床癥狀〔6〕。體外研究表明心復(fù)康可有效增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗缺氧性損傷的能力〔7〕。西洋參為心復(fù)康的君藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效，可減輕大鼠AMI后心室重構(gòu)〔8〕。人參皂甙是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷RG1能夠明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞的增殖〔9〕，增加環(huán)境依賴(lài)的骨髓干細(xì)胞在體外分化為內(nèi)皮分化〔10〕。因此，心復(fù)康可能通過(guò)代謝后的單體成分發(fā)揮促CSCs分化的作用，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173413)；天津市高等學(xué)校發(fā)展基金項(xiàng)目(No.20120211)；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研專(zhuān)項(xiàng)課題(No.13079)

通訊作者：范英昌(1951-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R542.2+2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2829-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.001

1天津中醫(yī)藥大學(xué)

第一作者：闞伯紅(1978-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年性相關(guān)疾病研究。